植物表达载体pCAMBIA2301-del-ros的构建及其在草莓上的验证

为了研究多基因互作,减少多次转化的不确定性,本研究在花青素合成调节基因del(delila)和ros(rosea1)的上下游分别引入CaMV 35S启动子和nos终止子,以pBI121-del和pCAMBIA1301-ros做中间载体,并利用BamHⅠ和BglⅡ产生相同4碱基末端的片段,在连接酶的作用下将CaMV 35S启动子分别驱动的del和ros基因构建在同一个植物表达载体pCAMBIA2301上,利用所构建的载体pCAMBIA2301-delros通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404介导的方法转化草莓(Fragaria ananassa Duch.),并进行PCR检测,获得转基因草莓。通过组织观察发现,转基因草莓的根和叶的颜色变成红紫色;实时RT-PCR分析表明,在转基因草莓中花青素合成的结构基因花色素合成酶(anthocyanidinsynthase,ANS)、查尔酮异构酶(chalcone-flavanone isomerase,CHI)、查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)、二羟黄酮醇-4-还原酶(dihydroflavonol-4-reductase,DFR)、黄烷酮-3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase,F3H)和类黄酮-3-O-葡糖基转移酶(UDP glucose-flavonoid 3-O-glcosyl-transferase,UFGT)在转基因株系中的表达均上调,这也进一步证实通过该方法构建的植物表达载体pCAMBIA2301-del-ros可以用来转化植物。本研究结果表明,植物表达载体pCAMBIA2301-del-ros成功构建,为多基因植物表达载体的构建提供了一种思路,也为在植物体内同时研究多个基因的互作提供借鉴。     

表达dsRNA的转基因烟草能阻止烟草花叶病毒的侵染*

将烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)的部分运动蛋白基因(AMP)构建成反向重复结构，插入植物表达载体pBin438上，通过三亲交配法导人根癌农杆菌(Agrobactetqum tumefaciens)菌株EHl05后通过农杆菌介导法转化烟草(Nicotiana tabacam)品种云烟87，获得了50株转基因烟草。PCR和Southern blot分析表明目标基因已整合到烟草植株的基因组内。用TMV对转基因烟草进行挑战接种，症状观察和病毒浓度的TAS-ELISA检测表明，转基因烟草对TMV的抗性包括3种类型：免疫型占10％；抗病型占4％；感病型占86％。Northern blot分析表明，目标基因mRNA在不同抗病类型植株中的积累量存在明显差异，目标基因mRNA的积累量与抗病性成负相关。     

埃及伊蚊TMOF同源基因表达载体构建及烟草转化

胰蛋白酶调节抑制因子（Trypsin-modulating oostatic factor, TMOF）可以有效地抑制昆虫中肠胰蛋白酶的活性。本文为了研究埃及伊蚊TMOF同源物基因在转基因植物广谱抗虫中的作用,利用人工合成的Aea-TMOF同源物基因,以改造过的pCAMBIA1301质粒为基本载体,构建了由组成型CaMV35S启动子驱动Aea-TMOF基因的植物表达载体pCAMBIA1301+ Aea-TMOF。然后,采用冻融法转入农杆菌LBA4404菌株,通过叶盘法对烟草进行了遗传转化。经PCR和GUS染色检测,Aea-TMOF同源物基因已整合到烟草基因组中。     

转基因产品中抗除草剂基因的PCR检测

抗除草剂作物占全球转基因作物的75％以上，并且这类作物还有不断增加的趋势。首次建立并优化了对4类转基因作物（大豆（Glycine max）、玉米（Zea mays）、棉花（Gossypium hirsutnm）和油菜（Brassica campestris var.oleifera））的5种外源抗除草剂基因（bar、pat、cp4-epspsI、cp4-epsps2和gox）的PCR检测方法，并在实践中应用。结果表明，本方法灵敏特异、结果准确可靠，可对目前批准的所有抗除草剂转基因产品进行定性检测。     

