禽流感病毒KMI/99(H9N2)HA和NA基因的序列分析

研究分别以自行设计的一对简并引物和另一对普通引物，经RT－CR，一次性成功地扩增禽流感病毒A／Chicken/Guangxi/KMI/99(H9N2）HA全和基因cDNA和NA全长基因cDNA，并将它们克隆于pGEM-T Easy的T－T窗口，首次报道了该毒株的HA全基因和NA全基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列，测序结果显示，该毒株的HA基因全长为1683bp，编码560个氨基酸。NA全长为1398bp，编码466个氨基酸残基。研究发现其HAI羧基端的分子特征是：R－S－S－R。从分子水平推论。A/Chicken/Guangxi/KMI/99(H9N2)属于非高致病力毒株。研究还发现NA蛋白于63－65位缺失了T、E、I三个氨基酸。     

10株H9N2亚型禽流感病毒HA和NA基因的序列分析

为了从分子水平上掌握我国H9亚型禽流感的变异情况和流行规律,本研究汇集近年来从我国部分省市养殖场分离的10株禽流感H9N2亚型毒株,采用RT-PCR技术对其HA和NA基因进行扩增、克隆和测序,并对所得全序列进行同源性和遗传进化分析。结果显示,本试验分离到的10株病毒的HA和NA基因变异程度不大,变异概率大;在遗传进化树中均属于欧亚分支中的类CBJ194亚分支,与CBJ194的HA基因核苷酸同源性在88.8%~95.8%,NA基因核苷酸同源性在93.4%~97.6%,可能与CBJ194由同一毒株进化而来。由于基因突变使ACHB101毒株的HA基因出现了新的糖基化位点,ACHN102毒株的保守受体结合位点发生变异。NA基因推导氨基酸序列中第63、64、65位有T、EI、3个氨基酸的缺失,导致61位糖基化位点的丢失。唾液酸吸附位点上有明显的突变。HA和NA基因的变异可能与频繁的疫苗免疫选择压力有关。     

禽流感病毒H9N2亚型西藏分离株HA和NA基因的克隆与序列分析

为了从分子水平上掌握西藏各地区H9亚型禽流感病毒的遗传进化情况及其与国内外H9亚型禽流感病毒的变异情况和流行规律之间的关系,作者选择了2009年不同时间从西藏部分地市养殖场分离的3株禽流感H9N2亚型毒株,采用RT-PCR技术对其HA和NA基因进行扩增、克隆和测序,并对所得全序列进行同源性和遗传进化分析。结果显示,3株西藏分离病毒之间的HA和NA基因变异程度不大,同源性达到98%以上,在遗传进化中均属于欧亚分支中的类Bj/94亚分支,3株西藏分离毒的HA基因与Bj/94的同源性在核苷酸水平为88.7%～88.8%,在氨基酸水平为93.4%～93.6%;NA基因与Bj/94的同源性在核苷酸水平为92.7%～93.0%,在氨基酸水平为93.4%～94.0%;3株西藏分离毒株可能与Bj/94由同一毒株进化而来。由于基因突变使Tb/1毒株的HA基因在313位出现了1个新的糖基化位点,Tb/4毒株的NA基因缺失了146位的糖基化位点;唾液酸吸附位点上有明显的突变;HA的裂解位点附近和NA基因的受体结合位点区域内都有氨基酸突变。HA和NA基因的变异可能与适应高原缺氧、高海拔等特殊气候环境有关。     

福建省H9N2亚型禽流感病毒HA和NA基因的进化分析

为进一步了解福建省H9N2亚型禽流感病毒的基因遗传进化关系,本研究将福建省2011年分离的毒株FZ-04、FZ-11与GenBank上登录的2000～2011年福建省分离的H9N2毒株及国内外典型代表株进行HA、NA基因的序列比对和遗传进化分析。结果表明,分离株FZ-04和FZ-11的HA基因与CK/FJ/G9/09株核苷酸同源性最高,属于国内常见的CK/BJ/1/94亚系。HA裂解位点处的氨基酸序列为-PSRSSR/GL-,符合低致病性禽流感病毒的分子特征。NA基因在遗传进化关系上呈现独立的分支,与CK/FJ/10954/05毒株核苷酸序列同源性最高,属于CK/HK/G9/97亚系,且NA基因推导的469个氨基酸序列中没有缺失。同时,从HA和NA基因的遗传进化树上可知,2000～2011年福建省H9N2禽流感病毒进化相对比较稳定,可能有一个共同的起源。     

