绵羊痘病毒甘肃流行株膜蛋白ORF23基因的克隆及序列分析

从甘肃景泰县疑似患羊痘的绵羊皮肤组织中提取基因组DNA,PCR扩增膜蛋白ORF23基因.序列分析表明,该基因由1113个核苷酸组成,编码370个氨基酸,A+T含量占69.90%,G+C含量仅占30.10%.绵羊痘病毒甘肃株ORF23基因与A株、NISKHI株之间的核苷酸同源性分别为99.6%和99.5%,氨基酸同源性分别为98.7%和98.4%;与皮肤疙瘩病病毒NW-LW株和山羊痘病毒Pellor株之间的核苷酸同源性均为98.2%.结构预测显示,ORF23膜蛋白为非分泌蛋白,具有一个O连结糖基化位点.可见,ORF23膜蛋白在不同的绵羊痘病毒流行株之间非常保守,具有潜在的疫苗和诊断研究价值.     

绵羊痘病毒RPO30基因的克隆及序列分析

[目的]对绵羊痘病毒RPO30基因进行克隆,并对所得序列进行结构和功能预测。[方法]PCR扩增RPO30基因,克隆到pMD18-Tsimple载体并转化DH5a大肠杆菌;经蓝白斑筛选挑选白斑制备质粒,阳性克隆经双酶切和PCR鉴定后送测序。利用生物信息学方法对所克隆的分子进行序列分析和结构预测。[结果]成功克隆了RPO30基因,克隆的SSPVRPO30基因ORF为585bp,编码193个氨基酸,阅读框内有一个HindIII酶切位点,测序结果与GenBank数据库中不同痘病毒毒株之间同源性存在着明显区别。生物学软件分析表明RPO30蛋白质氨基酸4～12、18～26、50～61、68～92和176～190位之间区域形成活性中心的可能性较大,选择这些区域进行作用可能会造成该基因产物酶的失活,从而高效抑制病毒的复制。[结论]本研究将RPO30结构和功能的进一步研究奠定一定的基础。     

绵羊痘病毒甘肃古浪株RING finger基因的克隆表达及序列分析

【目的】对绵羊痘病毒甘肃古浪株RING finger蛋白的基因进行克隆,表达以及序列分析,初步探究绵羊痘病毒RING finger蛋白是否具有E3泛素连接酶活性,为阐明其在绵羊痘病毒感染过程中对泛素蛋白酶体系统的调控作用奠定基础.【方法】以绵羊痘病毒甘肃古浪株DNA为模板,通过PCR扩增RING finger基因.利用Pfam数据库、DNAstar等软件进行序列及遗传进化分析;将RING finger基因片段插入原核表达载体pGEX-4T-1中,构建pGEX-SPPVRFP重组表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并进行SDS-PAGA和Western-blot分析.【结果】绵羊痘病毒RING finger基因由723个核苷酸组成,编码的240个氨基酸的分子量约为28.5 ku,具有RING finger结构域.不同羊痘病毒株间RING finger基因核苷酸序列同源性高达99.2%,氨基酸序列同源性高达98.3%.不同的RING finger蛋白都含有8个保守的半胱氨酸和组氨酸.SDS-PAGA分析显示,重组SPPVRFP大小约为55 ku,Western-blot分析显示,重组SPPVRFP不能与绵羊痘病毒阳性血清反应.【结论】成功克隆、表达并纯化了绵羊痘病毒RING finger基因,对SPPV GS-GL株RING-finger蛋白进行序列分析,推测其可能具有E3泛素连接酶活性.     

绵羊IGFBP-1基因的克隆及序列分析

试验以凉山半细毛羊为研究对象,采用RT-PCR方法克隆了IGFBP-1基因的CDS全序列,生物信息学方法深入分析其序列。结果表明,IGFBP-1基因的CDS序列为792 bp,编码263个氨基酸,与牛、人、鼠的CDS同源性分别为97%、76%和74%,氨基酸序列同源性分别为97%、69%和71%,Gen Bank登录号为FJ589639.1;IGFBP-1基因的氨基酸分子量为27.8 k D,理论等电点(p I)为5.99;进化分析显示与牛、山羊等哺乳动物关系较近,与鸡、鱼类等亲缘关系较远;IGFBP-1基因存在明显的疏水性区域和亲水性区域,有一个信号肽、一个跨膜区、16个磷酸化位点、6个N-糖基化位点和8个O-糖基化位点;二级结构分析显示无规卷曲、α-螺旋和β-折叠区域分别为61.98%、24.33%、13.69%;三级结构分析显示存在IGFBP_N和甲状腺球蛋白-Ⅰ型功能域。为进一步研究绵羊IGFBP-1基因的功能奠定基础。     