大白菜抗软腐病基因BrWRKY33植物表达载体的构建

利用农杆菌侵染法获得抗软腐病转BrWRKY33基因大白菜,首先要构建植物表达载体。本实验根据BrWRKY33基因的序列及pROK2表达载体的酶切位点设计引物(FN/RN),获得BrWRKY33基因,然后将该基因连接到克隆载体pGEM-TEasy,重新构建了克隆载体T-WRKY。经测序及酶切验证,选取PCR反应中错配率最低的产物,构建了表达载体pROK2-WRKY,并将该表达载体转入到根癌农杆菌EHA105中,并对其转化子进行了鉴定。结果表明,PCR扩增获得目的基因BrWRKY33全长约1443bp,PCR及酶切结果鉴定表明克隆载体T-WRKY已经重新构建成功。表达载体的PCR及BamHⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定表明有4个重组子表现阳性,表明目的基因已经插入到pROK2表达载体,表达载体构建成功。PCR鉴定表明表达载体pROK2-WRKY已经转入根癌农杆菌EHA105中。本实验结果将为进一步研究大白菜抗软腐病基因的转化奠定基础。     

转肌醇甲基转移酶基因烟草的耐盐性及其遗传分析

利用已构建的３个Ｉｍｔｌ（Ｉｎｏｓｉｔｏｌ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ,肌醇甲基转移酶）基因的高效植物表达载体ｐＤＨ０１、ｐＤＨ５和ｐＤＨ１１,通过农杆菌介导的遗传转化法,分别得到了烟草转基因植株。在１．５％ＮａＣｌ溶液中,转Ｉｍｔｌ基因烟草Ｆ１代表现出明显的耐盐能力,株高、单株鲜重、生长势等指标具有显著优势。ｐＤＨ１１载体由于采用了高效的盐诱导型启动子,其转基因烟草的耐盐性显著的优于ｐＤ     

双价杀虫基因植物表达载体的构建及其在烟草中的表达

本文报道了抗虫植物基因工程研究中的新进展－转双价杀虫基因烟草的获得。用ＰＣＲ方法来自豇豆的胰蛋白酶抑制基因进行了修饰,在基因５‘及３’端分别加入了克隆所需地ＰｓｔＩ和ＳａｃＩ限制性酶切位点,去除了原基因５‘端非翻译区序列,并进一步定点突变了基因内存存在的ＥｃｏＲＩ位点。     

直接产生抗除草剂转基因水稻纯系的新方法

提出了一种提高转基因杂交后代育种选择效率的新途径，即在花药培养过程中添加抗性筛选物质，直接筛选含有目的基因的纯合体。以转bar基因水稻植株和非转基因植株杂交F1为试格进行花药培养，并对分化的绿苗进行PCR检测和田间抗性检测。结果表明，在愈伤组织诱导培养基和分化培养基中分别添加PPT0.05mg/L与未添加PPT的对照，均产生较多的愈伤组织和绿苗，并有较高比例不抗除草剂的假阳性株。当PPT浓度增至0.1mg/L时，所得花培苗全部抗除草剂，显示很好的筛选作用。PPT浓度继续增加，愈伤组织诱导率和绿苗分化率急剧下降。当PPT的浓度增至5mg/L时，愈伤组织的诱导和幼苗分化完全被抑制。对30个加倍单倍体系作连续两代农艺性状考察，约73％以上的株系在遗传率较高的性状中，变异系数很小（＜10％），说明这些株系的基因型已经纯合，证实了该方法的有效性。     

抗除草剂转基因水稻的安全性评价

以转基因抗除草剂水稻（Oryza sativa ssp.japonica）为例,对转基因作物进行安全性评价.对转bar基因水稻进行了基因流动实验、小鼠急性毒性实验、致突变实验和Ames实验.结果表明,转bar基因水稻花粉在5 m内有少量的漂移到普通野生稻（O.rufipogon）,但没有向其它野生稻（O.officinalis和O.meyeriana）和杂草漂移.小鼠经口急性毒性半数致死量LD50＞20 g/kg,属实际无急性毒性物质;经微核实验、精子畸变实验及Ames实验均未发现有致突变作用,初步表明转bar基因水稻对小鼠是安全的.     

