牛布鲁氏菌病间接ELISA检测方法的建立及应用

为建立牛布鲁氏菌病血清学诊断方法,本研究以牛种布鲁氏菌B. abortus2308基因组为模板,PCR扩增其HSP70基因,构建重组表达质粒pET32a-HSP70,转化大肠杆菌BL21进行诱导表达并纯化,SDS-PAGE结果显示,得到重组HSP70蛋白,HSP70主要以包涵体形式表达。经条件优化建立以该蛋白为包被抗原的间接ELISA(iELISA)方法,结果显示,iELISA最佳反应条件为:抗原HSP70包被浓度为0.2μg/孔,血清稀释度为1200,封闭液为5%脱脂奶粉,兔抗牛IgG-HRP稀释度为14 000,显色10 min;该iELISA方法的临界值为0.186。特异性试验结果显示,除布鲁氏菌病阳性血清外,该iELISA与IBR、BVD和FMD阳性血清无明显交叉反应;敏感性试验结果显示,血清1400稀释时仍能有效检出布鲁氏菌;重复性试验结果显示。批内批间变异系数均小于10%,重复性好。利用本实验建立的iELISA方法与传统的虎红凝集和试管凝集试验同时对血清样品进行检测,比分析检测结果,结果显示该iELISA方法与其它两者符合率较高。利用本方法对秦皇岛未进行布鲁氏菌病免疫的规模化肉牛养殖场血清样品进行检测,布病抗体阳性率为2.5%。本研究建立的iELISA为牛布鲁氏菌病的血清学诊断提供了可行方法。     

基于奶牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿rAP1-BP-AP2重组蛋白的间接ELISA方法的建立

为建立一种快速准确高效的检测奶牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿抗原相应抗体的检测方法,本研究以牛乳腺炎无乳链球菌Ia型PI-2a菌毛岛屿辅助蛋白AP1、AP2及骨架蛋白BP 3基因串联表达的重组蛋白为ELISA包被抗原,通过方阵滴定法优化反应条件,建立了奶牛乳腺炎无乳链球菌抗体的间接ELISA检测方法。优化后抗原的最佳包被量为5.0μg/孔,血清样品最佳稀释倍数为1∶40,酶标二抗最佳稀释倍数为1∶5 000。对S.agalactiae、S.pyogens、E.coli、S.aureus、S.epidermidis阳性血清进行检测结果显示,后4种阳性对照血清未出现阳性反应,表明该方法具有良好的特异性;对已知牛无乳链球菌阳性血清倍比稀释后进行检测时,当稀释倍数达到1:12 800时仍出现阳性结果,表明该方法具有较高的敏感度;重复性试验显示批内变异系数为2.41%~8.89%,批间试验变异系数为7.53%~10.46%;用该方法对426份临床样品进行奶牛无乳链球菌抗体检测,结果显示,其样品阳性检出率为45.07%。本研究首次基于乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿三联重组蛋白建立的间接ELISA方法为奶牛无乳链球菌的快速检测提供了一种准确、可靠的检测方法。     

基于gL蛋白的牛传染性鼻气管炎间接ELISA检测方法的建立及初步应用

为建立牛传染性鼻气管炎(infectious bovine rhintracheitis, IBR)的血清学诊断方法,本试验对牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhintracheitis virus, IBRV)gL蛋白进行原核表达和纯化,作为包被抗原,建立了间接ELISA检测方法。结果显示,iELISA方法的最优反应条件：抗原包被质量浓度为0.773 mg/L,4℃过夜;3%BSA、37℃封闭1 h;血清1∶20稀释,室温孵育30 min;二抗稀释度为1∶5 000,37℃孵育30 min;底物反应条件为37℃5 min。特异性试验结果显示,该方法仅与IBR阳性血清反应呈阳性,而与牛口蹄疫(FMD)、牛病毒性腹泻(BVD)、布鲁菌病的阳性血清无交叉反应。敏感性试验结果显示,阳性血清1∶640稀释时检测结果仍呈阳性,表明该方法敏感性较高。重复性试验结果显示,批内变异系数为1.9%～7.7%,批间变异系数为2.6%～4.6%。对171份牛血清进行IBRV抗体检测,本试验建立的iELISA方法检出阳性样品67份,阳性率为39%;商品化试剂盒检出阳性样品60份,阳性...     

