一株和缓艾美耳球虫的致病性和免疫原性

笔者对新分离到的和缓艾美耳球虫进行了致病性和免疫原性的研究。结果表明雏鸡感染1 000和5 000孢子化卵囊表现正常,肠道没有肉眼可见的病理变化。20 000个卵囊感染引起轻微病变。100 000个卵囊和500 000 个卵囊感染则产生较为明显的致病作用,与不感染对照组相比增重分别为70．3％和56．8％,肠道外观也产生明显可见的病变,根据0-4分肠道计分标准,分别为1．43和2．37。所有实验鸡都没有出现死亡。该虫株免疫原性较强,一次免疫5 000个卵囊/只,就能够对200 000个卵囊/只感染产生坚强的保护作用。     

鸡柔嫩艾美耳球虫西宁株的分离与鉴定

[目的]鉴定鸡柔嫩艾美耳球虫西宁株。[方法]采用单卵囊分离技术从西宁当地鸡粪便中获得1株纯种球虫,经鸡体传代增殖,对该虫体的寄生部位、潜伏期、孢子化时间、形态结构等指标进行观察和测定。[结果]该虫株寄生于鸡的盲肠,卵形指数为1．22,最短孢子化时间为18h,潜伏期为114h。卵囊为卵圆形,卵囊壁光滑,呈黄绿色,孢子化卵囊未见卵膜孔和卵囊残体;孢子化卵囊平均为20．08μm×16．55μm。孢子囊纺锤形,有一斯氏体,其平均大小为8．65μm×4．90μm。综合鉴定该球虫为柔嫩艾美耳球虫,并暂命名为柔嫩史美耳球虫西宁株。[结论]该研究为进一步研究球虫的致病性和药物效应奠定了基础。     

乌鲁木齐地区鸡球虫种类调查

本文调查是采用饱和盐溶液浮集球虫卵囊的方法,检查了420只鸡粪样品。对未发育的卵囊和混合于2.5％重酪酸钾溶液中在25℃恒温箱中培养形成孢子的卵囊进行了形态学的观察和量度。发现乌鲁木齐地区有7种艾美耳球虫,它们是柔嫩艾美耳球虫(E.tenella),巨型艾美耳球虫(E.maxima),和缓艾美耳球虫(E.mitis),哈氏艾美耳球虫(E.haani),毒害艾美耳球虫(E.necatrix),基前艾美耳球虫(E.praecox)及堆型艾美耳球虫(E.acervulina)。除了堆型艾美耳球虫由于鸡的感染带虫率低,发现的卵囊较少,只作了一般观察外,其他六种都进行了较详细地观察,并分别描述了各种卵囊的形态。     

鸡球虫共同抗原UCE免疫原性分析及其对多种球虫感染的免疫保护效果评估

[目的]在前期研究中,筛选到了存在于多种鸡球虫间的共同抗原泛素缀合酶结构域蛋白(UCE),本研究进一步分析其免疫原性,评估其对多种球虫感染的免疫保护效果。[方法]提取纯化的堆型艾美耳球虫孢子化卵囊总RNA,用反转录PCR(RT-PCR)技术扩增堆型艾美耳球虫UCE基因(EaUCE),插入pVAX1质粒,构建真核表达质粒pVAX-EaUCE,通过RT-PCR和Western blot检测pVAX-EaUCE在鸡体内的转录和表达情况。经流式细胞术和间接ELISA法检测pVAX-EaUCE免疫后鸡体细胞免疫和体液免疫水平变化,分析其免疫原性。分别采用柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫及三者的混合卵囊人工感染雏鸡,观察感染前、后雏鸡体质量变化和排出卵囊减少量,评估其对多种球虫感染的免疫保护效果。[结果]EaUCE基因开放阅读框为444 bp,编码148个氨基酸,BLAST分析显示,柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫UCE氨基酸序列同源性均大于95%。pVAX-EaUCE能够在鸡体内成功转录和表达。pVAX-EaUCE免疫后,鸡体的CD_4~+/CD_3~+和CD_8~+/CD_3~+细胞比例显著升高,IFN-γ、IL-2、IL-4、TNFSF15、IL-17D、TGF-β4 mRNA和IgY抗体水平显著升高,表明免疫该质粒能诱导细胞和体液产生免疫反应(P0.05)。pVAX-EaUCE免疫后,与对照组相比,免疫组鸡体质量显著增加,卵囊产量明显下降,肠道损伤也相应减轻。[结论]鸡球虫共同抗原UCE具有良好的免疫原性,可对多种球虫感染提供部分免疫保护力,有望成为抵抗多种球虫感染的候选抗原。     