转基因植物中T-DNA整合的分子特征及表达

植物中不同转基因方法转化外源基因的T-DNA整合特征既具有共性,又具有特性,使得转基因的遗传在各独立转化体间呈现多样性,另外多种遗传因子和限制因素使受体植物中外源基因的表达存在下降,甚至出现基因沉默等复杂现象。本文主要对农杆菌介导及裸露DNA直接转化转基因植物中T-DNA的分子特征和转基因表达的影响因子进行了介绍和概述。转化体中转基因的遗传稳定性和表达主要取决于转基因在植物基因组中的整合位置、拷贝数及组成结构。因而,通过对具有表达水平各异的转化体进行深入的遗传分析和分子生物学研究以及转化体之间进行的比较研究,将对转基因技术自身的完善、定点整合以及更有效的利用转基因技术都具有十分重要的意义。     

碱蓬SgBADH的克隆与分析及植物表达载体构建

为研究碱蓬甜菜碱醛脱氢酶基因的功能,采用同源克隆方法,从碱蓬(Suaeda glauca(Bunge)Bunge.)中克隆到BADH全长c DNA,命名为Sg BADH,并对其序列结构和表达特性进行分析。生物信息学分析发现,Sg BADH编码500个氨基酸的亲水性蛋白,预测亚细胞定位于叶绿体。基因表达分析发现Sg BADH基因受Na Cl和ABA诱导表达,预示Sg BADH基因可能在碱蓬对盐胁迫的反应中起重要作用。本研究同时构建了Sg BADH植物表达载体并转化EHA105农杆菌,为进一步研究BADH基因的功能和碱蓬的耐盐分子机制奠定了基础。     

含两种抗真菌基因植物表达载体的构建

近年来,植物抗真菌病害基因工程研究日益受到重视．并取得了显著进展,目前主要是通过转几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因来提高这两种酶在植物体内的表达水平,以此增强抗真菌病害的能力。体外抑菌实验表明：β-1,3-葡聚糖酶能够抑制某些真菌的生长,而一旦与几丁质酶共同作用时,其抑菌作用会大大增强。本实验将几丁质酶和葡聚糖酶     

拟南芥AtHEMA1基因的克隆及其表达载体的构建

为探究AtHEMA1基因转化植物后对叶绿素合成机制的影响,本实验设计特异引物,以拟南芥基因组DNA为模板,采用PrimStar HS DNA聚合酶扩增AtHEMA1基因。将AtHEMA1基因克隆至载体pVCT2101,获得植物表达载体pVCT2298。     

大熊猫生长激素基因AmGH的植物表达载体构建及其在烟草中的表达

以大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)生长激素基因AmGH构建到植物表达载体pCAMBIA13011-GH上,用根癌农杆菌(Agrobacterium turaefacicas)GV3101介导转化烟草(Nicotiana tabacum)无菌叶片外植体,经过两轮潮霉素(hygromycin,Hyg)筛选,从50株再生植株中筛选到12株抗性植株,经GUS组织化学检测和PCR鉴定,其中4株为阳性,表明AmGH基因已成功地转化并整合到烟草基因组中,RT-PCR检测表明,大熊猫生长激素基因AmGH已在转基因烟草中表达.这是首次报道大熊猫生长激素基因在植物系统中表达.     

小鼠肾组织中EGF基因的克隆及其植物表达载体的构建

表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)是由53个氨基酸组成的单链多肽，在临床上具有重要的应用价值。由于天然EGF来源有限，用基因工程方法生产EGF蛋白已成为一个重要的替代途径。本研究用RT—PCR法从小鼠的肾组织中克隆了EGF基因，并构建到植物表达载体上，为EGF基因在高等植物细胞中的表达奠定基础。     

转录因子DREB1A基因的克隆及植物表达载体的构建

研究转录因子DREB1A在植物抗渗透胁迫反应中的作用。根据GenBank中登录的DREB1A基因的序列设计引物,用PCR方法从拟南芥中克隆DREB1A基因,利用基因重组技术成功构建了植物表达载体pCAMB1A1300-DREB1A。该结果为进一步利用DREB1A基因做遗传转化研究奠定了基础。     

