土生空团菌(Cenococcum geophilum Fr.)的菌种鉴定及其遗传多样性的初步分析

 【目的】鉴定外生菌根真菌土生空团菌（Cenococcum geophilum Fr.（Cg））菌种，分析土生空团菌的遗传多样性，探讨影响土生空团菌遗传分化的因素。【方法】采用形态特征结合PCR方法，从分离自6种寄主植物的27个中国菌株和来自法国的5个Cg菌株中鉴定出20个Cg菌株。利用PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）和随机扩增片断多态性DNA（RAPD）两种分子标记方法对这20个Cg菌株进行遗传多样性分析。【结果】PCR-RFLP方法以通用引物ITS1和ITS4对20个Cg菌株的核糖体DNA转录间隔区（ITS）进行了PCR扩增，扩增产物用3种内切酶（EcoRⅠ、HinfⅠ和MboⅠ）酶切，酶切图谱显示菌株间有明显差异。RAPD方法用经过筛选的随机引物（5'-CGCACCGCAC-3'）对20个菌株的基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物的片段大小在300～2 000 bp范围之间，共产生19个多态性位点。根据电泳图谱上DNA带的数目、位置及强度进行数值化，用聚类分析软件计算菌株间的遗传距离和遗传相似性，根据遗传距离构建20个菌株的系统聚类图。【结论】来源于不同寄主及地域的20株Cg有着较丰富的遗传多样性；地理环境和寄主对Cg遗传多样性的影响不大。     

运用PCR-RFLP标记检测南瓜疫病菌

用 1对特异引物对南瓜疫霉菌 (Phytophthora capsici)及疫霉属 (Phytophthora)部分真菌和常见土传真菌12个种的 14个菌株的 18s r DNA(即 Small Subunit Ribosom al DNA)进行扩增 ,用 4种限制性内切酶 (Eoo R 、Hae 、Hha 、Hinf )酶切 PCR扩增产物 ,分析各菌株间的 DNA限制性片段多态性 ,首次建立了南瓜疫霉菌的PCR- RFL P检测程序。并运用该 PCR- RFL P检测程序对染病南瓜植株进行检测 ,成功地在南瓜植株发病茎病健交界处、发病叶病健交界处、发病果病健交界处、接种 2 4 h的叶和接种 P.capsici 12 h的茎上快速、准确地检测到了南瓜疫病菌的存在。     

中国主栽银耳配对香灰菌的系统发育和遗传多样性

【目的】了解中国主栽银耳配对香灰菌的分类地位及遗传多样性,为香灰菌资源利用和育种提供分子生物学依据。【方法】采用18S-28S rDNA间隔区(ITS4/ITS5)的PCR扩增和内部简单重复序列多态性(ISSR)分子标记,对中国主栽银耳配对香灰菌的遗传多样性进行分析。【结果】16株供试菌株ITS序列分析表明,供试菌株与Annulohypoxylon stygium关系最为接近,同源性高达99%。从70个ISSR引物中筛选出了11个多态性好的引物,共获得62条ISSR标记。以相关系数0.7为阈值,将16株菌划为5个遗传组,菌株间遗传差异较大,遗传多样性较高。【结论】中国主栽银耳地区的香灰菌遗传资源较为丰富,这为利用香灰菌资源选育新品种提供了可能。     

真姬菇栽培菌株的ITS和SSR分析

采用ITS和SSR分子标记技术,对27个真姬菇菌株进行遗传分析.通过内转录间隔区(ITS)区域测定和比较分析,结果显示:供试菌株ITS序列长度为594 bp,与GenBank上登录的真姬菇菌株ITS序列相似度为99%以上,在种的水平上证明供试菌株为真姬菇.利用简单重复序列(SSR)标记技术和转移扩增技术,根据香菇、糙皮侧耳、灰盖鬼伞基因组序列设计引物,对真姬菇供试菌株基因组DNA进行扩增.从54对引物中筛选出23对能够扩增出稳定带型且菌株之间带型差异明显的SSR引物.利用23对引物对全部供试菌株进行扩增,共扩增133条条带,其中多态性条带为108条,多态性比率达到81.2%.UPGMA聚类分析结果表明:大部分常规栽培菌株和工厂化栽培菌株聚在不同组,说明两者之间的遗传背景存在明显差异.根据获得菌株的特有SSR标记分析表明:利用7对引物可以将工厂化栽培菌株区分开,其中2个工厂化栽培菌株各自具有1条特异条带,其他工厂化栽培菌株均可通过引物组合法区分开.     

