水稻白叶枯病菌的血清学研究

 用戊二醛固定的5个水稻白叶枯菌株制备了5个抗血清,利用琼脂双扩散、试管凝集、免疫电泳和酶联免疫吸附试验研究了107个水稻白叶枯菌株血清学反应的差异,将它们分为三个血清型。属于Ⅰ型的菌株(OS-225、F₄等)占供试菌株的95%,分布于全国各稻区;归属于Ⅱ型的菌株(OS 209、OS-109等)占5.6%,主要来自南方边远地区;Ⅱ型仅1个菌株(G₈),占0.9%,来自广西东部;其中还有两个菌株和上述抗血清均不能反应,暂不能归型,来自福建。血清型和致病型之间的相关性不用戊二醛固定、热处理等5种不同方法处理菌体后制备的抗血清之间,表现出一致的反应特异性和相似的"型"专化性。免疫电泳结果表明,不同血清型的免疫源组成是不同的,Ⅰ型仅具中性免疫源,Ⅱ型具中性及偏碱性免疫源,而Ⅱ型则具中性及偏酸性两种免疫源。
比较了反向间接血凝、酶联免疫吸附和免疫荧光反应等方法检测病菌的灵敏度,以免疫荧光试验(IF)为最灵敏,可检测到每毫升10³细胞,ELISA其次(10^4-5cell/ml),反向间接血凝法为10^6-7cells/ml,双扩散法最差,只有在高达10⁸ cells/ml时才有阳性反应。     

水稻细菌性条斑病菌和白叶枯病菌数字PCR检测方法的建立

基于水稻细菌性条斑病菌的假定膜蛋白基因和水稻白叶枯病菌的rhs家族基因分别设计引物和探针,建立了这两种病菌的数字PCR检测技术。特异性测试结果显示,两种检测方法均可特异性检测到目标病菌的供试菌株,而其他对照菌和空白对照均为阴性。两种检测方法对目标菌的检测下限分别达到了9个和16个拷贝/反应,且成功检测到人工模拟带菌及自然带菌种子样品中的病菌。     

广东水稻白叶枯病菌致病型研究

1988—1993年。用中国白叶枯病菌致病型研究的鉴别品种和鉴定方法,测定450份广东白叶枯病分离菌株在中国鉴别品种上的抗感反应,把广东白叶枯病菌系划分为5个致病型。Ⅳ型菌是优势致病型,Ⅴ型菌是在广东首先发观的新致病型。近年来出观频率上升。范围扩大,能使现有推广的抗病品种丧失抗性。为品种的合理布局和抗病品种的选育提供了新信息和理论依据。     

中国水稻白叶枯病菌毒性变异研究

 利用13个含已知抗病基因的近等基因系材料,在水稻孕穗期采用剪叶接种法对我国285个水稻白叶枯菌株(其中108个采集于1970~1992年,177个采集于2003~2004年)的致病力变异进行研究。结果表明,病菌的致病力呈现多样性。通过试验系统比较了不同时期病菌的毒性和小种组成变化。在此基础上对病菌群体毒性变化的原因进行了分析。     

水稻细菌性谷枯病菌和水稻白叶枯病菌荧光RPA快速检测方法的建立

本研究分别针对我国进境植物检疫性有害生物水稻细菌性谷枯病菌及水稻白叶枯病菌建立了光RPA检测方法,并对其灵敏度、特异性以及对实际种子样本的检测能力进行了测试评价。结果表明,本研究建立的两种方法均能够在20 min内特异性检测到目标菌株,对水稻细菌性谷枯病菌(Burkholderia glumae)菌液的检测下限达到了11.4 CFU/反应,DNA检测下限达到了4.83×10^-5ng/反应;对水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)菌液的检测下限达到了4.42 CFU/反应,DNA检测下限达到了3.83×10^-4ng/反应。两种方法均能够成功应用于带菌种子样品的快速检测。     

水稻白叶枯病菌抗药性现象的室内研究

水稻白叶枯病是水稻的主要病害,目前我国防治该病的药剂主要是噻枯唑(川化—018),在含药含菌培养基上,筛选出了叶枯净(5—氧酚嗪)抗性菌,其突变率为2×10~(-6),抗性指数为333。未发现噻枯唑和渝—7802抗性菌。而在活体上直接喷药筛选时既发现了叶枯净抗性菌(抗性指数大于108),又发现了噻枯唑抗性菌(抗性指数大于196),仍然未发现渝—7802抗性菌,进一步的试验证明,噻枯唑活体抗性菌,离体测定时无抗药性,说明噻枯唑活体抗性和离体抗性不一致,而叶枯净的活体抗性和离体抗性一致。交互抗性测定证明,噻枯唑、叶枯净、渝—7802三者之间无交互抗性现象,而噻枯唑与敌枯双之间存在着强烈的正交互抗性。     

