伴生微生物与松材线虫-媒介天牛互作关系的研究进展

松材线虫Bursaphelenchus xylophilus是世界范围内的重大林业入侵种。松材线虫与墨天牛属Monochamus昆虫之间互利共生,形成紧密的共生复合体。越来越多的报道表明,伴生微生物在松材线虫的成功入侵中发挥着重要作用。笔者综述松材线虫、媒介昆虫、寄主植物等不同来源伴生微生物与松材线虫-媒介天牛复合体的互作关系的研究进展。首先,介绍松材线虫-媒介昆虫伴生微生物的组成及其地理变异;然后,从影响松材线虫的生长繁殖、致病性、入侵性、逃避天牛免疫等角度分析伴生微生物对松材线虫-媒介天牛复合体的影响,总结松材线虫及媒介天牛对伴生微生物组成与结构的影响;最后从应用视角探讨通过伴生微生物遗传改造、微生态调控等手段操纵微生物与松材线虫-媒介天牛互作关系,从而发展松材线虫病的导向性防控技术。     

松材线虫与其伴生细菌在寄主内的种群动态

利用马尾松水培离体松枝作接种材料 ,分别接种消毒后的松材线虫、松材线虫伴生细菌坚强芽孢杆菌和松材线虫与坚强芽孢杆菌的混合液 ,以研究松材线虫与其伴生细菌在松枝中的种群动态。结果表明 :松材线虫和坚强芽孢杆菌混合接种 ,松枝发病 ,松枝髓部发生褐变 ,褐变的过程是由接种枝发展到主枝 ,再由主枝下部向上部发展 ,而单独接种松材线虫或坚强芽孢杆菌 ,松枝不发病 ;松材线虫和坚强芽孢杆菌混合接种较单独接种松材线虫 ,松枝中的松材线虫繁殖量大、扩散速度快 ;松材线虫在松枝中扩散的过程是 :接种枝→主枝→侧枝→新梢 ,在主枝中由下部向上部扩散 ;松枝髓部褐变过程和松材线虫在松枝中扩散过程相一致 ,松材线虫扩散分布先行于髓部褐变 ;松材线虫和坚强芽孢杆菌混合接种较单独接种松材线虫或坚强芽孢杆菌初期 ,松枝中致病细菌的检测量大 ,从而提出细菌和松材线虫均是松材线虫病不可缺少的致病因素。文后指出寄主主干下部髓部褐变可用作病害的早期诊断。     

拟松材线虫研究进展

松材线虫和拟松材线虫共同构成松材线虫复合群体,为松材线虫病的病原物。拟松材线虫危害过去没有引起足够重视,相关研究工作不如松材线虫细致。近年来,随着拟松材线虫致病性增强现象不断被报道,人们逐步加强了拟松材线虫研究。本文从拟松材线虫分类学特征、致病性研究及与松材线虫关系等角度对拟松材线虫研究进展进行综述,并展望未来可能的研究热点。     

拟松材线虫病危害不可忽视

<正>松材线虫(Bursaphechus xylophilus)的近缘种拟松材线虫(Bursaphechus mucnatus),与松材线虫同属于滑刃线虫属,二者在形态上极为相似,但各自又是独立种。在进行松材线虫病监测调查时,对采集的样品分离鉴定,常见到拟松材线虫存在于萎蔫枯死松树的木质部中。     

（拟）松材线虫耐久型四龄幼虫（LⅣ）的形态及其分化变异

本文对浙江省宁波市松材线虫病疫区内的松材线虫和拟松材线虫的耐久型四龄幼虫(LⅣ)的形态及其分化变异作了观察研究.结果表明,松墨天牛成虫体内携带的松材线虫和拟松材线虫的LⅣ在形态上完全相同;同一来源的(拟)松材线虫的LⅣ既可发育形成松材线虫,也可形成拟松材线虫.它的分化变异结果受寄主等环境因子影响,规律是:带尾尖突的LⅣ离开松墨天牛成虫进入黑松多变为无尾尖突的松材线虫;进入马尾松多变为带尾尖突的拟松材线虫.     