伪狂犬病毒上海株糖蛋白G(gG)基因的克隆及序列分析

应用PCR方法从PRV SH（上海株）病毒培养物扩增了gG基因，克隆入pCDNA3质粒，并进行了序列测定。结果表明，扩增的gG基因片段长1719bp，包含一个1491bp的开放阅读框（ORF），在起始密码子上海有TATAAAA盒。在终止密码子下游有AATAAA的poly(A)尾，编码由496个氨基酸组成的蛋白质。与Rice株相应的gG片段相比，核苷酸序列同源性达97.1%。但推导的氨基酸序列同源性仅有87.6%。主要是在编码区内插入和缺失核苷酸。出现了突变和移码，导致氨基酸序列同源性降低.gG具有膜蛋白的结构特点。     

绵羊痘病毒新疆株的分离及结构蛋白P32基因序列分析

[目的]对绵羊痘病毒当地流行毒株的分离和其结构蛋白P32基因的克隆和序列进行分析,明确引起新疆本地绵羊流行痘病的病毒种类,掌握当前流行毒株的变异情况,为绵羊痘的预防控制及将来研制高效安全疫苗提供科学依据.[方法]将两例疑似患有羊痘的绵羊肺脏组织病料接种于MDBK细胞进行病毒分离,细胞病变组织经处理后通过电子显微镜观察分离病毒.以分离病毒基因组DNA为模板,通过PCR扩增绵羊痘病毒结构蛋白P32基因,并对目的基因进行克隆和基因序列和蛋白生物信息学分析.[结果]两例病料组织接种MDBK细胞后均产生明显的细胞病变,电子显微镜观察可见到约200 nm大小、椭圆形有囊膜的典型痘病毒粒子.对两株病毒表面膜结构蛋白P32基因PCR扩增均可获得与预期大小一致的约972 bp片段,氨基酸序列分析表明分离毒株SPV/Miquang/2013和SPV/Kuche/2013病毒P32基因与绵羊痘病毒参考株同源性分别达96.9;～99.4;和97.5;～100;,生物信息学分析发现SPV/Miquang/2013株P32蛋白有两个关键氨基酸位点发生变异,即第78位谷氨酸突变为赖氨酸,第293位异亮氨酸突变为苏氨酸.[结论]从疑似病例中分离到两株病毒,通过电镜观察及P32基因扩增测序,与其他羊痘病毒比对后鉴定分离毒株为绵羊痘病毒,分别命名为SPV/Miquan/2013和SPV/Kuche/2013.SPV/Miquan/2013的P32蛋白同其他绵羊痘病毒的两个氨基酸位点发生明显突变.     

绵羊IGFBP-6基因的克隆及序列分析

以凉山半细毛羊为研究对象,克隆了其胰岛素样生长因子结合蛋白6基因(IGFBP-6),采用生物信息学方法进行遗传进化分析,对IGFBP-6蛋白的理化性质进行分析,并对其二级和三级结构进行预测。结果表明,绵羊IGFBP-6基因的CDS全长序列为711 bp,编码236个氨基酸,与牛、人、鼠的CDS同源性分别为96%、84%、74%,氨基酸序列同源性分别为95%、80%、69%;IGFBP-6蛋白大小为24.9 ku,理论等电点(p I)为8.83。遗传进化分析结果显示,绵羊IGFBP-6基因与山羊、牛等哺乳动物关系较近,与鱼类的亲缘关系较远。IGFBP-6蛋白存在明显的疏水性区域和亲水性区域,有1个信号肽、14个磷酸化位点、3个N-糖基化位点和7个O-糖基化位点;二级结构分析结果显示,IGFBP-6蛋白无规则卷曲、α-螺旋和β-折叠区域比例分别为77.54%、19.92%、2.54%;三级结构分析结果显示,IGFBP-6蛋白存在IGFBP_N和甲状腺球蛋白-Ⅰ型功能域。     

