日本结缕草转基因技术研究进展

对日本结缕草离体植株再生及遗传转化研究进展进行了详细的综述，并简要讨论了应用转基因技术培育日本结缕草新品种的育种方向。     

中华结缕草组织培养与植株再生

以中华结缕草成熟胚为外植体,通过胚性愈伤组织的发生进行植株再生。结果表明,中华结缕草成熟胚在MS基本培养基附加6~7 mg/L 2,4-D和0.05 mg/L 6-BA的出愈能力很强,但初生愈伤组织呈无定型棉絮状,不能再生成株。采用不同的糖类和固化剂以及一定比例的生长素与细胞分裂素的方法,对初生愈伤组织进行继代培养,诱导出致密颗粒状的、具有高度再生能力的胚性愈伤组织,此类胚性愈伤组织在最佳分化培养基MS 1.0mg/L NAA 1.0 mg/L KT 3.00 mg/L 6-BA上有较高再生频率,生根培养基采用1/2 MS。     

结缕草研究进展

综述了国内外关于结缕草的研究进展,并提出今后我国结缕草的研究方向应该以育种和结缕草的繁殖机制为主。     

兰引3号结缕草组织培养研究

以兰引3号结缕草茎段为外植体,采用正交试验方法,研究了植物激素GA3,IBA和6-BA对兰引3号结缕草匍匐茎带芽茎段发芽,生根和生长的影响,结果表明:MS+GA30.5 mg/L+IBA 0.1mg/L是促进兰引3号结缕草试管苗茎段发芽,生根及生长的最优组合培养基,MS+GA31.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L是适宜兰引3号结缕草试管苗茎段发芽,生根和生长的较优组合培养基。     

结缕草酯酶同工酶的研究

以台湾原产中华结缕草、沟叶结缕草，山东原产中华结缕草，日本结缕草，日本原产日本结缕草和细叶结缕草共２０２个样品为材料，检验其酯酶同工酶谱。结果发现了２６条酯酶带，构成了１３０个酶谱类型，各酶带出现频率随草种和原产地而异，以各酶带出现的频率，利用尤克利氏距离公式算出各族群的距离，发现中华结缕草和沟叶结缕草间的距离最近，合成一群集，细叶结缕草和日本结缕草距离最远，各成一群集。以上结果表明，酯酶同工酶不     

结缕草主要居群营养器官比较解剖学研究

对我国20个居群结缕草营养器官形态解剖数量性状的变异进行了观测和统计分析.结果表明:(1)不同结缕草居群在营养器官的解剖结构方面没有显著的差异,但在解剖数量性状方面有着明显的差异;(2)结缕草个体间的差异存在于居群内每个个体的每个解剖数量性状中;(3)结缕草居群中各营养器官的变异主要来源各不相同,其中根和匍匐茎来源于居群间的变异为40.77%和49.69%,而叶片的变异有55.37%存在于居群间;(4)叶肉厚度、叶片厚度、叶片下表皮细胞厚度、叶片上表皮细胞厚度、叶片下表皮细胞长度5个主成分的累计贡献率达到了81.40%,可以代表原始因子所代表的全部信息,也是造成不同居群间结缕草解剖数量性状差异的主要因素.     

贵州南部地区结缕草引种观察

经过3年对3类11个品种的结缕草进行引种栽培试验,筛选出适应在贵州地区种植的结缕草有:结缕草中的De Anza、Crowne、Traveler、兰引“Ⅲ”号品种,沟叶结缕草中的Diamond和Cavalier品种。     

结缕草属植物RAPD反应体系的优化

为建立一个稳定的结缕草属植物RAPD-PCR反应体系,以结缕草种源Z111(Zoysia japonica Steud.)为实验材料,研究了模板DNA浓度、Taq酶、mg²⁺浓度、dNTP浓度、引物及扩增缓冲液浓度等各个主要因素对结缕草RAPD-PCR反应的影响,并分别对各项单因子进行优化。结果表明:总反应体积为20×L时,各反应物的适宜用量分别为模板DNA浓度30 ng、Taq酶1.0U、mg²⁺2.5 mmol/L、dNTP 0.19mmol/L、引物0.5×mol/L、10×buffer2.0×L;5种、1变种共20份结缕草种源材料验证,显示该体系扩增条带多、清晰结果稳定,表明该体系是一个适合结缕草属植物RAPD-PCR反应的体系。     