H5N1亚型禽流感病毒新疆株HA基因的克隆及序列分析

参照已发表的H5N1亚型禽流感的HA基因序列,设计了1对引物,对禽流感病毒新疆株A/Duck/XJ/3(H5N1)、A/Duck/XJ/4(H5N1)、A/CH/XJ/5(H5N1)、A/Goose/XJ/10(H5N1)和A/Duck/XJ/11(H5N1)进行RT-PCR扩增和克隆,获得了5个毒株的HA全长核苷酸序列,分别为1 779 bp、1 774 bp、1 776 bp、1 758 bp和1 740 bp序列分析表明,在HA切割位点处均有多个连续的碱性氨基酸(-R-E-R-R-R-K-K-R-)插入,具有高致病性禽流感病毒的特征.同源性分析表明,新疆分离株之间的核甘酸同源性在96.9%～98.8%;与来自青海湖斑头雁、广西天鹅、香港白鹭和台湾鸽等不同野禽毒株同源性为95.7%～100%;与来自香港、越南、浙江的人源禽流感毒株的同源性为95.2%～98.2%.     

14株H9N2亚型禽流感病毒分离株的HA和NA基因序列分析

为了解浙江省H9N2亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因的分子特征和遗传变异情况,本试验对2012—2021年分离到的14株H9N2亚型AIV分离株进行HA和NA基因序列测定和分析。结果显示：14株分离株的HA和NA基因均属于Y280分支,HA核苷酸同源性为91.5%～99.4%,NA核苷酸同源性为89.0%～98.7%,其与疫苗株CK/SS/94、CK/F/98、CK/6/96和CK/1/00的HA核苷酸同源性为86.0%～91.1%。14株分离株HA蛋白裂解位点氨基酸组成均为RSSR↓GLF;受体结合位点主要表现为K141N、A142T、T155N、H183N和V190T突变,其中第226位和第228位全部为L和G,可与α-2,6唾液酸受体结合,具有感染人的特性;蛋白潜在糖基化位点均为6个,主要变异表现在第200～202位1个位点缺失和第295～297位1个位点增加;抗原相关位点主要表现为G82E、S137D、D145G、N159G、A160D、T192R和N193D突变,此外,有5株出现D160N突变。14株分离株NA蛋白存在6个潜在糖基化位点,其中1株...     

猪流感病毒H9N2亚型济南株HA、NA基因的克隆与序列分析

根据GenBank中流感病毒H9N2亚型HA基因与NA基因序列,分别设计扩增HA基因与NA基因的特异性引物,用RT-PCR方法扩增猪流感病毒H9N2济南株(SW/SD/JT/07)HA基因和NA基因,分别将RT-PCR扩增产物克隆入pMD18-T载体,进行测序分析。结果表明,SW/SD/JT/07 HA基因长度为1701bp,编码566个氨基酸,HA0切割位点序列为R-S-S-R-G,属非高致病性毒株;HA蛋白有8个糖基化位点,与参考毒株糖基化位点数一致;HA蛋白有5个受体结合位点,其中在190位氨基酸与其余参考毒株存在差异。SW/SD/JT/07 NA基因长度为1413bp,编码470个氨基酸,NA蛋白基质结合部与参考毒株一致,高度保守;NA蛋白有5个抗原位点,在325位为D其余参考毒株均为N,SW/SD/JT/07与DC/HB/W1/04,CK/GS/2/99在398位为E,其余参考毒株为D或N;SW/SD/JT/07 NA蛋白与CK/SH/F/98,DC/HB/W1/04,CK/GS/2/99,SW/GD/WXL/04,SW/SD/W4/03,SW/YN/Simao2/07一样在茎区63,64,65位发生氨基酸缺失。SW/SD/JT/07 HA基因与参考毒株的同源性82.5%～98.6%,NA基因与参考毒株的同源性82.2%～99.1%。SW/SD/JT/07 HA基因与NA基因系统发生树分析表明,SW/SD/JT/07与AIV H9N2亚型亲缘关系密切。     