布鲁氏菌5种蛋白的原核表达及其作为间接ELISA检测用抗原的适用性比较

为比较布鲁氏菌蛋白BP26、OMP16、CP39、SP41、eryC作为间接ELISA检测用抗原的适用性,本研究原核表达并纯化了这5种蛋白,分别以其作为包被抗原,对反应条件进行优化,建立了布鲁氏菌病5种血清抗体间接ELISA检测方法。结果显示,重组蛋白BP26、OMP16、CP39、SP41、eryC大小分别约为32 ku、21 ku、30 ku、51 ku和38 ku,均可被布鲁氏菌阳性血清所识别,具有良好的免疫反应性。利用5种重组蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA方法,与牛结核、牛病毒性腹泻等常见牛病阳性血清之间无交叉反应;对28份阴、阳性参考血清进行检测,以BP26作为包被抗原建立的间接ELISA P/N值最高。利用建立的方法和IDEXX试剂盒对48份临床血清样品进行平行检测,重组蛋白BP26、OMP16、CP39、SP41、eryC相应ELISA方法的符合率分别为87.5 %、87.5 %、89.6 %、85.4 %、79.2 %。结合敏感性、特异性等因素综合分析,以重组蛋白BP26作为检测抗原建立的间接ELISA方法效果较为理想,可适用于临床布鲁氏菌感染的检测。     

布鲁氏菌BP26抗体iELISA检测方法建立

将布鲁氏菌BP26蛋白基因克隆入pET-28a原核表达载体,经表达、纯化后进行Western blot分析。以该蛋白为包被抗原,建立布鲁氏菌BP26抗体iELISA检测方法,并进行特异性、敏感性、符合率等试验。结果表明:成功构建重组原核表达载体pET28a-BP26,表达和纯化后获得目的蛋白浓度为680μg/mL,Western blot显示与牛和羊血清均具有良好的免疫学活性;建立并优化了BP26抗体iELISA检测方法,抗原包被浓度为13.6μg/mL、血清稀释倍数为1∶100、封闭条件为1.5%乳清蛋白、37℃1 h,二抗稀释倍数为1:2000,37°显色15 min;用建立的iELISA检测方法与传统虎红平板凝集试验比较,413份羊血清样品的符合率为92.2%,186份牛血清样品的符合率为94.8%。该方法可大规模应用于临床牛和羊血清样品检测,为布鲁氏菌病抗体监测及净化提供技术支持。     

牛病毒性腹泻病毒重组p80蛋白的间接ELISA方法的建立

为建立以牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白p80为包被抗原的间接ELISA方法,本研究将重组质粒pET30a-p80转化至大肠杆菌BL21(DE3)表达菌,将转化菌培养并诱导后,通过SDS-PAGE证实了p80蛋白以包涵体形式获得了表达,将纯化后的重组p80蛋白作为包被抗原,通过方阵滴定优化反应条件,建立了检测BVDV血清抗体的间接ELISA方法。特异性试验结果显示,该方法与BVDV阳性血清反应呈阳性,而与牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛呼吸道合胞体病毒、口蹄疫病毒及猪瘟病毒等常见病原的阳性血清无交叉反应,特异性较强。敏感性试验结果显示本实验建立的间接ELISA方法在阳性血清11 280倍稀释时检测结果仍呈阳性,而病毒中和试验结果显示该阳性血清稀释度在1512时检测结果就已为阴性,表明该方法的敏感性较高。重复性试验结果显示批内批间变异系数均小于10%,表明该方法重复性较好。采用本实验建立的方法与病毒中和试验同时检测90份牛血清,结果显示二者的符合率为95%。利用本研究建立的间接ELISA方法对188份采自国内两个不同地区的牛血清样品进行了检测,检出BVDV阳性血清162份,阳性血清检出率为86.2%。本研究建立的检测BVDV血清抗体的间接ELISA方法可用于国内BVDV的血清流行病学调查,为相关疫病的防控提供技术支持。     

牛病毒性腹泻病毒重组E2蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

为建立一种简单快速、敏感特异、高通量的牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)抗体检测方法,采用原核表达方法对BVDV E2基因中免疫原性强的1段序列进行截短表达,获得了具有良好反应活性的重组E2蛋白,以重组E2蛋白为包被抗原建立了检测BVDV抗体的间接ELISA方法。结果显示:该方法检测牛副流感病毒3型(BPIV-3)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)阳性血清均为阴性,检测BVDV抗体的灵敏度可达1∶12 800,批内和批间重复性试验的变异系数分别小于5%和10%,与中和试验的符合率为94.44%。应用该方法检测国内外5个生产厂家的53批次细胞培养用牛血清样品,阳性污染率达39.62%;检测589份临床牛血清样品,阳性感染率为34.80%。研究表明,建立的BVDV重组E2蛋白间接ELISA抗体检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和适用性,为BVDV感染的监测提供了重要工具。     