6株肠艾美耳球虫繁殖力的比较研究

[目的]为肠艾美耳球虫的早熟选育及兔球虫疫苗的研制提供理论依据。[方法]采用6个不同地区肠艾美耳球虫的孢子化卵囊经口接种45日龄无球虫兔,接种剂量为1×104个卵囊/只,并对6株肠艾美耳球虫的繁殖力进行比较。[结果]衡水株排卵量最多,张家口株次之,胶南株排卵量最少。睢宁株的排卵量接近胶南株,如皋株、通江株相近,在感染后第8.5～9天均有排卵,各虫株的排卵高峰期相似,第13天排卵量达到峰值,第21天接近0。[结论]不同地理株肠艾美耳球虫的排卵量不同,但排卵高峰相一致。     

安徽3株柔嫩艾美耳球虫cox1基因部分序列的比对分析

为研究柔嫩艾美耳球虫不同地理株的线粒体细胞色素c氧化酶第1亚基(cox1)基因与球虫种群之间的遗传关系,以安徽3个地区的3株柔嫩艾美耳球虫为研究对象,通过卵囊的分离与纯化获得纯种虫株,然后应用PCR技术对柔嫩艾美球虫3个地理株的cox1序列进行扩增,并与GenBank上登录的鸡柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫和堆形艾美耳球虫虫株的相应序列进行比对分析。结果显示,每个虫株都成功扩增出800 bp左右的cox1部分有效序列(pcox1),与柔嫩艾美耳球虫pcox1序列种内无差异,pcox1相应序列种间的差异程度为9.9%～14.9%。表明柔嫩艾美耳球虫的cox1序列可作为艾美耳球虫种间遗传变异研究的标记,为进一步研究艾美耳球虫的群体遗传学特性和耐药性奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫杨凌株SO7基因的克隆表达与保护性试验

【目的】克隆鸡柔嫩艾美耳球虫SO7基因并进行原核表达,检测表达产物的免疫原性,为鸡球虫基因疫苗的制备奠定基础。【方法】以纯化的柔嫩艾美耳球虫杨凌(Eimeria tenella YL)株孢子化卵囊的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出E.tenella YL株的SO7基因,对其测序后进行序列分析。将SO7基因克隆到表达载体pET-32a中,构建pET-SO7重组质粒,并在大肠埃希菌BL21中诱导表达出重组蛋白,将重组蛋白纯化后免疫雏鸡,评价其免疫效果。【结果】鸡柔嫩艾美耳球虫SO7基因序列的开放阅读框(ORF)为651个碱基,共编码217个氨基酸。E.tenella YL株SO7基因与E.tenella LS18株、E.tenella BJ株、E.tenella GD株SO7基因ORF区序列相似性分别为99.1%,98.6%和99.1%,其氨基酸序列相似性分别为99.1%,98.6%和99.1%。SDS-PAGE分析表明,表达产物成功地表达出了分子质量为45ku的融合蛋白。各种抗球虫指标的测定结果显示,该蛋白对球虫感染鸡体具有一定的保护性。【结论】SO7基因具有很强的保守性,各虫株之间差异不大;重组蛋白具有一定的保护效果,适合用来制备基因疫苗。     

杭州地区鸡球虫种类研究

对杭州地区的杭州市区、桐庐及建德等地的大型鸡场及个体养鸡场球虫感染情况进行了调查，通过对球虫卵囊的分离、培养，孢子生殖阶段虫体的形态观察，卵囊、孢子囊大小及卵囊孢子化时间的测定，初步将卵囊分为A型、B型、C型三种类型。分别用这三种卵囊接种雏鸡纯繁后，收集的卵囊人工感染15日龄的小鸡，观察并记录接种后的发病时间，症状及病理变化等，参照有关文献，鉴定球虫种类。经分析判定，杭州地区主要存在3个种，它们分别是柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella)，毒害艾美耳球虫（E.necatrix)和巨型艾美耳球虫（E.maxima)。     

6株巨型艾美耳球虫繁殖力的比较研究

用巨型艾美耳球虫(Eimeriamaxima)上海株、扬州株、南通株等不同地区的6株孢子化卵囊100个·只-1,经嗉囊接种7日龄无球虫黄羽公雏肉鸡,以麦克马斯特氏法计数感染后6～14d每天24h排出的卵囊。结果表明:广州株排卵囊量最多,与凤阳株和龙岩株相近;上海株排卵囊量最少,与扬州株、南通株相近;广州株与上海株、扬州株和南通株均差异显著。各虫株的显露期相似,在感染后第7天排卵囊量达峰值,第6～8天排出的卵囊量占总量的80%～90%,第10天接近0。     