绵羊IGFBP-7基因的克隆及序列分析

试验以凉山半细毛羊为研究对象,采用RT-PCR方法克隆了其IGFBP-7基因的CDS全序列,生物信息学方法深入分析其序列。结果表明,凉山半细毛羊IGFBP-7基因的CDS序列为846 bp,编码282个氨基酸,与牛、人、鼠的CDS同源性分别为99%、95%、90%,氨基酸序列同源性分别为98%、93%、89%,Gen Bank登录号为FJ589640.1;IGFBP-7基因的氨基酸分子质量为29.0 ku,理论等电点(p I)为8.25;进化分析显示其与牛、山羊等哺乳动物关系较近,与斑马鱼、鲍等亲缘关系较远;IGFBP-7基因的蛋白质疏水性区域与亲水性区域间隔较为均匀分布,有1个信号肽、2个跨膜区、16个磷酸化位点、4个N-糖基化位点和1个O-糖基化位点;二级结构分析显示无规卷曲、α-螺旋和β-折叠区域分别为64.89%、19.86%、15.25%;三级结构分析显示存在IGFBP_N和Ig-like功能域。该试验为进一步研究绵羊IGFBP-7基因的功能奠定了基础。     

绵羊ACSL1基因cDNA序列克隆及其序列分析

为研究绵羊长链脂酰辅酶A合成酶1(Long-chain fatty acyl-Co A 1,ACSL1)基因功能,以绵羊肝组织总RNA为模板,应用RACE技术扩增得到了绵羊ACSL1基因完整的CDS区以及3'端序列,利用生物信息学软件对已知序列及其预测蛋白结构进行了分析。结果表明:绵羊ACSL1基因序列开放阅读框长为2 100 bp,共编码699个氨基酸,理论分子质量为82.76 ku,理论等电位点为5.38,为疏水性蛋白,无信号肽,不属于分泌蛋白,经序列对比发现其与牛和猪的同源性为97%。     

绵羊痘病毒多表位基因的构建及原核表达

通过计算机软件筛选出绵羊痘病毒基因组中心编码区的ORF90核蛋白、ORF112融合蛋白、ORF117糖蛋白、ORF55膜蛋白和基因组末端的ORF134宿主范围相关基因的6段T、B细胞优势抗原表位,以柔性氨基酸(GPGPG)作为接头,串联合成1条全新的多表位嵌合基因mE,将其克隆到原核表达载体pET-32中,采用酶切分析与序列测定方法筛选鉴定阳性重组质粒,构建pET32-mE质粒;用IPTG在不同条件下诱导表达,确定最佳表达条件,表达产物经SDS-PAGE分析。结果表明,重组蛋白是分子质量为41ku的融合蛋白。在IPTG浓度为0.5mmol/L,温度为37℃、诱导4h时目的蛋白的表达量最大,约占菌体的32%。Western-blotting试验表明,目的蛋白可被羊痘血清识别。     

羊口疮病毒安徽株023基因的原核表达与生物信息学分析

试验旨在克隆表达羊口疮病毒安徽株023基因,对该基因进行PCR扩增、亚克隆及表达,通过蛋白表达纯化后进行SDS-PAGE和Western blot鉴定,并利用生物信息学软件预测该基因编码的蛋白的理化性质、二级结构、信号肽、跨膜结构域等。结果显示,023基因全长819 bp,编码272个氨基酸,蛋白大小约为42 ku,主要以包涵体的形式表达且有良好的反应原性。生物信息学分析表明,该蛋白是亲水稳定蛋白,其中α-螺旋(h)占27.57%,延伸链(e)占17.28%,β-转角(t)占12.13%,无规则卷曲(c)占43.01%,无信号肽区域和跨膜结构域,可能存在30个磷酸化位点,4个B细胞抗原表位,3个CTL表位和3个Th表位。研究结果不仅有助于了解羊口疮病毒023基因的结构与功能,还能为建立快速诊断的检测方法提供参考。     

猪传染性胃肠炎病毒SC-Y株全基因组克隆及特性分析

    参考Genebank上收录的PUR46-MAD株(NC-002306)、TS株(DQ201447)和Purdue-115株(Z34093)核苷酸序列,设计并合成16对引物,应用RT-PCR技术成功地分16个片段扩增了猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)SC-Y株全长基因组序列,将这16个基因片段克隆,并测定其核苷酸序列.应用生物软件BioEdit对各测序结果进行序列拼接,确认SC-Y株基因组全长cDNA 28590 bp(GenBank收录号DQ443743),共包含7个开放阅读框.基因组5'端非编码区长315 nt,3'端非编码区长277 nt.与Miller M60株、Miller M6株和TS株相比,SC-Y株S基因缺失6个碱基.通过构建结构蛋白基因(S、sM、M和N)系统进化树,结果表明,SC-Y株可能与美国Purdue株来源于共同的祖先病毒.密码子偏爱性分析结果认为猪传染性胃肠炎病毒对以T和A结尾的密码子表现轻微的偏爱性,病毒基因表达选择酵母等真核系统可能更为合适.     