羊种布鲁氏菌wzt基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

为建立检测血清中布鲁氏菌抗体的间接ELISA方法,本试验采用PCR技术从羊种布鲁氏菌QY1菌株中扩增得到wzt基因片段,连接到pET-30a载体上,构建质粒pET-30a-wzt,将鉴定正确的质粒转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞,经原核表达系统对其进行表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blotting进行分析后,用亲和层析镍柱纯化wzt重组蛋白备用。以wzt重组蛋白为检测抗原,逐步优化条件后建立布鲁氏菌间接ELISA检测方法。结果显示,试验成功构建了pET-30a-wzt原核表达载体,并在BL21（DE3）宿主菌中表达;SDS-PAGE和Western blotting结果表明,重组蛋白约为35 ku,表达形式为上清,条带单一、无杂带,有很好的反应原性和特异性。ELISA优化试验确定了最佳包被浓度为15 μg/mL,血清最佳稀释度为1：80,酶标抗体的最佳稀释度为1：5 000;通过检测24份阴性样品确定临界值,当样品D_{450 nm}值≥ 0.30为阳性,样品D_{450 nm}值<0.30时为阴性;特异性试验表明,该方法不与小肠耶尔森菌、大肠杆菌发生交叉反应;批内及批间变异系数均<10%;用该方法对120份血清样本进行检测,并与虎红凝集试验进行相符性验证,符合率为96%。本试验建立的间接ELISA方法为布鲁氏菌病的检测提供了可靠的技术手段。     

宁夏银北农村地区肉牛布鲁氏菌病监测与分析

为探讨宁夏银北农村地区肉牛布鲁氏菌病的流行病学情况,试验在该地9个村庄开展,随机选择20个未接种布鲁氏菌疫苗的肉牛养殖场,每场采集20份全血,共400份样品,采用虎红平板凝集试验（RBPT）和竞争酶联免疫吸附试验（cELISA）检测肉牛血清抗体情况,再采取实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法对血清阳性样品进行检测,将qPCR结果为阳性的样品进一步采取AMOS-PCR法进行扩增分型。结果表明,RBPT和cELISA整体血清阳性率分别为为23.5%和27.5%,2种检测方法之间的Kappa值为0.816,一致性较好;RBPT和cELISA检测的群体平均阳性率分别为60%和65%;qPCR检测显示,只有5份血清样品布鲁氏菌阳性,经AMOS-PCR鉴定为牛种布鲁氏菌。说明牛种布鲁氏菌是引起该地区牛布鲁氏菌病的主要病原菌。通过探讨宁夏银北农村地区肉牛布鲁氏菌病的流行病学情况,发现该地肉牛布病具有较高的流行率,且检测发现感染布病的为牛种布鲁氏菌,为宁夏银北地区控制和预防布鲁氏菌的感染提供流行病学依据。     

鸭坦布苏病毒抗体间接ELISA检测方法的建立和应用

为建立特异性和敏感性较高的鸭坦布苏病毒(DTMUV)抗体检测方法,采用原核表达系统对DTMUV E蛋白的DⅢ结构域进行了双串联融合表达,SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白大小约25 Ku。Western blot结果显示,经亲和层析纯化的重组蛋白能与DTMUV阳性血清发生特异性反应。以纯化的重组DⅢ蛋白作为包被抗原,初步建立了检测DTMUV血清抗体的间接ELISA方法。采用梯度稀释法对ELISA各种反应条件进行优化,确定最适工作条件。重组抗原最适包被浓度为5μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶100,兔抗鸭酶标抗体最适稀释度为1∶1000;抗体临界值S/P≥0.336判定为阳性,S/P≤0.287判定为阴性,介于两者之间为可疑。该方法检测禽流感病毒、鸭源新城疫、鸭甲肝病毒、鸭圆环病毒、鸭细小病毒、经典呼肠孤病毒及新型鸭呼肠孤病毒等血清均为阴性,4个批次批内与批间重复试验的OD值变异系数分别为6.21%~7.27%和3.4%~7.2%,显示该法具有很好的特异性、稳定性和重复性。用建立的间接ELISA与中和试验分别对108份疑似鸭坦布苏病血清样品进行检测,两种方法的阳性符合率为83.3%。     

