卡那霉素对小黑杨花粉植株叶片分化及试管苗生根的影响

探讨了卡那霉素对小黑杨花粉植株叶片分化及试管苗生根的影响。确立了由农杆菌介导的的小黑杨花粉植株遗传转化研究中转化体的筛选浓度,其中叶片转化筛选阶段卡那霉素的浓度为:20 mg.L-1～40mg.L-1;抗性芽生根培养阶段卡那霉素的浓度为20 mg.L-1。     

美洲黑杨遗传转化系统优化的研究

 研究了影响根癌农杆菌（Agrobaterium tumefaciens Conn）介导的美洲黑杨遗传转化的若干因素,建立了美洲黑杨简单、高效的遗传转化系统,获得了大量转基因植株。结果表明：外植体预培养3d,菌液浓度OD600值为0.4~0.6的农杆菌中侵染20min,共培养3d为最佳遗传转化系统,转化率最高时可达10.0%。同时发现选择带叶柄的叶片作为转化受体,转化频率也有明显提高且不同分化培养基的配方对美洲黑杨的转化效果也有一定影响。     

根癌农杆菌介导转录因子CBF1基因对菊花的转化

利用根癌农杆菌介导法对菊花品种'小金黄'叶片进行遗传转化,研究影响菊花转化的若干因素,建立一套高效的遗传转化体系.结果表明:2 d的预培养,OD600值约为0.5的农杆菌菌液添加50 mg/L AS,侵染时间3 min,2 d的共培养,从分化培养基获得的抗性芽在生根培养基MS+0.4 mg/L NAA+10 mg/L Km+100 mg/L Cef上进行延迟筛选,有利于获得较高的转化效率.PCR检测表明,CBF1基因已整合到菊花基因组中,共获得18株转基因植株,在抗性株系中PCR阳性率为36.7%.     

影响草莓遗传转化率的因子及转CBF1基因植株的获得

以草莓试管苗的叶片为外植体,经农杆菌介导将抗逆相关转录因子CBF1基因转入草莓基因组.探讨酚类物质、农杆菌菌液浓度、侵染时间、预培养时间、共培养时间及选择方式等对草莓转化效率的影响,建立草莓遗传转化体系.在黑暗条件下预培养2～4 d,再用浓度OD6000.3～0.5的菌液侵染3～5 min后共培养2 d,将外植体先接到含有500 mg/L Cef的诱导培养基上进行培养,14 d后再转接到含有选择压20 mg/L Kan和500 mg/L Cef的诱导培养基上进行选择培养,得到卡那霉素抗性草莓植株.经PCR检测证实CBF1基因已整合到草莓基因组中.     

根癌农杆菌法转化康乃馨的条件探索

[目的]为构建高效的康乃馨遗传转化体系奠定基础。[方法]以康乃馨叶片为受体材料,通过抗G418筛选,探讨预培养时间、根癌农杆菌菌液浓度、共培养时间等因素对根癌农杆菌介导康乃馨遗传转化的影响。[结果]20 mg/ml G418是康乃馨叶片转化的适宜浓度。随着预培养时间的增加,康乃馨叶片的存活率降低,预培养2~3 d时抗性芽分化率较高。当根癌农杆菌OD600为0.5~0.8时,抗性芽分化率较高,适合康乃馨转化。共培养2~3 d时,康乃馨叶片生长状态好,抗性芽分化率最高。[结论]预培养、共培养各2~3 d,菌液浓度OD600为0.5~0.8是根癌农杆菌介导康乃馨遗传转化的适宜条件。     

根癌农杆菌介导烟草K326遗传转化体系优化

[目的]优化根癌农杆菌介导烟草K326遗传转化体系。[方法]以烟草无菌苗的叶片为外植体,通过农杆菌介导法对其遗传转化体系进行了优化研究。[结果]外植体在MS＋2 mg/L6-BA＋0.2 mg/L IAA培养基上进行2 d预培养后,用农杆菌GV3101（浸染浓度为OD600=0.6）浸染5 min,转化效率最高,达63%;经过PCR检测初步证明npt II基因已整合到烟草再生植株中。[结论]该研究建立了高效烟草K326叶片农杆菌介导的遗传转化体系。     