一株H9N2亚型禽流感病毒非结构蛋白基因的克隆及分子特征

采用RT-PCR方法对H9N2亚型禽流感病毒Ck/GS/2/99株非结构蛋白NS基因进行了扩增,将其克隆到pGEM-T easy载体后进行序列测定与分析。结果表明,该株病毒NS基因开放阅读框（ORF）由890个碱基组成,编码272个氨基酸。经同源性与系统发生树分析表明,该毒株NS基因都与Ck/NX/4/99株的核苷酸和氨基酸同源性在99%以上,与Ck/HB/31/00、Ck/SD/6/96和Sw/HK/10/98关系密切。     

伪狂犬病病毒Min-A株TK基因的克隆与序列分析

参考GeneBank收录的伪狂犬病病毒TK基因的序列设计了1对引物,对PRV Min-A株进行了PCR扩增,扩增产物克隆于pGEM-T Easy载体．对重组质粒进行限制性内切酶分析和基因测序,证实了克隆片段的可靠性．测序结果表明目的片段包含1个957bp的开放性阅读框(ORF),编码318个氨基酸组成的多肽．在TK ORF上游-22,-166,-199位存在3个GC框样序列,在终止密码子下游第110个核苷酸处的l306位存在有多聚腺苷加尾信号．PRV Min-A株与PRV Ea株、NIA-3株TK的核苷酸同源性分别为98．4％,97．9％;推导氨基酸的同源性分别为97．8％,97.2％．通过对α疱疹病毒TK氨基酸进行多序列比较．获得了在PRV TK氨基酸序列上的6个保守区间．推测这些保守氨基酸对于胸苷激酶(TK)结构的稳定性和催化活性的发挥是必需的。     

鸡传染性支气管炎病毒HN99株N基因的克隆与序列分析

根据GenBank中已发表的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)N基因序列,设计并合成1对特异性引物,用RT-PCR方法扩增IBVHN99株的N基因,并将其克隆入pMD18-T载体,转化感受态大肠杆菌Top10,提取pMD18-T-N重组质粒,进行酶切和PCR鉴定,并对阳性质粒进行测序,将测序结果与H52,Ark99,BJ等参考毒株进行序列分析。结果表明,N基因全长为1230bp,编码1条409个氨基酸组成的多肽;其核苷酸与H52,Ark99和BJ等毒株的同源性为88.4%~90.7%,氨基酸同源性为91.7%~94.4%;HN99株与H52,Ark99和BJ等其他各毒株的亲缘关系均较远,是1株新的IBV变异株。     

伪狂犬病毒Fa株gB、gC、gD基因的克隆与序列分析

对猪伪狂犬病病毒闽A株(Fa株)gB、gC、gD基因进行了克隆和序列测定,结果表明:gB、gC、gD基因序列全长分别为2 745 bp、1464 bp、1 215 bp,编码914、487、404个氨基酸残基组成的多肽。序列分析结果显示:Fa株与其他毒株gB、gC、gD基因核苷酸序列的同源性为94.9%~99.9%,氨基酸序列的同源性为91.4%~99.9%。不同PRV毒株gB、gC、gD基因在核苷酸和氨基酸水平上高度保守。基于gB、gC、gD基因的进化树分析表明,中国分离毒株与韩国分离毒株可归为一个进化分支,而日本分离株与欧美分离株归为另一个分支。在前一个分支里,闽A株与鄂A株的亲缘关系特别近,3个基因的同源率均在99.5%以上。在gB蛋白氨基酸序列全长上中国分离株(Ea株、Fa株)比欧美分离株多了1个氨基酸,氨基酸残基的突变主要集中在第50~100氨基酸。在gC基因序列第186~211 bp,Ea株、Fa株比欧美分离株多插入了21个碱基。在gD蛋白氨基酸序列全长上,Ea株、Fa株比其他分离株多了2~6个氨基酸。在gD基因序列第803~837 bp,Fa株核苷酸AGGCCC串联重复最多,达到7个。