羊种布鲁氏菌wzt基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

为建立检测血清中布鲁氏菌抗体的间接ELISA方法,本试验采用PCR技术从羊种布鲁氏菌QY1菌株中扩增得到wzt基因片段,连接到pET-30a载体上,构建质粒pET-30a-wzt,将鉴定正确的质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经原核表达系统对其进行表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blotting进行分析后,用亲和层析镍柱纯化wzt重组蛋白备用。以wzt重组蛋白为检测抗原,逐步优化条件后建立布鲁氏菌间接ELISA检测方法。结果显示,试验成功构建了pET-30a-wzt原核表达载体,并在BL21(DE3)宿主菌中表达;SDS-PAGE和Western blotting结果表明,重组蛋白约为35 ku,表达形式为上清,条带单一、无杂带,有很好的反应原性和特异性。ELISA优化试验确定了最佳包被浓度为15μg/mL,血清最佳稀释度为1∶80,酶标抗体的最佳稀释度为1∶5 000;通过检测24份阴性样品确定临界值,当样品D_(450 nm)值≥0.30为阳性,样品D_(450 nm)值0.30时为阴性;特异性试验表明,该方法不与小肠耶尔森菌、大肠杆菌发生交叉反应;批内及批间变异系数均10%;用该方法对120份血清样本进行检测,并与虎红凝集试验进行相符性验证,符合率为96%。本试验建立的间接ELISA方法为布鲁氏菌病的检测提供了可靠的技术手段。     

牛副流感病毒3型核衣壳蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

为建立以牛副流感病毒3型(BPIV3)核衣壳蛋白(NP)为包被抗原的间接ELISA方法,本研究扩增BPIV3的NP基因并克隆于原核表达载体,获得重组表达质粒p ET30-NP。将其转化至表达菌BL21(DE3),获得了可溶性表达的重组N蛋白,用镍柱在非变性条件下纯化后将其作为包被抗原,建立了检测BPIV3抗体的间接ELISA方法。特异性试验结果显示作为包被抗原的重组N蛋白仅与BPIV3阳性牛血清发生特异性反应,与牛传染性鼻气管炎病毒和牛病毒性腹泻病毒等牛的常见病原无血清学交叉反应,表明其特异性较强。牛BPIV3阳性血清在1:640倍稀释时按该方法检测仍为阳性,显示该方法具有较高的敏感性。重复性试验显示批内变异系数小于6%,批间变异系数小于12%,表明该方法具有较好的稳定性。对94份牛血清的比较试验显示,本研究建立的间接ELISA方法与病毒中和试验的符合率为98%。利用该方法检测了394份采自接种过BPIV3灭活苗牛场的血清样品和95份未接种疫苗牛场的血清样品,结果接种疫苗的牛血清均呈强阳性,而95份未接种疫苗牛血清的阳性率为80%。本研究建立的间接ELISA方法可以试用于国内BPIV3的流行病学调查和免疫监测,为国内BPIV3的防控提供技术支持。     

山羊源贝氏柯克斯体抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

为建立山羊源贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)抗体间接ELISA检测方法,对贝氏柯克斯体的com1基因进行克隆及原核表达,以com1纯化蛋白作为抗原,建立间接ELISA检测方法,并对临床收集的血清样本进行检测。结果显示,重组蛋白大小为27 ku,经Western blot鉴定com1蛋白反应原性良好;ELISA检测方法抗原包被量为4μg/mL,血清的稀释倍数为1∶100,酶标二抗稀释倍数为1∶2 500,阴阳临界值为0.278。用该方法对流产衣原体、山羊支原体、牛支原体阳性血清进行检测,均为阴性;当C.burnetii阳性血清稀释至2 048倍时检测结果仍为阳性;批内、批间变异系数均小于10%。用该方法对陕西省部分羊场收集到的307份血清样本进行检测,样本阳性率为9.12%。成功建立了一种检测贝氏柯克斯体抗体的间接ELISA检测方法,这为C.burnetii引起的Q热的实验室诊断和流行病学调查提供了技术支持。     