柔嫩艾美耳球虫杨凌株RB1-a基因的克隆表达及免疫保护性研究

【目的】对柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)杨凌株RB1-a基因进行克隆与表达,检测表达产物的免疫保护性,为鸡球虫基因工程疫苗的研制奠定基础。【方法】以纯化的E.tenella杨凌株孢子化卵囊的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出其RB1-a基因,测序后进行序列分析。然后将RB1-a基因N端不含信号肽序列克隆到表达载体pET-32a(+)中,构建pET-32a-RB1-a重组质粒,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达出重组蛋白,将重组蛋白纯化后免疫雏鸡,对其免疫效果进行评价。【结果】柔嫩艾美耳球虫杨凌株RB1-a基因的开放阅读框(ORF)包含618个碱基,编码205个氨基酸,与GenBank报道的柔嫩艾美耳球虫PAPa46株ORF序列相似性为99.84%,两者推导的氨基酸序列相同。SDS-PAGE分析表明,重组质粒表达分子质量为42ku的融合蛋白。免疫效果测定结果显示,RB1-a免疫组和RB1-a+佐剂免疫组的相对增重率分别为64.2%和69.4%,卵囊减少率分别达37.22%和30.56%,抗球虫指数分别为146.2和150.4。【结论】RB1-a基因具有很强的保守性,种间差异不大;RB1-a重组蛋白具有一定的免疫保护效果。     

巨型艾美耳球虫IMP1基因的原核表达及多克隆抗体的制备

免疫映射蛋白1(IMP1)是一种从巨型艾美耳球虫中发现的蛋白,具有良好的免疫原性和免疫保护性.本试验通过Em IMP1基因的克隆、原核表达以及多克隆抗体的制备,为后续深入研究该蛋白的生物学及免疫学功能奠定基础.首先,从未孢子化的巨型艾美耳球虫新疆株卵囊中提取总RNA,反转录合成c DNA,PCR扩增Em IMP1基因片段.其次,将Em IMP1基因扩增片段连接到原核表达载体p ET-28a构建表达质粒p ET-28a-Em IMP1,转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株并进行表达;将纯化后的蛋白与等量弗氏佐剂乳化后皮下注射至2只新西兰大白兔体内,每隔2周免疫一次,一共免疫4次后取得的兔血清即为多克隆抗体.最后,用所获得的多克隆抗体,对纯化后的Em IMP1进行免疫印迹试验鉴定,用酶联免疫吸附测定法检测多克隆抗体的效价.结果表明,克隆出的Em IMP1基因的全长为1 140 bp,诱导出的蛋白大小为70 ku,且该蛋白在上清液和包涵体中均有存在.免疫印迹试验检测结果显示,用上述方法制备的多克隆抗体具有良好的特异性,酶联免疫吸附测定法检测结果表明该多克隆抗体具有高效价.因此,可通过原核表达蛋白Em IMP1免疫兔子制备特异性好且效价高的多克隆抗体.     

11株巨型艾美耳球虫的免疫原性分析

用平均增重和病变记分或卵囊减少率等为试验指标,对11株巨型艾美耳球虫的免疫原性进行了分析。结果显示,各虫株每鸡免疫感染100个卵囊后,不仅对攻击1×105个同源株卵囊均产生大于70%的病变记分降低率,而且使每鸡攻击1×104个同源株卵囊时的卵囊产量均减少97.42%以上,在各虫株间无显著差异。各虫株对异源株的交叉免疫力程度不一致,美国株对国内10个虫株的卵囊减少率为20.09%~82.44%,仅3株大于75%,而国内10个虫株对美国株的卵囊减少率为27.43%~95.26%,有5株大于75%;扬州株、南通株、凤阳株、龙岩株、广州株和上海株间的相互卵囊减少率为-1.72%~96.67%,其中南通株对扬州株、凤阳株、龙岩株、广州株和上海株的卵囊减少率均大于75%,上海株对扬州株、南通株、凤阳株与广州株的卵囊减少率为-1.72%~57.69%。     

主成分分析法在球虫病鸡血液生化研究中的应用

用主成分分析法对球虫感染后血液生化指标的变化特点进行了剖析。分析结果表明,艾美球虫感染主要影响鸡血清蛋白和血脂水平,血清指标的变化与虫株寄主部位和毒力有关,感染后对血清生化指标影响最大的虫种是Ｅｉｍｅｒｉａ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ原代株,其次是Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ原代株,Ｅ．ｍａｘｉｍａ早熟株影响最小;Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ和Ｅ．ｍａｘｉｍａ早熟株的感染主要影响血脂成分的变化,而Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ和Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ原代株的感染对血脂和血清蛋白的影响程度相同。     