根癌农杆菌介导烟草K326遗传转化体系优化

[目的]优化根癌农杆菌介导烟草K326遗传转化体系。[方法]以烟草无菌苗的叶片为外植体,通过农杆菌介导法对其遗传转化体系进行了优化研究。[结果]外植体在MS＋2mg/L6-BA＋0.2mg/LIAA培养基上进行2d预培养后,用农杆菌GV3101（浸染浓度为OD600=0.6）浸染5min,转化效率最高,达63%;经过PCR检测初步证明nptII基因已整合到烟草再生植株中。[结论]该研究建立了高效烟草K326叶片农杆菌介导的遗传转化体系。     

洋桔梗Double Mariachi Rink高效遗传转化体系的建立

以洋桔梗品种Double Mariachi Pink为供试材料,探讨影响根癌农杆菌介导法遗传转化的一些因素,包括Cb(羧苄青霉素)脱菌浓度、Km(卡那霉素)筛选浓度、农杆菌的侵染浓度和预培养时间等.研究结果表明:脱菌培养基中Cb的浓度为200mg/L时,抑制农杆菌生长但不显著影响叶片不定芽分化;不定芽分化阶段和生根阶段的适宜Km筛选浓度分别为30mg/L和15mg/L;外植体预培养3d,在D600nm≈0.5的农杆菌菌液中侵染10 min后,Km筛选得到的抗性植株GUS染色蓝斑率最高,达到86.7%.     

英国薰衣草叶盘遗传转化体系的创建

[目的]以英国薰衣草叶片为材料,创建稳定高效的农杆菌介导薰衣草的遗传转化体系.[方法]未经预培养的英国薰衣草叶片,在OD600=0.4的根癌农杆菌菌液中浸染10 min,共培养1d后,在Cef抑菌浓度为300 mg/L、Kan筛选浓度为30 mg/L的选择培养基上诱导芽分化,抗性芽在Kan浓度为10 mg/L生根培养基上诱导生根.[结果]对筛选得到的65株抗性苗进行PCR检测,获得2株阳性植株,转化率达到3.00;.[结论]建立了稳定高效的农杆菌介导英国薰衣草的遗传转化体系.     

根癌农杆菌介导的芪合酶基因转化烟草遗传体系的优化

【目的】研究根癌农杆菌介导的芪合酶基因转化烟草遗传体系的优化条件。【方法】以"中烟99"叶片为受体,采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,GV3101)介导法,将芪合酶基因导入烟草基因组,并对其遗传体系进行了优化,对筛选获得的转基因烟草植株进行检测。【结果】根癌农杆菌介导的芪合酶基因遗传转化的最佳条件为:将预培养2 d的烟草外植体,用稀释10倍的GV3101菌株菌液(OD600=0.6)浸染8 min后,共培养3 d,然后转入含卡那霉素(Km)50 mg/L和羧苄青霉素(Cb)500 mg/L的筛选分化培养基上诱导分化,待抗性芽长到2~3 cm后,转入含Km 50 mg/L和Cb 500 mg/L的筛选生根培养基上进行筛选,在以上最佳遗传转化条件下,初步筛选到54株转化体,经PCR和RT-PCR检测获得25株转化烟草植株。【结论】经卡那霉素筛选、PCR、RT-PCR检测后,初步证明芪合酶基因已被整合到烟草基因组中,并可以正常转录。     

农标菌介导的花椰菜遗传转化体系研究

以花椰菜栽培品种“春秋”无菌苗的子叶和下胚轴为外植体 ,在携带 Ca MV Bari- 1基因 的根癌农杆菌菌种 GV310 1的介导下 ,对影响花椰菜遗传转化的诸因素进行了研究 ,建立了较为完善的转化体系 ,其转化率分别达 2 .31%和 2 .5 6 %。在这一转化体系中 ,首先将过夜培养的农杆菌用 MS无机盐液体培养基稀释 5倍或 10倍 ,感染经 2～ 3d预培养的子叶和下胚轴外植体 30 s,然后进行黑暗共培养 1d,外植体经表面灭菌后转接到含 5 0 0mg/ L 羧苄青霉素的分化培养基上。 3周后 ,将分化的不定芽切成 0 .5 cm见方的小块 ,接种在选择培养基上 ,经筛选的转化芽再诱导成苗     