基于TaqMan实时荧光PCR的拟松材线虫分子鉴定技术

拟松材线虫与松材线虫的亲缘关系极为接近,是松材线虫病病原鉴定的主要干扰物种。为了排除松材线虫病病原鉴定过程中拟松材线虫的干扰,采用TaqMan实时荧光PCR技术,以核糖体DNA内转录间隔区(ITS)为模板设计拟松材线虫特异性引物和TaqMan探针,开展拟松材线虫分子检测和鉴定技术研究。结果表明:拟松材线虫ITS2区域存在较多的碱基差异,以此为模板设计的拟松材线虫引物和TaqMan探针组合具有较强的特异性;该组合灵敏性高,能够实现对拟松材线虫单条线虫甚至单个卵的分子检测和鉴定。结合现有的松材线虫分子鉴定技术,可以为进一步构建松材线虫双重检测技术体系奠定基础,为林业和海关检疫提供可靠的技术支撑。     

松材线虫与拟松材线虫杂交试验及后代繁殖力研究

松材线虫Bursaphelenchus xylophilus和拟松材线虫B.mucronatus是伞滑刃属内两个独立的种,均可引起松材线虫病。松材线虫与拟松材线虫能否进行种间杂交在学术界一直存在争议。采用4个虫株在实验室条件下开展了杂交试验及杂交后代繁殖力研究。结果表明:实验室条件下松材线虫和拟松材线虫可成功杂交,他们之间未发展出严格的生殖隔离,二者极可能来源于同一祖先。     

“松材线虫SCAR标记与系列分子检测技术及试剂盒研制”项目通过鉴定

2006年5月，由南京林业大学森林资源与环境学院叶建仁教授主持完成的“松材线虫SCAR标记与系列分子检测技术及试剂盒研制”通过了江苏省科技厅组织的科技成果鉴定。该项研究对松材线虫与拟松材线虫特异片段进行了系统筛选，共获得了7个松材线虫DNA特异片段与5个拟松材线虫DNA特异片段，为松材线虫与拟松材线虫的分子鉴定奠定了基础。首次将2个松材线虫与2个拟松材线虫的DNA特异片段成功转化为SCAR标记，丰富了松材线虫与拟松材线虫分子标记方法。首次采用SCAR标记方法成功构建了松材线虫检测试剂盒，PCR检测过程仅需2．2小时。首次成功标记了一个可用于检测松材线虫的非放射性探针DIG-F2／R1。用该探针对线虫基因组DNA点杂交，松材线虫均表现有较强的杂交信号，而拟松材线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫、大核滑刃线虫、长尾属线虫等均无杂交信号。     

松材线虫染色观察及植物凝集素对松材线虫作用的初步研究

研究了4种染色剂对松材线虫的染色效果,结果表明,虎红和水溶性苯胺兰对松材线虫的染色效果好,虫体全身着色且着色较深,而亚甲基蓝和结晶紫对松材线虫的染色能力较弱,只在头部和尾部着色明显;初步研究了刀豆凝集素、麦胚凝集素和花生凝集素对松材线虫的作用,结果显示,植物凝集素处理后,松材线虫初期均表现出活动加强、幅度增大,部分线虫身体卷曲呈"S"状或"8"字状,部分线虫出现聚集现象,随着处理时间的延长,松材线虫的死亡率逐渐上升,4.0mg/mL的刀豆凝集素、麦胚凝集素和花生凝集素分别处理10min,松材线虫的死亡率分别为100%、80%和65%。该研究为松材线虫的形态观察及防治提供了参考。     

基于国内外科技文献分析松材线虫研究现状和方向

为了解松材线虫病防控领域研究现状,本文以Web of Science数据库中SCI-E库和"中国知网"为数据源,收集2003—2019年发表的松材线虫研究相关科技文献,用文献计量学方法从文章发表年份、数量、国家、领域、关键词和基金项目等多角度对国内外松材线虫研究现状进行定量分析。结果表明:目前对松材线虫的研究主要集中在松材线虫病危害严重的国家,研究方向和发展趋势则根据各国实际情况各有侧重;我国近10 a在松材线虫研究领域活跃,但多集中在松材线虫本身、松材线虫与媒介昆虫及松材线虫与寄主之间的关系等方面。未来应以高效实用防控技术和产品为导向,着眼于监测预警、检疫检验、高效防治、抗性选育、生态修复等松材线虫病防控全过程,结合其致病机理,整合科研力量,开展联合科研攻关,力求早日突破松材线虫病防控的技术瓶颈。     

高压脉冲电流对松材线虫活力和繁殖的影响

研究高压脉冲电流对松材线虫活力和繁殖的影响.结果表明:高压脉冲电流可杀死松材线虫,能抑制松材线虫的迁移扩散能力,脉冲宽度越大,脉冲个数越多,电处理间隔越短,对松材线虫活力影响越强,脉冲宽度和电处理间隔为影响松材线虫活力的主要因子;高压脉冲电流可抑制松材线虫繁殖,脉冲宽度越大,电处理时间越长,对松材线虫的繁殖抑制作用越强;不同龄期的松材线虫对高压脉冲电流的反应不同,成虫对高压脉冲电流的抗性更强,尤以雌虫更具抗性.     