山东部分地区H9N2亚型禽流感病毒分离鉴定及HA和NA基因的遗传进化分析

为了解山东省H9亚型禽流感病毒变异情况和流行规律,于2013年从山东省潍坊、淄博、青岛、临沂、济南、滨州和烟台等地区疑似禽流感病鸡病料中分离到14株病毒,通过病毒分离培养、血凝与血凝抑制试验、RT-PCR技术进行了鉴定,并对获得病毒的HA基因和NA基因序列进行了同源性和遗传进化分析。结果显示,分离病毒均能凝集鸡的红细胞并能被禽流感病毒H9标准阳性血清抑制,RT-PCR方法从分离株中扩增出HA基因和NA基因保守片段,序列比对表明分离株与山东日照分离株A/Chicken/Rizhao/853/2013(H9N2)具有较高同源性,达94.4%以上,证实分离毒株为H9N2亚型禽流感病毒。HA裂解位点处的氨基酸序列为-PSRSSR/GL-,符合低致病性禽流感病毒的分子特征。HA、NA基因遗传进化分析表明,分离株与代表株DK/Y280/97亲缘关系最近,核苷酸同源性分别达90.3%和93.6%以上,属于国内常见的CK/BJ/94分支中的Y280-like亚分支。     

禽流感病毒H9N2河北分离株HA和NA基因的遗传进化分析

为了从分子水平上研究禽流感病毒H9N2河北分离株及其与经典H9N2参考毒株基因的相应序列的同源性和遗传进化关系,试验选用2008年分离自河北省张家口市某鸡场的蛋鸡H9N2,采用RT-PCR分别扩增分离株HA和NA基因片段cDNA,并对所得序列进行同源性比较和遗传进化分析。结果表明:与经典参考毒株A/Duck/HongKong/G1/97、A/Duck/HongKong/Y439/97、A/Duck/HongKong/Y280/97和A/Chicken/Beijing/1/94之间核苷酸、氨基酸同源性分别为89.7%～97.2%、88.5%～96%和91.0%～95.8%、89.8%～96.0%。禽流感病毒H9N2河北分离株属于欧亚谱系中的类Y280-like分支,与中国最早的分离株A/Chicken/Beijing/1/94相距较远。说明禽流感病毒H9亚型随着流行时间而发生了遗传分化。     

H5N1亚型禽流感病毒新疆株NA基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术对3株H5N1亚型高致病性禽流感病毒新疆株的NA基因进行了扩增,分别得到了3个毒株的NA基因,序列分析表明,3个毒株NA的全长核苷酸序列均为1 380 bp.同源性分析表明,3个分离株之间的核苷酸同源性在95.1%～97.9%之间;与来自青海、浙江、广东、东南亚等不同地区水禽禽流感病毒毒株的同源性为90.3%～98.8%;与分离自香港、浙江、越南等地区的流感病毒同源性为86.7%～97.9%.     

1株H6N6亚型禽流感病毒贵州分离株HA和NA基因克隆与序列分析

为了解 H6亚型禽流感病毒(AIV)在贵州地区的流行情况,本研究对2014年从贵州省三穗鸭体内分离鉴定出的1株H6N6亚型AIV (A/duck/Guizhou/013/2014) HA和NA基因进行了克隆和序列分析。结果显示,A/duck/Guizhou/013/2014的HA基因与华东地区2009年鸭源H6N6亚型AIV同源性最高,达97.5%,HA蛋白裂解位点的氨基酸序列为P-Q-I-E-T-R-G,符合低致病性AIV的分子特征;而NA基因则与福建2007年鸭源H6N6亚型AIV同源性最高,达98.2%;由遗传进化树分析结果可知,HA和NA基因在遗传进化关系上,与湖南毒株位于同一分支,而与2007年贵州分离的3株H6N6亚型AIV不处于同一分支,说明A/duck/Guizhou/013/2014与本地区的H6N6亚型AIV亲缘关系较远。本研究结果表明当前贵州地区H6N6亚型AIV存在明显的遗传多样性。     