布鲁氏菌4种高通量抗体检测方法的比较研究

旨在科学选择和使用布鲁氏菌抗体检测方法,推动布病诊断试剂标准化。本研究用布病阳性血清标准品测定了国家/OIE布鲁氏菌病参考实验室开发的布鲁氏菌荧光偏振（FPA）抗体检测试剂盒、动物布鲁氏菌病竞争ELSIA （cELISA）抗体检测试剂盒、牛布鲁氏菌病间接ELISA （iELISA）抗体检测试剂盒和改进的微量补体结合试验（mCFT）等4种方法的灵敏度。通过对已知阴、阳性血清样品的检测,比较了各检测方法的敏感性和特异性,并用临床样本进一步比较了各种方法检测结果的吻合性。结果表明,4种方法检测的灵敏度基本一致,当布病阳性血清标准品按1∶20稀释（即50 IU·mL^-1）时均检测为阳性,1∶40稀释（即25 IU·mL^-1）时均检测为阴性。FPA、cELISA、iELISA和mCFT方法的敏感性分别为97.14%、100.00%、100.00%、98.57%,特异性分别为96.34%、95.12%、97.56%、100.00%。对315份临床样本的检测结果显示,各方法之间的符合率均高于90.00%,其中iELISA、FPA、cELISA与mCFT符合率分别为97.14%、96.83%、92.70%;FPA、cELISA与iELISA符合率分别为95.24%、93.65%;FPA与cELISA符合率为91.43%。iELISA、FPA、mCFT 3种方法之间吻合性最高,cELISA与其他3种方法之间的吻合性略低。     

基于N蛋白小反刍兽疫病毒单克隆抗体的制备及阻断ELISA方法的建立

为建立一种小反刍兽疫病毒(PPRV)抗体的快速检测方法,本研究将pET-32a-N重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达、纯化获得重组蛋白并免疫BALB/c小鼠,制备了抗PPRV-N蛋白的单克隆抗体并进行HRP标记,通过优化反应条件建立了PPRV阻断ELISA抗体检测方法。经评价该方法与PIV、GTPV、ORFV的阳性血清均无交叉反应;最低能检出1∶160稀释的阳性血清;批内和批间变异系数(C_v)均小于10%;通过对180份临床血清样品进行检测,该方法与竞争ELISA试剂盒的符合率为96%。表明建立的阻断ELISA方法具有良好的特异性、敏感性与可重复性,可用于PPRV抗体的检测,为PPRV疫苗的免疫效果评估及疫病防控提供了技术支持。     

检测猪弓形虫ROP14抗体间接ELISA方法的建立

为丰富和完善弓形虫病的检测方法,本试验基于弓形虫棒状体蛋白14(TgROP14)建立了间接ELISA检测方法。构建原核表达载体pET30α-ROP14,转化至大肠杆菌BL21中,诱导表达并纯化获得TgROP14重组蛋白,通过SDS-PAGE和Western blot试验验证其纯度及免疫原性。利用纯化透析后复性的rTg-ROP14建立猪弓形虫病间接ELISA检测方法,并对反应中各项条件进行了优化。结果表明最佳检测条件为:抗原包被量2μg/孔,血清稀释倍数为1∶20,封闭剂为5%脱脂奶粉,血清作用时间为60 min,二抗稀释倍数为1∶1 000,二抗作用时间为60 min,TMB作用时间为20 min,临界值为0.728。该方法敏感性为1∶80,批内批间重复试验变异系数均小于10%,重复性较好;使用该方法检测猪繁殖与呼吸综合征(美洲型)阳性血清、猪O型口蹄疫阳性血清、猪A型口蹄疫阳性血清和猪瘟阳性血清均未见交叉反应,特异性较好。利用该方法对来自浙江省各个地区的436份猪血清样品进行检测,同时使用商品化的间接血凝试剂盒进行验证,符合率为72.7%(317/436)。综上所述,本试验建立的间接ELISA方法可用于临床样品的检测,为猪弓形虫病的血清流行病学调查提供了依据。     