20株草菇遗传多样性的分析

旨在借助分子标记手段对草菇菌株进行鉴别。利用17条扩增条带清晰、稳定的随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA,简称RAPD)、简单重复序列区间(inter-simple sequence repeat,简称ISSR)引物对20株草菇菌株基因组DNA进行PCR扩增,分析草菇菌株的遗传差异。结果表明,17条引物共扩增出123条清晰的DNA片段,其大小为250～2 000 bp,其中多态性片段92条,平均多态性位点占比为74.80%。DNA电泳结果表明,所有供试菌株间的DNA指纹均存在差异。     

利用ITS和SRAP分子标记对黑龙江省野生黑木耳菌株进行遗传多样性分析

利用ITS和SRAP标记对黑龙江省境内采集的14株野生黑木耳菌株和一个南方栽培菌株进行遗传多样性分析.ITS序列分析结果显示:供试菌株的ITS序列变异程度较小,仅存在碱基的变化,无区域长度变异,菌株之间的遗传差异较小.利用8对引物对15个供试菌株进行SRAP扩增,共得到215条条带,其中155条为多态性条带,多态性比率...     

利用ITS和SRAP分子标记对中国白灵菇和欧洲侧耳属菌株进行亲缘关系鉴定

为了评价白灵菇的分类地位,采用内转录间隔区(ITS)序列分析和相关序列扩增多态性(SRAP)两种分子标记技术,系统分析了包括中国白灵菇商业菌株和欧洲Pleurotus nebrodensis菌株在内的34株侧耳属菌株的DNA多态性.ITS序列分析结果显示:供试菌株的ITS序列变异不仅表现在碱基的变异,也表现在区域长度的变异.利用7对扩增条带清晰、多态性较丰富、稳定性较好的引物对34个供试菌株进行SRAP扩增,共得到420条条带,且均为多态性条带.ITS序列分析和SRAP分析结果均显示:白灵菇和Pleurotus nebrodensis具有很近的遗传关系.将ITS和SRAP两种标记联合使用能得到更好的结果.     

小孢子链格孢的IGS-RFLP分析

用基因间隔区特异性引物对10个小孢子链格孢种和作为对照的1个大孢子链格孢种(茄链格孢)(Al-ternaria solani)进行扩增,小孢子链格孢种获得约3.0kb片段,而大孢子链格孢种获得约4.0kb片段,大孢子种和小孢子种可通过IGS扩增片段明确区分.分别用限制性核酸内切酶HaeⅢ和MspⅠ对小孢子链格孢的扩增产物进行限制性酶切,可产生不同的酶切图谱.根据酶切图谱可以把细链格孢和细极链格孢区分.IGS扩增产物表现出长度和序列结构上的多态性,是一个良好的遗传标记,对于一个种内的不同菌株具有一定鉴别意义,但是由于利用现有引物一些菌株难以扩增出PCR产物,该方法的利用受到一定限制.     

浙江地区不同寄主来源的炭疽菌ITS序列PCR-RFLP多态性分析

应用核糖体DNA (ribo-somal DNA,rDNA)的ITS( internal transcribed spacer,ITS)区的RFLP序列的多态性,分析32个不同寄主来源的炭疽菌株的遗传多样性.利用ITS1及ITS4通用引物对扩增各菌株的rDNA的内转录间隔区(ITS1-5.8S-ITS2)获得长约600 bp片段.ITS-RFLP共迁带UPGMA聚类分析的结果表明所有来自不同寄主的炭疽菌菌株(含福建及云南菌株)都以较高的相似系数(＞0.60)聚为一类,具有较近的 亲缘关系;同时试验中所有酶切位点的综合Gst系数达到0.82,说明不同菌株间的ITS具有丰富的多态性.     