水稻白叶枯病菌hrpG调控基因的鉴定

水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)引起的白叶枯病(bacterial leaf blight,BLB)是水稻上最严重的细菌病害之一。Xoo与寄主水稻的互作依赖由hrp基因编码的Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS),将效应蛋白(T3SS effectors,T3SEs)注射入水稻细胞,引起BLB症状的扩展。HrpG是hrp基因转录表达的主要调控因子。为了鉴定未知的hrpG调控子,本研究在以hrpG∷gusA为报道基因构建的转座子突变体库中,筛选获得4个候选的hrpG负调控子突变体G24-46、G48-22、G19-14和G57-41。GUS活性测定、荧光定量PCR以及烟草组织的GUS染色试验均显示,在这些突变体中hrpG的表达显著增加。Southern杂交结果显示,突变体中转座子均为单一位点的插入。插入位点分析结果显示,在G24-46、G48-22、G57-41和G19-14中转座子分别插入在minD、pilA、metB和wxoB基因中。毒性测定结果显示,这4个突变体在水稻上的毒性显著降低。这些hrpG调控子基因的鉴定为进一步解析稻黄单胞菌hrpG上游调控网络提供了新的科学线索。     

水稻白叶枯病菌抗菌物质产生的研究

对水稻白叶枯病菌抗菌物质的产生进行了研究。通过氯仿熏蒸、热处理、紫外线照射等灭活处理，在６２个菌株中发现了３２个菌株可产生抗菌物质，其中１２个菌株３种灭活处理均形成了抑菌圈，抑菌范围较广的ＹＺ－１３对水稻白叶枯病菌的６２个菌株中的４８个具有作用；ＹＺ－３２菌株３种灭活处理均产生了对自身菌株具有活性的抗菌物质。     

水稻品种抗白叶枯病菌的稳定性研究

 利用水稻品种来防治白叶枯病是经济、安全、简便的有效措施。而品种抗病的稳定性如何?1975-1987年,选择95个品种在湖南省老病区安仁县进行人工接种鉴定。     

中国水稻白叶枯病菌致病型的研究

 在1975-1980年初步测定的基础上,近4年来,先后从国内各病区又采集了835个菌株,分别在北京、南京、扬州和广州等地,在30个鉴别品种上接种测试其致病性差异,根据在5个最基本的鉴别品种上的反应特征,可将供试的菌株区分为7个致病型。它们在IR26,Java14,南粳15,Tetep和金刚30上成株期的反应模式分别为(Ⅰ):RRRRS;(Ⅱ):RRRSS;(Ⅲ):RRSSS;(Ⅳ):RSSSS;(Ⅴ):SRRSS;(Ⅵ):RRSRS;(Ⅶ):RSSRS。在北方粳稻区的菌株,多属Ⅱ型和Ⅰ型,在南方籼稻区的菌株以Ⅳ型为最多,还有少量Ⅴ型菌存在,在长江流域籼粳混栽稻区的菌株,则以Ⅱ、Ⅳ型为多。     

云南水稻白叶枯病菌生理小种初析

从云南省 5个地州14个县市的水稻白叶枯病标本中分离水稻白叶枯病菌菌株 ,选择具有区域代表性的菌株 5 1株 ,利用已知抗病基因的近等基因系 ,在孕穗期应用剪叶法接种明确其生理小种。鉴定结果表明 ,云南省水稻白叶枯病菌小种复杂多样 ,共有 14种类型 ,暂定为YN1～YN14 ,优势生理小种为YN3、YN8、YN11,其中YN3分布在红河、德宏等 4个县市 ;YN8小种分布在大理等地区 ,小种的分布可能受地理区域的影响     

双重PCR技术检测水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌

本研究分别设计并合成了白叶枯病菌的专化性引物OSF1-OSR1和条斑病菌的专化性引物XoocF-XoocR。用这两对专化性引物分别对118个参试菌株进行PCR扩增,并且通过将这两对专化性引物配对以及不断优化PCR反应条件,成功建立了双重PCR技术,同时对水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌实施快速精确的检测。     

我国水稻白叶枯病菌致病力分化研究

综述了我国水稻白叶枯病菌致病力分化及其致病基因和致病机制的研究进展 ,查明稻白叶枯病菌致病力分化状况是进行水稻抗白叶枯病育种及其抗性品种利用的基础。     

水稻白叶枯病菌单细胞系毒力分化研究

 以稀释倒平板法从0型菌086和IV型菌967-4和9620中分离到59个单细胞系;在12个近等基因系品种上,086和其单细胞系表现为弱毒力,2个IV型菌及其单细胞系能克服抗病基因Xa-1、2、3、8、10、11、14的抗性,不能克服Xa-21、4、5、7、13的抗性;带主效抗病基因的品种Asominori、XM5、M41、XM6和丰锦能把3个母株的59个单细胞系区分为12种数量差异或质量差异的不同致病型;将此5品种与近等基因系配合,适合作为病菌致病基因变异频度监测的寄主;采用"段叶沙培,切口取菌胶"法分离病菌,在中国致病型鉴定品种上划分的致病型,是田间病菌群体毒力结构的表型反应。     