几种因素对日本结缕草愈伤组织诱导与生长影响的研究

研究了基本培养基、碳源、营养添加物、pH值、固化剂等几种因素对日本结缕草‘Qingdao’和‘Zenith’两个品种成熟种子为外植体诱导愈伤组织的影响。结果表明:蔗糖作为碳源、pH值5.4～6.0、以植物凝胶或脱乙酰吉兰糖作为固化剂有利于日本结缕草愈伤的诱导与生长,NMB培养基、NB培养基分别有利于Zenith及Qingdao胚性愈伤的形成;而营养添加物的加入虽可提高愈伤诱导率,却导致胚性愈伤率的下降。同时,根据愈伤组织生长曲线得出,愈伤组织最适继代周期为24～33天。     

结缕草ZjNAC基因的克隆与表达分析

NAC类家族的基因是植物特有的转录因子,并且它在植物的生长发育中发挥着重要的作用。本研究以结缕草为研究材料,对结缕草转录组数据库利用local blast的办法克隆出1个NAC类转录因子。为深入探讨和研究NAC类转录因子在植物逆境生理上的作用奠定基础。通过与水稻的OsNACs家族成员进行进化树分析,结合蛋白分析,QRT-PCR等的方式探索其生物学功能。实验结果表明,该基因长度为1496 bp,包含1个完整开放阅读框(ORF),长度为1332 bp,编码449个氨基酸,该蛋白含有1个NAM结构域。与水稻的NAC类转录因子家族的系统进化树对比发现,它与OsNAC036近缘性最高,因此将该基因命名为ZjNAC036。QRT-PCR结果显示,该基因在干旱情况下表达量呈上升趋势,并且干旱处理8 h的时候,差异倍数最大,达到了50倍左右,而在盐胁迫、低温胁迫下没有规律性变化。这表明ZjNAC036在干旱逆境生理上可能有重要的作用,而在高盐及寒冷的逆境生理方面可能作用不大。     

百脉根农杆菌快速高效遗传转化体系的建立

以百脉根品种“里奥”作为受体材料,以GUS基因为报告基因,研究了影响农杆菌介导的百脉根遗传转化的几种因素及表面活性剂(PEG 4000)、真空处理和乙酰丁香酮对提高转化效率的影响,建立了农杆菌介导的百脉根快速高效遗传转化体系,并获得了转基因抗性苗。结果表明,以子叶(带叶柄)为外植体,在OD600为0.5的菌液中,加入150 mg/L的PEG 4000,真空度6×10-2Pa,抽真空12 min,共培养3 d,转入含卡那霉素50 mg/L和羧苄青霉素300 mg/L的分化培养基中,约20 d后,50%的外植体分化不定芽,生根成苗。PCR初步检测表明有83%的植株为GUS阳性,转化率约为42%。     

日本结缕草ZjTCP20基因生物信息学及表达模式分析

TCP是高等植物所特有的一类转录因子,参与调控植物的生长发育、衰老及逆境应答等多个生物学过程。本研究从日本结缕草(Zoysia japonica)中克隆出ZjTCP20基因,并对该基因进行生物信息学分析、自激活检测、表达模式分析等来探究该基因特性。ZjTCP20基因完整编码区为624 bp,编码208个氨基酸。ZjTCP20蛋白无信号肽,具有疏水性,系统发育进化树结果显示其与玉米(Zea mays)ZmTCP20亲缘关系最近。亚细胞定位显示该蛋白定位于叶绿体、细胞质和细胞核上。ZjTCP20基因表达模式结果显示,该基因在幼嫩叶片中大量表达,随植物发育表达量逐渐减少,但茉莉酸甲酯(MeJA)等3个激素对基因的表达量没有显著影响。酵母自激活试验显示ZjTCP20具备自激活活性。本研究为进一步研究ZjTCP20基因提供了科学依据。     