杏果实黑斑病菌及近似链格孢种的RAPD分析

运用随机扩增技术对来源于杏果实的黑斑病菌及其他5个链格孢(Alternaria)相似种共28个菌株的基因组DNA进行了多态性分析,利用10个随机引物获得157条RAPD标记.聚类分析结果表明,9个杏果实黑斑病菌菌株(AX1～AX9)的亲缘关系极为相近,并且是独立于其它供试种群的遗传群体.各供试菌株既具有遗传组成上的相似性,又存在种间及种内遗传分化.     

不同来源辣椒疫霉菌的遗传多样性分析

[目的]探索来自辣椒寄主和土壤的辣椒疫霉的遗传多样性。[方法]通过利用12个10碱基随机引物对来自我国4个不同地理区域的22个辣椒疫霉菌株的亲缘关系进行RAPD分析。[结果]受试22个菌株共产生101条谱带,其中多态性为99条,占98.02%,说明受试辣椒疫霉菌具有丰富的遗传多样性。根据引物扩增的DNA指纹图谱,运用UPGMA分析法,以遗传相似系数0.5为阈值,将供试22个菌株划分为3个遗传聚类组(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)。RAPD标记技术分析表明,来辣椒寄主和土壤的菌株的全基因组DNA扩增图谱差异很大。[结论]供试菌株具有丰富的遗传多样性,来自不同遗传背景的菌株差异显著,聚类组的划分与菌株的来源有一定的相关性。     

应用PCR法检测向日葵茎溃疡病菌的研究

[目的]设计出向日葵茎溃疡病菌(Phomopsis helianthi M.Muntanola - Cvetkovic)的特异性引物,建立该病菌PCR快速检测方法.[方法]用真菌通用引物ITS4/ITS5对向日葵茎溃疡病菌进行PCR扩增,将扩增产物进行克隆、酶切分析和测序,用DNAMAN软件设计出检测该病菌的特异性引物PHDF1和PHDF2,优化PCR反应体系.[结果]PCR反应体系为:25 mM MgCl2 2.4 μL,10 mM dNTP 0.3 μL,10 uM引物各1.5 μL,模板7 ng,最佳退火温度61.6C,建立了该病菌PCR检测方法.[结论]应用该方法检测供试的13个菌株,该对引物可以准确的将向日葵茎溃疡病菌与其他拟茎点霉属的真菌区分开来,该病菌的PCR扩增片段为326 bp.     

番木瓜棕榈疫霉核糖体DNA-ITS序列分析

采用真菌核糖体转录间隔区通用引物ITS1和ITS4,PCR扩增了2株分离自广州的番木瓜疫霉菌(Phytoph-thorasp.)的核糖体基因ITS序列,并对PCR产物进行了克隆测序.供试菌株C0506071、C0506072分别克隆出814 bp、830 bp的序列,两菌株ITS序列间的相似同源率为99.62%.将供试菌株的ITS序列与GenBank中登陆的20株疫霉菌株的ITS序列进行聚类分析,结果表明,供试菌株与GenBank注册的AF467093、AJ517463聚在同一分枝上,均为棕榈疫霉(Phytophthora palmivora),其他不同的疫霉种聚在不同的分支上,系统学关系较远.这表明分离自广州的2株番木瓜疫霉菌为棕榈疫霉(Phytophthora palmivora).     