应用特异引物组合检测松材线虫

采用特异引物组合对枯死松树内分离的松材线虫、拟松材线虫及其他线虫进行检测。结果表明,所有松材线虫株系均扩增出一条860 bp的清晰、明亮的条带,而拟松材线虫、其他线虫均无扩增产物。利用此特异引物组合构建了松材线虫检测试剂盒。采用本试剂盒可以在较短时间内对线虫进行鉴定。整个检测过程约需3 h,实现了对松材线虫的快速检测目标。检测结果便于判读,适合于生产上应用。     

松材线虫病治理区病原数量的调查研究

对松材线虫病治理区室内、林内松褐天牛羽化期携带松材线虫以及诱木中松材线虫的情况进行调查,结果表明在室内、林内松褐天牛携带松材线虫的几率分别为25．5％、22．0％;松褐天牛成虫携带松材线虫量均以6月份最大,平均625条／头、478条／头;诱木中松褐天牛携带松材线虫数量与其寄生的枯死诱木含松材线虫数量呈正相关,5％水平上成极显著相关,相关系数为0．933。     

无细菌松材线虫对马尾松的致病性

【目的】探讨松材线虫及其伴生细菌在松材线虫病中的作用,为其致病机制研究及病害防治提供理论依据。【方法】以5年生温室健康马尾松盆栽苗为材料,人工接种无菌松材线虫和带菌松材线虫(8 000条·株-1),观察松苗萎蔫情况,并于接种5、10和30天后取茎段横切面观察松脂分泌情况,对接种20天后的茎段组织解剖结构进行显微观察,接种后30天对植株取样进行线虫再分离,统计线虫在树体内种群增殖情况。【结果】无菌松材线虫和带菌松材线虫均能引起5年生马尾松盆栽苗发病,且症状一致,接种35天后致萎蔫率均达到90%,对照植株保持健康状态;茎段横切面观察结果显示,无菌松材线虫接种5天后松脂停止分泌,10天后茎段开始出现少量空洞,30天时空洞化严重;带菌线虫接种5天后尚有少量松脂分泌,10天松脂分泌停止,30天后茎段产生空洞;对照松树松脂分泌正常,茎段横切面完整平滑。石蜡切片结果显示,2组线虫接种致萎蔫松树茎段的组织解剖结构均发生显著变化,皮层及木质部细胞、髓心细胞大多破碎变形,树脂道上皮细胞破碎解体。无菌松材线虫在松苗体内种群增殖速率高于带菌松材线虫,萎蔫松苗体内线虫数量分别为(8 105±5 661)条·g-1和(4 317±1 896)条·g-1,但二者差异不显著(P=0.361 9)。【结论】无菌松材线虫和带菌松材线虫接种均能使5年生马尾松苗发病,无菌化处理未使松材线虫失去对马尾松苗的致病性,松材线虫的致病性与其伴生细菌无关。     

疫木中松材线虫的免疫学检测方法的研究

以松材线虫的粉碎虫体免疫家兔制备抗血清 ,通过免疫印迹考察抗血清的特异性。利用固相松材线虫抗原和游离线虫抗原同线虫抗体相竞争 ,建立竞争型ELISA法用于疫木中松材线虫的分析。该方法可以直接检测出 10mg的木屑中 0 1μg微量的线虫蛋白 ,约 7条线虫的存在。利用该方法对 2 0个不同地区、树种及类型的松材样品进行检测 ,疫木中松材线虫的检出率为 10 0 % ,但拟松材线虫也呈现了一定的交叉反应。研究结果表明 ,以松材线虫抗原蛋白为指标的免疫学检测方法简便快速、灵敏度高 ,为松材线虫的快速检疫提供一种可能的途径     

松材线虫基因研究进展

对目前松材线虫基因水平的研究进行了概述.目前已研究过的松材线虫基因主要分为三个方面:一是应用于检疫检验的研究,主要研究的基因有rRNA基因,利用rRNA的ITS区核苷酸序列进化速度较快的特点,能准确区分松材线虫与其近缘种;二是探讨致病机理的研究,主要研究了纤维素酶和果胶酸裂解酶等在食道腺细胞中表达的酶基因,发现纤维素酶基因可能是由于基因横跨作用从细菌迁移到松材线虫基因组内,有助于研究松材线虫致病性的起源;三是对松材线虫生长发育相关基因的研究,为控制松材线虫的生长发育提供了依据.     

