大豆耐热β-淀粉酶基因在大肠杆菌中的表达

以含耐热β-淀粉酶的大豆品种中黄20为材料,从未成熟大豆子叶组织中提取总RNA,利用RT-PCR扩增出预计大小的cDNA片段.将该片段克隆至pGEM-T载体,经酶切分析和测序,克隆的β-淀粉酶的基因的cDNA片段长1 491 bp,与已报道序列只存在个别的碱基差异,同源性达到99%,编码497个氨基酸残基的多肽,预计相对分子质量56 KD.酶切片段与经相同酶酶切的表达载体pET-43.1(a)连接,转入大肠杆菌中,并使其高效表达.SDS-PAGE表明,大肠杆菌表达的大豆β-淀粉酶的相对分子质量约为50 KD.     

芽孢杆菌SP A3β-葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达

将含β-葡聚糖酶基因的重组克隆载体进行亚克隆,用BamHⅠ和 XhoⅠ双酶切后,与相同酶切的表达载体pET-30a相连接,构建重组表达载体,在大肠杆菌BL21中表达,蛋白质电泳结果表明在25.0 KD处有表达带,酶活力达85.9U/mL,为出发菌的31多倍.     

油菜菌核病菌激发子基因SsXYN克隆及表达载体构建

以核盘菌菌株NGA4提取的总RNA为模版,利用RT-PCR技术扩增获得SsXYN基因的全长cDNA片段,将其克隆到pMD19-T载体上,菌落PCR、酶切鉴定和cDNA测序结果表明成功克隆了核盘菌SsXYN基因。从pMD19-T:SsXYN载体上,用BamH I和Sal I双酶切切下目的基因片段,将该基因片段连接到原核表达载体pET32a中。菌落PCR和酶切鉴定结果显示成功构建了表达载体pET32a:SsXYN。利用热击法将该重组表达载体导入大肠杆菌BL21,获得携带SsXYN基因的大肠杆菌菌株,为进一步研究激发子诱发植物抗病性机理奠定了基础。     

小鼠蛋白激酶CK2β亚基cDNA的克隆与序列分析

目的：构建小鼠蛋白激酶CK2β亚基cDNA重组表达质粒，以便深入进行CK2结构与功能的研究。方法：通过反转录PCR从NIH3T3小鼠成纤维细胞中获得小鼠蛋白激酶CK2β亚基编码区cDNA，PCR扩增酶为高保真DNA聚合酶。将NdeⅠ/HindⅢ彻底双酶切PCR产物定向连接到牛小肠碱性磷酸酶去5′端磷酸的同样彻底NdeⅠ/HindⅢ双酶切的表达载体pT7—7中，转化感受态大肠杆菌DH5α获得转化子，用0．8％琼脂糖凝胶电泳初步筛选转化予，将阳性克隆进行单和双酶切分析鉴定。随机挑选两个阳性克隆进行DNA测序。结果：转化子的阳性筛选率为100％，限制性酶切分析结果表明插入片段和重组质拉的大小与理论推测值相符。DNA测序结果表明：两个重组小鼠CK2β亚基克隆中的插入片段序列均与两种已报道的小鼠CK2β亚基cDNA编码区序列分别存在一个碱基差异，但我们报道的这2个差异碱基与大鼠、兔、猪和人CK2β亚基cDNA的编码区相应碱基序列一致。结论：本实验克隆的小鼠蛋白温酶CK2β亚基cDNA编码区序列可能是正确的序列。     

小鼠β-酪蛋白基因载体的构建与表达

通过RT-PCR方法扩增β-酪蛋白基因,扩增产物插入质粒载体pET-28a中构建成表达载体,转化入大肠杆菌BL-21,经IPTG诱导表达.利用限制性内切酶酶切图谱分析、DNA序列测定及SDS-PAGE,结果表明,成功地用RT-PCR方法从小鼠乳腺组织中克隆出β-CN基因并构建了重组β-CN的表达载体,并在大肠杆菌获得表达.     

人雌激素相关受体α配体结合域的原核表达载体构建·表达及鉴定

[目的]构建舍人雌激素相关受体α配体结合域区段的原核表达载体,并在大肠杆菌表达系统中表达。[方法]用Trizol试剂提取人肺腺癌A549细胞总RNA,逆转录为cDNA;应用PCR扩增人EERα—LBD基因片段,插入表达载体pET-30a-c（＋）中;转化大肠杆菌BL21（DE3）PLysS,经IPTG诱导后表达并鉴定。[结果]应用PCR方法扩增出约687bp的基因片段,酶切、纯化、连接至载体后,经测序与GenBank中的一致,表达蛋白相对分子质量约32kD,纯化后用生物大分子相互作用系统鉴定为目的蛋白。[结论]已成功获得人EERα-LBD融合蛋白,为进一步的研究和应用奠定了基础。     

马MxA基因真核载体表达重组质粒的构建与鉴定

从马外周血单核细胞中提取RNA后,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,获得了MxAcDNA.扩增的目的基因片段经琼脂糖凝胶电泳回收,与pGEMR-T Easy栽体连接,转入大肠杆菌中筛选鉴定重组子.将质粒经酶切鉴定后.把酶切下的目的基因MxA cDNA进一步克隆到真核表达载体pCI-neo中,经PCR及序列鉴定,证实插入栽体pCI中的片段为含有目的基因的核苷酸序列.真核表达重组质粒DCI-neo MxA cDNA的构建成功,为进一步研究马MxA蛋白的抗病毒作用奠定了基础.     

金黄色葡萄球菌多药耐药基因norA的克隆及其原核表达

按金黄色葡萄球菌多重耐药转运蛋白NorA的编码序列设计引物，以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，扩增出norA基因中1155bp cDNA片段，将所得片段与pMD18-T载体连接，转化到感受态大肠杆菌JM109中，成功地筛选到阳性克隆，其质粒测序结果与文献报道一致。从阳性克隆中提取质粒，经Nde Ⅰ和XhoⅠ酶切，回收1155bp目的片段，定向克隆到pET28a（＋）表达载体中，转化感受态大肠杆菌DH5a，提取质粒，再次转化到BL21（DE3）中，成功地筛选到阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌，通过SDS-PAGE检测出norA基因的表达。     

热纤维素梭菌内切葡聚糖苷酶基因在枯草芽孢杆菌的表达

对热纤维素梭菌Clostridium thermocellum内切葡聚糖苷酶基因CelG及其信号肽序列进行了克隆及表达研究.以热纤维素梭菌总DNA为模板,经PCR扩增获得目的,并连接到大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒pSW1载体,获得质粒pSW1-CelG;用感受态转化法将获得质粒pSW1-CelG转化到枯草芽孢杆菌BGSC中进行分泌表达,获得了大小约56KD的蛋白片段,且具有生物活性,证明CelG基因克隆成功并正确表达.     

中性β-葡萄糖苷酶基因表达载体的构建

利用RT-PCR方法从芽孢杆菌Bacillus Subtilis CY110中克隆出β-葡萄糖苷酶基因,将此目的基因连接到pBS-T载体后导入大肠杆菌DH5α。测序结果表明,获得的目的基因片段大小为1 398 bp,该序列与Gen-Bank中的β-葡萄糖苷酶基因ABQN01000006.1序列相比同源性达到99.8%,氨基酸序列同源性达到99.5%。将产物与pET-28 a表达载体连接,经双酶切检验,证明原核表达载体构建成功。