Cloning and Sequence Analysis of HA and NA Genes of One Strain of H6N6 Subtype Avian Influenza Virus Isolated from Guizhou Province

To investigate the epidemic situation of H6N6 subtype avian influenza virus (AIV) in Guizhou province,A/duck/Guizhou/013/2014 was isolated from Sansui duck in live poultry market of Guizhou in 2014,the hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) genes of DK/GZ/14 were subjected to clone and sequence analysis.The results showed that HA gene had the highest nucleotide homologies (97.5%) with the duck-origin H6N6 subtype AIV isolated from Eastern China in 2009,and the strains of HA gene proteolytic cleavage sites was P-Q-I-E-T-R-G,which accordeol with the molecular characteristic of low pathogenic AIV (LPAIV).However,NA gene of A/duck/Guizhou/013/2014 had the highest nucleotide homologies (98.2%) with the duck-origin H6N6 subtype AIV isolated from Fujian in 2007.The phylogenetic tree showed that A/duck/Guizhou/013/2014 and Hunan strains located in the same branch,while three duck-origin H6N6 subtype AIV isolated from Guizhou in 2007 and A/duck/Guizhou/013/2014 located in the different branch for HA and NA genes in genetic evolution,which suggested that A/duck/Guizhou/013/2014 was far with the local H6N6 subtype.The results also clearly indicated that duck-origin H6N6 subtype AIV had genetic diversity in duck population in Guizhou.     

H9N2亚型禽流感病毒NA和M2基因的克隆与表达

旨在分别构建NA蛋白和M2蛋白的重组质粒,并进行表达鉴定。采用PCR扩增了H9N2分离株A/chicken/Shandong/LY1/2017毒株的NA基因和M2基因。同源性分析证实,这2个基因序列与目前流行毒株的基因同源性很高。将NA基因克隆至pcold1原核表达载体,将M2基因克隆至pET28a原核表达载体,成功构建了pcold1-NA和pET28a-M2重组质粒,并成功表达出相应的融合蛋白。然后对表达的融合蛋白进行纯化,并采用免疫印迹验证其免疫反应性。本试验为进一步研究H9N2亚型禽流感病毒致病机制及检测技术奠定了基础。     

H9亚型禽流感病毒钦州株HA基因的克隆与遗传进化

采集钦州活禽交易市场的鸡气管和泄殖腔的棉拭予样品,用H9亚型分型引物进行PCR初步筛选,阳性样品经SPF鸡胚尿囊腔接种分离病毒,通过RT-PCR方法扩增HA基因,并将其克隆到pMD—18T载体后进行序列测定和分析。结果表明,获得1株H9亚型禽流感病毒命名为：A／Chicken／Guangxi／qz40／2009（简称qz40）。测序结果表明qz40的HA基因片段全长1683bp,编码560个氨基酸;序列同源性比较结果表明,该毒株与参考毒株的核苷酸序列同源性为82．8％．99．9％,推导氨基酸同源性为87．5％．99．6％;HA基因的裂解位点氨基酸顺序为RSSRIGLF,为低致病性毒株;含有7个潜在的N-糖基化位点,其中5个位于HAl部分、2个位于HA2部分;基于H9亚型HA基因的进化树分析表明,qz40株属于欧亚种系的A／Chicken／Beijing／1／94（Ck／Bei—like）群系。     

H7N2禽流感病毒分离株血凝素蛋白全基因的序列分析

为进一步分析H7N2禽流感病毒（AIV）分离株血凝素（HA）基因的特性,参照已发表序列设计了1对引物,采用RT-PCR获得了1条约1.7 kb的DNA片段,测序后进行了同源性比较、HA基因系统发育进化树分析和氨基酸编码分析.结果表明,所测的2个分离株的HA基因全长1 664 bp,编码除信号肽以外的HA蛋白的全部544个氨基酸,其中包括HA1的323个氨基酸,HA2的221个氨基酸.2个分离株HA基因核苷酸序列的同源性为99.4%;与GenBank中AIV标准株A/Afri.Star./Eng-Q/983/79（H7N1）的同源性最高,分别为99.4%和99.0%;与美国A/Chicken/NewYork/13142-5/94（H7N2）株同源性很低（仅65.0%）,而与以色列、意大利H7N2 AIV的同源性较高（为96%～97%）;2个分离株在HA基因进化树中均处于H7亚型AIV的欧亚群系分支内.推导氨基酸的序列分析表明,其HA蛋白裂解位点的氨基酸序列为-GR-GLF-,仅包含1个碱性氨基酸（R-）残基,符合低致病力AIV的基因特征.     