10株白僵菌菌株ITS序列测定和系统发育分析

通过对10株白僵菌菌株进行培养和提取基因组DNA,并利用真菌ITS序列通用引物ITS4和ITS5进行PCR扩增,均得到了1条长约500 bp DNA产物。分别对该产物进行序列测定和分析表明,这10株白僵菌菌株的ITS序列长为490~494 bp;利用ITS序列构建系统发育树表明,菌株YD-1、YD-2、JN-1、QC-1、SY-1、YC-1、YC-2、GA-1和FJ-2均为球孢白僵菌（Beauveria bassania）,而菌株FJ-1很可能为白僵菌属的一个新成员。     

利用巢式PCR检测玉米细菌性枯萎病菌

利用通用引物扩增了玉米细菌性枯萎病菌及其近似种的转录间隔区并进行了序列测定。通过序列比较,设计了一对玉米细菌性枯萎病菌的专化性引物,并对所有参试菌株进行扩增。结果显示：该对引物能从参试的玉米细菌性枯萎病菌中特异性地扩增出1条299bp的条带,而其他参试菌株没有扩增信号。与扩增细菌ITS区域的通用引物结合使用,建立了检测和鉴定玉米细菌性枯萎病菌的巢式PCR技术,其检测灵敏度可达到4个细菌细胞,可以准确、灵敏地检测和鉴定玉米细菌性枯萎病菌。     

柱花草炭疽病菌的准确快速鉴定

采用常规组织分离法分离得到2个柱花草炭疽病菌致病性菌株,利用ITS通用引物ITS1／ITS4对炭疽菌rDNA—ITS进行扩增,电泳检测得到约500bp大小的目的条带,经过生物信息学分析2个菌株均为刺盘孢属胶胞炭疽病菌,且两者之间同源性达到99％,对其侵染能力进行检测,5个柱花草品系的抗病性有所不同。     

ISSR和ITS分子标记在黑龙江省野生黑木耳遗传多样性上的应用

利用ISSR和ITS标记对黑龙江省采集的33株野生黑木耳菌株和8个黑龙江省常见栽培菌株进行遗传多样性分析,利用PCR-ISSR体系,选出9个ISSR引物对菌株DNA进行扩增,通过聚类分析对遗传多样性进行分析。结果表明,9个ISSR引物扩增条带103条条带,其中多态性条带95条,多态性比率为92.2%,平均每对引物扩增出条带11.4条,平均每对引物扩增出多态性条带10.6条,平均多态性比例为91.7%。多态性信息含量(PIC)变化在0.063~0.924之间。通过ITS序列对黑木耳菌株进行亲缘关系分析,利用软件ClustalX 1.83和MAGA 4.1进行系统发育分析分析。结果表明,黑木耳ITS1、5.8S、ITS2三个区信息为点比例达到52.1%,遗传位点丰富。两种标记方法均显示黑木耳野生菌株间遗传多样性优于栽培菌株。ISSR和ITS两种方法联合使用可得到较好结果。     

利用PCR-RFLP技术鉴别异尖线虫

应用PCR-RFLP技术对福建沿海海鱼中常见的简单异尖线虫、典型异尖线虫、对盲囊线虫和针蛔线虫幼虫进行鉴定.采用通用引物扩增上述4种异尖线虫幼虫的核糖体DNA内转录间隔区(ITS)序列,对PCR产物进行回收、克隆和测序.根据序列分析结果,选用限制性内切酶HinfⅠ和RsaⅠ进行酶切,酶切产物经琼脂糖电泳分析.结果表明:同时使用HinfⅠ和RsaⅠ酶,可以将4种异尖线虫进行分类;应用特异性引物扩增这4种异尖线虫,获得了预期扩增片段.可见,根据4种线虫ITS序列建立的PCR-RFLP技术能够对这4种异尖线虫进行准确、特异和快速的鉴定.     

竹材木质素选择性降解菌株的分子鉴定

鉴定1株从腐竹中筛选的高效选择性降解竹材木质素的优良菌株ZNLD-18,为生物法提取可纺性竹原纤维奠定基础。利用真菌通用引物ITS1和ITS4扩增并测定菌株的rDNA ITS区序列,序列总长541bp。把所得序列在GenBank中进行B1ast搜索得到同源性较高的同属不同种菌株序列。比较这些序列的遗传距离,显示菌株ZNL D～18与Trametes versicolor的ITS区序列同源性为99％以上。利用PAUP软件构建分子系统发育树,通过对该树的分析并综合菌株的形态特征,鉴定菌株ZNLD-18为白腐菌Trametes versicolor。