根癌农杆菌介导欧美杨108遗传转化体系的优化

[目的]优化根癌农杆菌介导的欧美杨108遗传转化体系。[方法]以欧美杨108无菌苗的叶片为外植体,通过农杆菌介导法对其遗传转化体系进行优化研究。[结果]试验获得的优化转化体系如下:农杆菌介导欧美杨108遗传转化的潮霉素最佳叶片分化浓度为2mg/L,生根浓度为1 mg/L。优化筛选的最适转化条件为:预培养48 h,菌液浓度OD600为0.4,侵染15 min,共培养48 h。试验共获得18个抗性愈伤和抗性芽,转化频率为4.3%;经PCR检测初步证明TCS基因已整合至欧美杨108再生植株中。[结论]该研究建立了高效欧美杨108叶片农杆菌介导的遗传转化体系。     

农杆菌介导仙客来遗传转化体系的建立

采用根癌农杆菌介导法,研究Mn-SOD基因转化中影响仙客来品种"鲜红1011"叶片转化效率的多种因素,建立仙客来遗传转化体系.结果表明:以叶片为受体材料,培养基中加入50 mg/L Kan(进行抗性筛选),500 mg/L Cef(脱菌),叶片经2 d的预培养,以OD600值为0.4～0.6的菌液侵染5～8 min,共培养3 d有利于仙客来叶片的遗传转化.     

油菜农杆菌介导转化体系的优化

以甘蓝型油菜湘油15号为试验材料,对农杆菌转化体系中外植体预培养时间、培养基中AgNO_3浓度、农杆菌侵染时的菌液浓度、共培养基pH值等进行了优化研究,确立了优化的遗传转化条件。结果表明,外植体在农杆菌侵染和共培养前预培养3 d,可明显提高子叶外植体和下胚轴外植体出愈率和抗性芽苗分化率,有利于获得较高的转化效率;在基因转化中,AgNO_3的最佳使用浓度为30μmol/L,最佳的农杆菌侵染菌液OD_(600)为0.4,共培养基pH值5.4是油菜农杆菌介导转化中优化的转化条件。     

美洲商陆遗传转化体系的构建

在已构建高频再生体系的基础上,研究构建美洲商陆遗传转化体系的条件.结果表明:250 mg/L头孢霉素既能有效抑制根癌农杆菌的增殖,且对不定芽分化影响相对较小;美洲商陆对潮霉素高度敏感.美洲商陆的遗传转化过程为:无菌苗上部经增粗培养后,取茎节在不定芽分化培养基(ABDM)中预培养5d,在D600nm为0.6的菌液中侵染3 ～5 min,再转接到ABDM中黑暗、26℃共培养3d;然后外植体经冲洗后转接至含250 mg/L头孢霉素的ABDM中进行脱菌、分化以及不定芽伸长培养;待不定芽长至2 cm以上时,截取并转接到含3 mg/L潮霉素的生根培养基中进行抗性芽筛选,筛选出的抗潮霉素植株再经GFP显色、PCR、分子杂交等方法进一步阳性确认.     

农杆菌介导甜橙遗传转化的初步研究

为改良柑桔品种，以普通溆浦甜橙（Citrussinensiscv Xupu）实生苗上胚轴为外植体，建立了农杆菌介导的遗传转化体系，并把chit42基因和phyB基因导入其中．上胚轴经农杆菌工程菌液浸染后，在共培培养基（MS＋3mg／LBA）上培养3d，然后分别转移到含有100mg／L Kan（卡那霉素，Kanamycin）和500mg／L Cef（头孢噻肟霉素，Cefotaxime）的选择培养基上培养14d后，上胚轴开始分化抗性芽，chit42基因和phyB基因的抗性芽再生率分别为27．8％和35．6％．将抗性芽在筛选培养基上培养30d后用茎尖微芽嫁接成苗．目前，嫁接苗在温室中生长良好，经PCR鉴定为转化植株．     