结缕草种子(颖果)解除休眠前后的颖显微结构

对解除休眠前的结缕草种子通过扫描电镜观察,发现颖结构致密,其上覆盖一层脂类物质。在平行的颖脊上有整齐排列的颖孔,这些颖孔均被Si质的颖孔盖所覆盖。经过处理,解除休眠后,脂类物质及颖孔盖脱落,颖孔被打开,构成颖的纤维网络清晰可见,种子内外的水、气交换可顺利进行,减少胚生长的阻力,发芽率达到潜在生活力水平。经过牛胃消化排出的结缕草种子,颖结构的形态变化及发芽率与人工处理的结果基本相同。     

日本结缕草ZjNOL基因的克隆及转录自激活检测

NYC1-like(NOL)编码的短链氧化还原酶是叶绿素b降解的必需酶。对日本结缕草(Zoysia japonica)ZjNOL基因全长克隆结果显示,该基因开放阅读框为981个核苷酸,编码327个氨基酸。生物学分析显示,ZjNOL蛋白与高粱(Sorghum bicolor)中的NOL蛋白的亲缘关系最近。利用pGBKT7载体,通过DNA重组技术成功构建pGBKT7-ZjNOL酵母表达载体,通过PEG介导的转化方法,成功导入Y2HGold酵母中,自激活检测显示含有pGBKT7-ZjNOL的Y2HGold酵母细胞能够在SD/-Trp培养基上正常生长,而在SD/-Trp/AbA培养基上不能生长,也不能在含有X-α-Gal培养基显蓝色,证明ZjNOL蛋白没有自激活活性。生物信息学分析及转录自激活检测有助于深入研究ZjNOL基因功能,为延长结缕草绿期,改善结缕草坪用质量奠定基础。     

结缕草肌动蛋白基因全长cDNA的克隆及序列分析

根据植物肌动蛋白(Actin)基因编码区的保守序列设计引物,提取结缕草叶片的总RNA,进行RT-PCR。并采用RACE技术扩增出1560bp的Actin基因全长cDNA序列。序列分析表明,该基因的开放阅读框(ORF)为1134bp,编码377个氨基酸,5′非编码区117bp,3′非编码区309bp。所得序列与GenBank中收录的其他植物肌动蛋白核苷酸序列的一致性均在85%以上,氨基酸序列的一致性高达97%以上。将其命名为ZjACT,GenBank登录号为GU290545。根据高等植物肌动蛋白相似性构建的系统进化树显示,结缕草肌动蛋白与大麦和圆锥小麦肌动蛋白之间的亲缘关系最为密切,在进化中分化时间最为接近。进一步分离克隆了结缕草Actin基因的基因组DNA序列(登录号GU290546),它由4个外显子和3个内含子组成。本研究有助于揭示植物Actin基因家族的进化历史,为研究植物Actin基因家族功能和进化上的多样性奠定理论基础,同时也为开展草坪草和牧草Actin基因的功能分析和利用研究提供参考。     

结缕草肉桂醇脱氢酶基因家族全基因组序列鉴定和表达分析

肉桂醇脱氢酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase, CAD, EC 1.1.1.195)是植物木质素合成途径的关键酶,通过消耗NADPH,将松柏醛等复杂醛转化成相应的醇单体,在植物生长发育过程和逆境应答中起到重要作用。本研究从结缕草基因组中鉴定获得了16个肉桂醇脱氢酶(ZjCAD)基因,对其进行了系统进化与基因结构的生物信息学分析。半定量PCR分析显示5个ZjCAD基因在叶片中特异表达,木质素染色结合不同种源材料ZjCAD基因的表达分析进一步表明ZjCAD6的表达与叶片木质素含量正相关,提示ZjCAD6可能为控制结缕草叶片木质素合成的关键基因。ZjCAD6基因全长2736 bp,有3个内含子和4个外显子,开放阅读框为1074 bp,编码357个氨基酸。ZjCAD6蛋白含有两个Zn²⁺结合位点与一个NADP(H)结合结构域,与已报道的其他植物具催化活性的CAD蛋白特征一致。上述结果为进一步研究结缕草叶片木质素含量及其机械强度等性状形成的分子机理提供了重要的参考。