大岗山人工针阔混交林与常绿阔叶林水文动态变化研究

对松材线虫 7个株系和拟松材线虫 2个株系的线粒体DNA随机扩增多态性分析结果显示 ,松材线虫和拟松材线虫种间和种内都表现出很大的变异性 ,但种间变异明显大于种内变异 ,因而支持将松材线虫和拟松材线虫划分为两个不同的种。两个拟松材线虫株系 (法国株系和日本株系 )之间的相似值和松材线虫各株系间的相似值极为接近 ,由此看来 ,这两个株系的变异为种内变异 ,应同属于一个种。聚类分析的结果表明 ,松材线虫和拟松材线虫系两个明显不同的类群 ,即松材线虫类群和拟松材线虫类群。松材线虫类群又分为两个亚组 ,一个是以日本株系为代表 ,另一个是以北美洲 (美国和加拿大 )株系为代表     

无菌和带菌松材线虫对赤松的致病性

【目的】探讨无菌和带菌松材线虫对赤松的致病性,明确松材线虫在松树萎蔫病中的地位,为致病机制研究及病害防控提供依据。【方法】以赤松胚性愈伤组织为材料,每块组织接种无菌松材线虫250条,培养12天后,利用2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色法对愈伤组织进行染色,分析无菌松材线虫对赤松愈伤组织细胞活性的影响。以赤松组培苗和4年生盆栽实生苗为对象,每株接种无菌松材线虫和带菌松材线虫(组培苗250条,4年生苗3 000条),分别于18天和35天后统计2种类型线虫接种所致松苗萎蔫率,并对植株体内线虫进行再分离,分析2种类型松材线虫对赤松幼苗的致病能力。【结果】无菌松材线虫接种导致赤松胚性愈伤组织严重水渍化,TTC染色为米黄色或淡粉色,证明愈伤组织已失去活性。无菌松材线虫和带菌松材线虫接种均能导致赤松组培苗萎蔫,接种18天后,萎蔫率分别为70%和60%;萎蔫植株中均可再分离到松材线虫,其每株平均分别为599±567条和365+240条,二者差异显著(P0.01)。剩余外观健康的赤松组培苗中也分离到线虫,但数量较少(仅10~20条)。2种类型松材线虫接种引起赤松盆栽苗同等程度的萎蔫,接种35天后的萎蔫率均达80%,无菌和带菌松材线虫致萎蔫植株中均可再分离到松材线虫,其每株平均分别为34 733±34 162条和25 057±21 410条,但差异不显著(P=0.508)。其余外观尚健康的松苗也进行线虫分离,2株接种无菌松材线虫的植株体内线虫分别为486条和22条;接种带菌松材线虫的2株松苗中,1株分离到646条线虫,另1株没有分离到线虫。【结论】无菌和带菌松材线虫均对赤松具有致病性,松材线虫是赤松萎蔫的直接原因,伴生细菌并非赤松萎蔫的必须因子。     

松材线虫传播与松墨天牛取食行为相关性研究

为探究松墨天牛取食行为对其携带的松材线虫传播的影响,对松墨天牛进行饥饿处理,分析其与正常饲喂天牛传播松材线虫起始时间的差异;同时分析天牛取食量与松材线虫传播比率的相关性。结果显示：经饥饿处理的天牛与正常喂养的天牛传播线虫起始时间无显著差异;同时天牛取食数量与其传播线虫的比率相关性较弱。表明：松材线虫的传播与天牛取食行为无明显相关性,与媒介天牛取食导致的代谢变化无关,松树挥发物也非触发松材线虫脱离的原因;媒介天牛取食行为仅为松材线虫的传播提供途径,而非触发松材线虫传播的原因。     

“松材线虫特别防治措施法”的修正及松材线虫危害的新对策

<正> 一、引言在第96次国会上通过了关于对《松材线虫特别防治措施法》的修正决议,并于1982年3月31日公布实施。于是,1977年制定的《松材线虫特别防治措施法》被改为《松材线虫危害对策特别措施祛》。为了实现对松材线虫的综合防治,在内容上也增加了必要的条款。今后五年时间内,以这个《松材线虫危害对策特别措施法》为基础,争取将松材线虫严重危害情况尽早地控制下来,以确保所有松类森林功能的充分发挥为目标,决定逐步将松材线虫危害防治的新对策能付诸实施。