超声波辅助农杆菌转化OT百合‘罗宾娜’的研究

【目的】通过超声波处理辅助农杆菌转化OT百合小鳞片,提高农杆菌介导法转化百合的效率。【方法】以OT百合‘罗宾娜’(Lilium tenuifoliumoriental×tumpet‘Robina’)的再生小鳞片为外植体,分别以80W功率的超声波处理1,2,3,4,5min,通过超声波处理辅助根癌农杆菌进行外源基因的转化,同时以未进行超声波处理为对照;利用GUS组织化学法,分别检测转化脱菌后筛选培养7d的外植体和筛选培养60d后形成的潮霉素抗性再生植株叶片、小鳞片、根系的GUS瞬时表达和稳定表达,提取潮霉素抗性植株基因组DNA进行GUS和HPT基因的PCR扩增分析。【结果】超声波处理的农杆菌介导转化的百合外植体经GUS组织化学染色,多数可见蓝色斑点,且以3min超声波处理的蓝色最深;3min超声波处理的外植体对潮霉素的抗性率最高达48.85%,未经超声波处理的仅为15.56%,二者差异达显著水平。从53个潮霉素抗性再生植株的DNA样品中扩增得到了GUS基因和HPT基因的扩增片段,其中超声波处理3min的PCR阳性植株转化率最高,为28.30%,而未进行超声波处理的PCR阳性植株转化率仅为5.66%,初步证明外源基因可能整合到百合基因组中。【结论】20℃条件下80W功率超声波处理3min,可以有效提高农杆菌介导法转化OT百合的效率。     

CYcD2基因转入丽格海棠研究

[目的]改变丽格海棠的开花时间,为丽格海棠分子育种奠定基础。[方法]以丽格海棠叶片为外植体,利用液氮直接转化法将pBI121-CYcD2转入根癌农杆菌EHA52中,再通过农杆菌介导法将CYcD2基因导入丽格海棠中。[结果]选择100 mg/L的卡那霉素作为转化外植体的起始选择压力。将经农杆菌共培养及过渡培养后的材料转入筛选培养基中,60 d后获得15个不定芽,再在生根培养基中培养20 d后,全部生根。PCR检测发现,15株卡那霉素抗性植株中有6株表现出与阳性对照相同的特异性条带,剩余植株为假转化体。Southern杂交分析表明6个转化植株中有5个出现了杂交信号,即为转基因植株,仅有1个为假阳性。[结论]该研究已成功地将外源基因CYcD2转入丽格海棠受体中。     

应用cre/lox植物表达载体的AtNHX1基因转化杨树研究

[目的]研究Na^＋／H^＋逆向转运蛋白AtNHXl基因对杨树的转化。[方法]以杨树南林895杨的叶片作为外植体,采用根癌农杆菌介导法,构建cre／lox植物表达载体,并对3株转基因植株进行PCR分子检测。[结果]结果表明,较适合的转化条件为：外植体在分化培养基上经过2d预培养后于0D600nm值为0．3～0．4的菌液中浸泡7min,卡那抗性绿苗率可达43．9％;PCR分子检测表明,目的基因已经整合到杨树基因组中。[结论]该系统可以应用于杨树的基因工程研究。     

秦烟遗传转化体系的优化

【目的】优化烟草的高效遗传转化体系。【方法】以陕西地区广泛种植的烟草品种秦烟98为试材,采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,LBA4404)介导法,将从酿酒酵母细胞中克隆到的具有较强耐盐表型的HAL1基因进行遗传转化,对农杆菌介导的遗传转化条件及其影响因素进行研究。【结果】用50 mg/L卡那霉素(Kan)筛选转化外植体用800 mg/L羧苄青霉素(Cb)除菌可以获得理想的筛选和除菌效果。以优化的农杆菌介导烟草叶片的遗传转化条件为:将未经过预培养(预培养0 d)的外植体用稀释150倍的农杆菌菌液(OD600=0.5)浸泡1min,转至MS1培养基上共培养48 h,用无菌水冲洗后于体积分数2%NaClO中浸泡15 min,用无菌水冲洗4~5次,置800 mg/L Cb+质量分数0.1%的甘露醇中浸泡约12 h除菌。【结论】获得了农杆菌介导烟草叶片遗传转化的最佳优化条件,有效地减少了外植体的污染率,提高了抗性芽分化率。