安徽部分地区鸡柔嫩艾美耳球虫单卵囊的分离与鉴定

为获得纯种柔嫩艾美耳球虫虫株,从安徽省巢湖市、霍邱县、定远县3个地区患球虫病的鸡场采集3株混合球虫,培养至孢子化,分离单卵囊接种1～7日龄的雏鸡,感染后7～12 d,收集卵囊,然后通过生物学特性和PCR方法进行虫种鉴定。结果显示,3个地区的单卵囊感染成功率分别为50%、57%和29%,各虫株经生物学特性和PCR鉴定均为柔嫩艾美耳球虫。研究表明:1.0%琼脂单卵囊分离法简便且成功率较高,利用特异性引物PCR鉴定虫株,为纯种地方株的研究奠定了基础。     

鸡球虫种类和感染状况探讨

采集凤台县 4个村 5个鸡场的 12 9个粪样 ,调查鸡球虫种类和感染情况 ,并对其中某一养殖户进行了追踪调查。采用饱和盐水漂浮 ,重铬酸钾培养 ,饱和蔗糖溶液漂浮等方法进行检查 ,共检出 8种艾美耳球虫 ,即 :毒害艾美耳球虫 (Eimeria .necatcix) ,早熟艾美耳球虫 (E .praecox) ,巨型艾美耳球虫 (E .maxima) ,和缓艾美耳球虫 (E .mitis) ,柔嫩艾美耳球虫 (E .tenella) ,堆型艾美耳球虫 (E .acewulina) ,布氏艾美耳球虫 (E .brunetti) ,变位艾美耳球虫 (E .acervulina) ,其优势虫种主要为毒害艾美耳球虫、早熟艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫。调查结果显示 ,每个鸡场的感染率均为 10 0 % ,且多为混合感染 ;土杂鸡的感染强度大于AA肉鸡。     

安徽省正阳关鸡场鸡球虫感染情况调查

对安徽省正阳关鸡场200个粪样采用饱和白糖溶液漂浮法进行鸡球虫感染情况的调查,结果表明:肉鸡球虫感染率为46.1%(83/180),而肉种鸡球虫感染率为70.0%(14/20).所获虫种经鉴定为堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina)、和缓艾美耳球虫(E.mitis)、巨型艾美耳球虫(E.maxima)、柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)和毒害艾美耳球虫(E.necatrix).用SAS系统对调查数据进行统计分析,肉鸡球虫感染率存在年龄差异,相同日龄肉鸡毒害艾美耳球虫感染率显著低于其他几种球虫.     

巨型艾美耳球虫Eimeria maxima内生发育阶段的细胞化学研究:Ⅰ.多糖、核酸、碱性核蛋白

本试验利用组织化学技术对巨型艾美耳球虫内生发育阶段细胞内的多糖、核酸、碱性核蛋白进行的研究证明,裂殖体、大配子、小配子体、卵囊内都存在 DNA、RNA 和碱性核蛋白。滋养体、多核体和小配子体内未检出多糖。裂殖体、大配子和合子含有多糖、成熟的大配子和合子多糖含量丰富。结果表明,多糖是由球虫自身合成并在其发育过程中消耗。     

巨型艾美耳球虫感染鸡空肠粘膜肥大细胞数量和组织胺含量的变化

通过用地塞米松处理鸡和用特异性抗原作刺激因子的微量全血淋巴细胞转化试验(LPA),研究了雏鸡抗 Eimeria maxima 再感染中细胞免疫现象。结果表明,地塞米松处理可损伤鸡抗 E.maxima 再感染的免疫力.这提示了 CD8+T 细胞、γIFN 及 IL-2等在抗 E.maxima 卵囊抗原刺激因子的微量全血 LPA结果表明,其刺激指数值与鸡抗 E.maxima 再感染抵抗力有关。此反应可用于体外监测鸡体抗 E.maxima再感染的抵抗力。     

安徽部分地区鸡球虫种类及感染情况调查

为了解安徽省部分地区鸡球虫种类及感染情况,采用群体采样法分别从肥西县、长丰县和凤台县采集鸡新鲜粪样,用饱和盐水漂浮法检查。阳性粪样采用饱和盐水漂浮和离心沉淀法进行卵囊分离。显微镜下观察卵囊进行虫种鉴定,并统计各调查点的鸡球虫感染率和感染强度等。结果表明,鸡球虫感染率为93.3%(84/90);共检获7种球虫,即:柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)、巨型艾美耳球虫(E.maxima)、堆型艾美耳球虫(E.acervulina)、毒害艾美耳球虫(E.necatrix)、布氏艾美耳球虫(E.brunetti)、和缓艾美耳球虫(E.mitis)、早熟艾美耳球虫(E.prae-cox)。