铁盐对水稻白叶枯病菌噬菌体的钝化作用

 在测定单价、二价和三价金属盐和杀菌物质等对水稻白叶枯病菌[Xantho-monas oryzae(Uyeda et Ishiyama) Dowson]噬菌体影响的过程中,发现铁盐可以钝化OP1型的游离噬菌体,而时已经被吸附的噬菌体则完全没有影响。铁盐的钝化噬菌体主要是铁离子的作用。三价铁盐的钝化作用比二价亚铁盐强。对低浓度的噬菌体悬浮液(n×10⁴/毫升),其最低有效浓度为3-5×10^-3M;对高浓度(n×10^8-9/毫升)的噬菌体悬浮液,其最低有效浓度为1×10^-3M。铁盐溶液的浓度超过1×10^-3M时,不仅使游离噬菌体全部钝化,对细菌也有致死作用。     

水稻白叶枯病菌harpin基因的克隆与表达

 用PCR方法从水稻黄单胞菌白叶枯致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo) JxoIII菌株中克隆到编码诱导植物过敏性反应激发子的基因hrfA。同源性比较发现其推测产物与水稻白叶枯病菌菲律宾小种Pxo86的Hpa1有97.2%的序列一致性,比Hpa1少了一个-GGG-GG-氨基酸残基序列重复。基因经NdeI和BamHI双酶切后连到含T7启动子的高表达载体pET 30a (+)上构建重组质粒pHRF4,并转化宿主菌BL21(DE3)产生表达菌株BLHR4。经过IPTG诱导之后,BLHR4产生一分子量为15.6 kD的蛋白质。研究表明,该蛋白在性质与功能上类似于其它已发现的harpins,即能够在烟草上引起典型的过敏性反应,富含甘氨酸、热稳定以及对蛋白酶敏感。因此,我们把该蛋白定名为harpin_Xoo。harpin_Xoo还具有诱导植物抗病性的功能。     

江汉平原水稻白叶枯病菌致病型的变异研究

 从水稻和稻田周围常见的10种杂草上来集梨孢属菌株,以涂沫法作交互接种,分离自牛筋草、狗尾草、法氏狗尾草、李氏禾、罗氏草、铺地黍、稗和马唐的梨孢菌与分离自水稻的梨孢菌可以交叉侵染其寄主,茭白和碎米莎草梨孢菌与稻梨孢菌不能交互侵染;自然诱发条件下来自牛筋草和狗尾草的梨孢菌与来自水稻的梨孢菌对其寄主同样发生交叉侵染。直接从杂草寄主上分离的梨孢菌株对水稻的致病性较弱,接种到水稻感病品种发病后再分离的菌株,对水稻致病性增强,对原寄主的致病性基本保持不变。推断稻瘟病区稻田周围牛筋草、狗尾草、法氏狗尾草、李氏禾、罗氏草、铺地黍、稗和马唐等杂草寄主上的梨孢菌在稻瘟病菌的积累和传播方面具有作用。     

水稻白叶枯病菌两类噬菌体性状的比较

 从感染白叶枯病的稻叶、种子和田水中先后分离到24株噬菌体,测定了它们在琼胶平板上形成噬菌斑的大小、血清学反应、热钝化温度、铁盐的钝化作用、寄主范围、一级生长曲线以及在电镜下观察它们的形态。根据测定结果,可将它们区分为两个类群。第一群称为XOP 1型,以OP-3为代表,其噬菌斑直径为3~5毫米,热钝化温度为58℃/10分钟,易为三价铁盐所钝化;寄主范围较窄;潜育期为40分钟,上升期30分钟,平均裂解量为35个。第二群称为XOP 2型,以OP-12为代表,噬菌斑小,热钝化温度68℃/10分钟,对三价铁盐不敏感,潜育期80分钟,上升期50分钟,平均裂解量为8个。它们都是蝌蚪形,但OP-3的尾部细长而不能收缩,OP-12的尾部短粗而能收缩。     

水稻白叶枯病菌毒性基因的克隆和功能分析

 通过DNA重组,用载体质粒pBR322和水稻白叶枯病菌(Xanthomonas campestris pv.oryzae Dye)毒性基因突变体XcoM3105带有转座子Tn5的毒性基因片段,构建了11.6kb的探针质粒pVIRl。用α-32P-dATP标记该探针,从构建在粘粒pSa747上的病菌野生型菌株JXO Ⅲ染色体基因文库中,通过菌落原位杂交和Southern杂交,筛选了8个毒性基因的克隆(pNAX3101~3108。将其中一个毒性基因克隆pNAX3103通过三亲交配接合法转移到XcoM3105中,接合频率为2.06×10^-7。功能互补分析表明,pNAX3103可以互补突变体XcoM3105,恢复致病性,同时也能互补其淀粉酶(Amy)活性表型,由原来的淀粉酶阳性恢复为阴性反应。因此可以认为,被克隆的毒性基因片段具有完整的致病功能,毒性基因与淀粉酶基因之间可能存在着某种负调控关系。     

水稻白叶枯病菌诱导水稻悬浮细胞防卫基因表达的初步研究

 以感病品系沈农103及其携带Xa-4抗病基因的近等基因系CBB₄为材料(均由中国农科院作物所章琦研究员惠赠)。