表达H5亚型禽流感病毒HA蛋白的重组禽痘病毒的构建

为构建表达H5亚型禽流感病毒(AIV)A/Duck/Anhui/1/06(H5N1)(简称AH/06)HA蛋白的重组禽痘病毒,本研究利用感染-转染的方法通过转移载体pSY681-gfp-gpt将AIV株AH/06的HA基因同源重组到禽痘病毒(FPV)中,并利用gfp和gpt双重筛选标记在鸡胚成纤维细胞中经过多轮筛选,得到纯化的重组禽痘病毒(rFPV-gfp-gpt-AHHA)。通过PCR、序列测定和western blot的方法对rFPV-gfp-gpt-AHHA进行鉴定和抗原活性分析。结果表明AH/06的HA基因稳定的重组到rFPV-gfp-gpt-AHHA中,其表达的HA蛋白能够与AH/06的阳性血清反应,显示出了良好的抗原性。同时病毒的生长曲线也显示外源HA基因的插入并没有影响亲本病毒的复制。这些结果为进一步的免疫效力研究奠定了基础。     

鸭源H5N1亚型禽流感病毒分离株的致病性及表面蛋白基因序列分析

分析1株2004年从广东省分离获得的H5N1型禽流感病毒株A/Duck/GuangdongJiedong/23/2004对SPF鸡和鸭的致病性,并对其血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因的序列进行测定,与GenBank中收录的其他序列进行比较。结果,此分离株对SPF鸡和鸭均具有高致病性,且致死率达100%。HA基因与SCK/ST/475/04的同源率最高,而NA基因与Ck/GD/178/04同源率最高。进化分析结果表明,此毒珠与DK/Ch i-na/E319-2/03的HA、NA亲缘关系较近,推测它们来源于同一祖代毒株。推导的HA基因氨基酸裂解位点为-RRRKK-,具有典型高致病性禽流感的特征序列;NA基因颈部49~68位20个氨基酸缺失是近年来H5N1亚型优势流行株共同的遗传标志。     

H9N2亚型禽流感病毒陕西分离株的鉴定及HA、NP、NA全序列测定

从陕西地区疑似流感发病鸡分离到4株流感病毒,经国家流感中心鉴定均为A型流感病毒H9N2亚型。将其中1株A/Chicken/Shaanxi/3/2002(H9N2)的血凝素基因核蛋白基因和神经氨酸酶基因进行克隆和测序,与GenBank收录的其它流感H9N2亚型的相关基因进行比较,结果表明,A/Chicken/Shaanxi/3/2002(H9N2)的NA序列与A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)的NA序列同源性较高,为98.9%,但其HA序列与香港人流感病毒A/HongKong/1073/99、A/HongKong/1074/99(H9N2)的HA序列同源性较低,为85.9%。另外,氨基酸进化树分析结果显示,A/Chicken/Shaanxi/3/2002(H9N2)与A/chicken/HongKong/CSW153/03(H9N2)的亲缘关系最近,两者形成独立的分支。     

H9N2禽流感病毒HA2基因重组杆状病毒的表达

从pMD18-THA阳性质粒扩增了H9N2亚型禽流感病毒的HA2基因，将扩增到的HA2基因克隆至昆虫杆状病毒转移栽体pBlueBacHis2A中。将其与杆状病毒共转染于Sf9昆虫细胞，经蚀斑筛选纯化重组杆状病毒，用其感染Sf9昆虫细胞，并优化表达条件。SDS-PAGE和Western-blotting分析表明，表达产物的分子质量约为27ku。Dot-ELISA分析表明，表达的HA2融合蛋白可与鸡抗HgN2亚型血清发生特异性反应，而与H5和H7亚型抗血清间无交叉反应。