拟南芥AtHOS10基因的克隆及其表达载体的构建

AtHOS10基因对植物冷调节起到重要作用,可以通过控制ABA合成来改变植物的脱水胁迫耐性。本文利用PCR方法从Columbia生态型的拟南芥基因组中扩增出冷调节基因AtHOS10,并插入克隆载体。序列分析表明,克隆片段长3453bp,与目前发表的序列完全一致。将pUC-AtHOS10和pBI-HEM进行酶切重组构建表达载体pBI-AtHOS10,然后将表达载体转化导入农杆菌中,为侵染烟草作准备。     

PchsA驱动的烟草orf25基因表达载体构建及遗传转化

为研究orf25基因的功能及其与烟草雄性不育性的相关性,通过PCR方法从质粒p UC57-Pchs A中扩增了花特异性启动子Pchs A,并以其取代植物表达载体p BI121中的组成型启动子Ca MV35S,然后将orf25基因插入到Pchs A启动子下游,构建由Pchs A启动子驱动的orf25基因表达载体,测序结果显示植物表达载体p BI121-Pchs A-orf25构建成功。将该表达载体导入根癌农杆菌LBA4404中,采用根癌农杆菌介导法遗传转化雄性不育烟草MS革新3号,共获得76株转基因烟草植株,经PCR鉴定,转基因阳性植株为18株,转化率为23.7%。研究结果证明目的基因orf25已整合到烟草基因组中,为进一步探究该基因的功能及其与烟草雄性不育性的关系奠定了基础。     

毛囊特异表达载体pUHS-FGF18的构建及转基因小鼠的制备

成纤维生长因子18(fibroblast growth factor 18,Fgf18)是一种分泌型的信号分子,参与小鼠(Mus musculus)和绒山羊(Capra hircus)毛发生长及毛周期的调控.本研究克隆了小鼠Fgf18基因CDS区的片段,并将其连接于超高硫角蛋白(ultra-high sulfur keratin,UHS)启动子的下游.Sac Ⅰ、BglⅡ、SphⅠ和EcoT14 Ⅰ的酶切鉴定结果表明,成功构建了Fgf18基因毛囊特异表达载体pUHS-Fgf18.原核注射线性化pUHS-FGF18,共获得3只转基因小鼠.RT-PCR检测结果表明,Fgf18基因在转基因小鼠皮肤中的表达明显高于对照小鼠(P＜0.05).转基因小鼠NO.205皮肤中Fgf18的表达量明显高于对照小鼠(P＜0.05),而肝脏、肾脏、心脏、睾丸、骨骼肌、脾、脑、肺、胃和小肠等组织则与对照小鼠无显著性差异(P＞0.05).Westem blot的结果表明,转基因小鼠皮肤的Fgf18蛋白水平显著高于对照组(P＜0.05).同时本研究利用RT-PCR的方法检测了转基因小鼠中Fgf18基因的拷贝数,其拷贝数在8～210.本研究成功建立了毛囊特异表达Fgf18基因的转基因小鼠模型,不仅可为进一步研究Fgf18基因在毛周期及毛发生长中的功能及其作用机理提供必要的工具和手段,也可为生产Fgf18基因修饰的转基因绒山羊提供一定的理论基础.     

蓝猪耳胚珠磷脂酶C基因TfPLC1启动子的克隆、序列分析及植物表达载体的构建

应用衔接头PCR技术,以蓝猪耳(Torenia fournieri)全基因组DNA分别经DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ和SmaⅠ消化后与衔接头连接产物为模板,用衔接头引物和TfPLC1基因的特异引物经过多轮的巢式PCR,先后克隆到2个798和813bp的Tf-PLC1基因上游序列;经测序、blast比较分析和拼接得到一个蓝猪耳TfPLC1基因的启动子序列,共1432bp。序列分析表明它含有类似于TATAbox和CAATbox的元件,在其远端上游区域还有多个AT富含区,而且还含有多个胚乳特异表达启动子的元件。将该启动子全序列和5'端缺失的700bp序列与PBI121分别构建了植物表达载体PPP1326和PPP700,用于转化蓝猪耳,以验证该启动子的功能。