A型副鸡嗜血杆菌血凝素基因原核表达及间接ELISA方法的建立及应用

原核表达A型副鸡嗜血杆菌(Haemophilus paragallinarum serotype A,Hpgserotype A)的血凝素蛋白HA,并以HA蛋白为包被抗原,建立血清间接ELISA检测方法。克隆Hpg HA基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中进行重组HA蛋白的诱导表达,对表达产物进行纯化,并进行Western blot鉴定;用纯化后的HA蛋白作为包被抗原,优化反应条件,建立血清间接ELISA检测方法,并进行特异性、灵敏度和重复性试验,最后对临床样品进行检测。原核表达获得大小约为37ku的重组HA蛋白;Western blot结果表明重组蛋白具有良好的特异性和抗原反应性。Hpg间接ELISA优化反应条件为:抗原包被量每孔500ng,血清以1∶200倍稀释作用1h,酶标二抗以1∶2 500倍稀释作用1h,TMB显色时间为10min。在该优化条件下,OD_(450)≥0.34为阳性,反之为阴性;特异性试验结果表明对鸡新城疫病毒、禽流感病毒、沙门菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌阳性血清检测均为阴性;对85份阳性血清进行检测,敏感性为98.8%;重复性试验结果表明,批内和批间OD_(450)值的变异系数分别1.5%~3.7%和6.5%~8%。用本试验建立的方法对临床上215份鸡血清样品进行检测,阳性率为25.1%。说明建立的ELISA检测方法可用于Hpgserotype A抗体水平的检测。     

猪萨佩罗病毒3C蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立快速检测猪萨佩罗病毒(PSV)的血清学方法,本研究以原核表达的PSV 3C重组蛋白为包被抗原,通过反应条件优化,建立了一种PSV重组3C蛋白的间接ELISA抗体检测方法。结果显示,该ELISA方法仅对PSV血清检测为阳性,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型等主要猪源病毒阳性血清均无特异性反应,具有良好的特异性。该方法的批内和批间重复性变异系数均小于10%,血清稀释度可以达到1∶320;采用该ELISA方法对我国2016年间采集的江苏省6个不同地区猪场的281份临床血清样品进行了检测,阳性率高达38.43%,表明江苏地区猪群中存在PSV感染。本实验建立的ELISA方法可以用于检测临床样品中的PSV抗体,特异性强、敏感性高、重复性好,是PSV流行病学调查的一种有效工具,对该病的防控具有重要意义。     

伪结核棒状杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

为建立伪结核棒状杆菌(Cp)血清抗体间接ELISA检测方法,以热灭活处理的不同的浓度Cp菌株作为固相抗原包被酶标板,用不同封闭液封闭,设置不同的封闭时间,再用不同稀释度的待检血清和不同稀释度的酶标二抗与之反应,以此优化间接ELISA反应条件,确定阳性临界值。对间接ELISA方法的特异性和重复性进行试验,并在此基础上对采集的临床样本进行检测。结果显示,最佳抗原包被量为OD600 nm=0.084的菌悬液100μL,10 g/L BSA封闭时间2 h,一抗血清稀释度为1∶400,酶标二抗的稀释度为1∶5 000,血清阴阳性的OD450 nm值临界值为0.352。该方法仅对Cp阳性血清呈特异性反应,与6种常见病原阳性血清均无交叉反应,特异性较强。批内试验和批间试验的变异系数均小于9.5%,重复性较好。敏感性试验结果表明,当伪结核标准阳性血清进行1∶1 280稀释时检测仍为阳性,敏感性较强。用该方法对10份经细菌分离鉴定为阳性的血清进行Cp抗体检测,结果均为阳性。用建立的方法对临床随机采集的423份血清进行检测,结果显示阳性率为35%。研究建立的抗体间接ELISA方法为Cp抗体检测及血清学调查奠定了基础。     

隐孢子虫重组蛋白包被抗原的筛选及ELISA方法的建立及初步应用

为建立检测牛隐孢子虫抗体的间接ELISA方法,本研究将重组表达的隐孢子虫卵囊壁蛋白(COWP)、热休克蛋白70(HSP70)蛋白及COWP-HSP70串联蛋白分别作为包被抗原,进行反应条件的优化,建立了3种间接ELISA检测方法。建立的这3种方法均具有较高的特异性和敏感性。与伊氏锥虫,球虫和弓形虫阳性血清均无交叉反应,最低检出血清稀释倍数分别为1∶1 600、1∶3 200和1∶3 200。经过筛选,确定COWP-HSP70串联蛋白为包被抗原的间接ELISA方法为最佳检测方法。以该方法进行的重复性试验结果显示,其批内和批间变异系数分别为3.9%~8.2%和4.7%~8.3%。采用建立的ELISA方法与传统的粪检法分别对174份临床样品进行检测,隐孢子虫感染的检出率分别为9.2%和12.07%,两者符合率为97.13%。本研究建立的以COWPHSP70串联蛋白为包被抗原的牛隐孢子虫间接ELISA检测方法适用于临床牛隐孢子虫感染的检测。