应用质粒PTK探针鉴定锥虫的初步研究

用^32P标记质粒探针PTK1、PTK1.1和PTK1．2，对12株中国伊氏锥虫的斑点杂交试验显示，3个探针均能与8株具有正常动基体的伊氏锥虫杂交，而不与其余4株异常动基体伊氏锥虫杂交，对正常动基体株的敏感度为10^2虫体。探针PTK1亦能与马媾疫锥虫杂交，敏感度为10^2个虫体。但PTK1与布氏锥虫仅发生微弱的杂交反应．敏感度为10^5个虫体。试验表明伊氏锥虫株之间的kDNA微环是同源的，伊氏锥虫与马媾疫锥虫和布氏锥虫的kDNA微环存在着共同序列。     

伊氏锥虫、马媾疫锥虫、布氏锥虫、刚果锥虫的18S rDNA部分序列测定与系统发育关系

对伊氏锥虫（Trypanosoma evansi）：新疆株（XJCA）、湖北株（HBM）、云南株（YNB）、广东株（GDB2）；马媾疫锥虫（Trypanosoma equiperdum）、布氏锥虫（Trypanosoma brucei）、刚果锥虫（Trypanosoma congolense）提取基因组DNA，根据已报道的伊氏锥虫株18SrDNA基因序列设计合成引物，用PCR扩增了锥虫虫株基因组DNA,伊氏锥虫新疆株、湖北株、云南株、广东株、布氏锥虫、刚果锥虫均为373bp的片段；马媾疫锥虫为372bp的片段，PCR产物经电泳鉴定后用试剂盒回收纯化，纯化后PCR产物经连接、转化后测序，将测得的序列用DNAMAN软件分析并与国外已发表的相应序列进行了同源性比较，并绘制了系统发育进化树。结果与国外AJ009153、AJ223564、D89527株同源性达到99％～100％，与另外11株同源性75％。本研究为锥虫分子流行病学研究及分类研究打下基础。     

伊氏锥虫和媾疫锥虫蛋白组分的电泳分析

应用SDS—PAGE和IEF电泳对伊氏锥虫和媾疫锥虫的蛋白组分进行了分析.在SDS—PAGE中,伊氏锥虫有21条带.媾疫锥虫有19条带,两种虫体的蛋白质区带在分子量40000～90000之间存在差异,尤其表现在表面糖蛋白上,伊氏锥虫为43000,媾疫锥虫为60000.在IEF电泳中,伊氏锥虫出现26条带,媾疫锥虫出现33条带,两种虫体的蛋白质区带在等电点4.8～5.6之间相同,而在5.6～7.0之间存在差异.本实验还对马媾疫锥虫的蛋白质进行了双相电泳分析,显示出86个多肽斑点.     

锥虫长期超低温保藏方法的研究

作者观测不同保护剂、稀释液、ＰＨ值、降温方法、复苏温度、冻融次数、液相气相交替以及解冻后在普通冰瓶中存放时间对伊氏锥虫浙江虫浙江虫株的感染性及致病力的影响。在此试验基础上，又对伊氏锥虫的６个不同虫株、媾疫锥虫、铡果锥虫、布氏锥虫等４个种的９个早株，进行了超低温保藏试验和长期保藏效果观察。已测定的有效保藏期伊氏锥虫达５７４－３２００天，媾疫锥虫达２８６６天，则果锥虫达７６３天，布氏锥虫７８３天。通过     

伊氏锥虫不同地理株对小鼠致病性的比较试验

伊氏锥虫是地理分布广泛的锥虫，可以引起骆驼、马、黄水牛、犬和大小鼠等动物的伊氏锥虫病，宿主中以马、犬和大小鼠等为高度易感动物，感染后往往发病急，死亡快，由于其因地理和宿主条件的不同而表现出感染力和毒力的差异[1]，我们进行了不同地理株对小鼠的感染力及其毒力的比较观察。材料和方法材料1、伊氏锥虫：伊氏锥虫云南株于1987年在宜良分离自云南水牛体内，广东株于1981年在阳江分离自广东水牛体内，安徽株分离自安徽水牛体内，江苏株分离自江苏高邮水牛体内，新疆株分离自新疆骆驼体内，以上伊氏锥虫都经小鼠繁殖后保存于液氮中…     

伊氏锥虫补反抗原与媾疫锥虫补反抗原诊断马媾疫病的比较

<正> 用补体结合反应诊断马媾疫,所用的抗原有伊氏锥虫补反抗原和媾疫锥虫补反抗原,为了探讨两种抗原对马媾疫的检出率,我们做了对比试验,现将试验情况分述如下: 试验抗原一、伊氏锥虫补反抗原,成都兽医生物药品制造厂出品。二、媾疫锥虫补反抗原,陕西省兽医研究所制造。     

同一克隆两个不同变异体的伊氏锥虫在兔体内抗原变异研究

为了解伊氏锥虫在兔体内感染后期抗原变异的情况及较同一克隆不同变异体锥虫在兔体内抗原变异情况,用伊氏锥虫安徽株单虫克隆ＳｈＴａｔ１．２感染兔,在兔体３０天中每隔３天及感染后５１、５４、５７天（兔５８天死亡）分离兔血中锥虫并克隆,获得１３个克隆锥虫群体,经间接免疫荧光试验和ＡＢＣ酶标记试验鉴定为１０个抗原性互不相同的抗原变异体（Ｖａｒｉａｂｌｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｔｙｐｅ,ＶＡＴ）,其中早期（感染锥虫３     

伊氏锥虫抗原变异型及其优势代表变异体的分离鉴定

以连续克隆分离的方法,从1株水牛伊氏锥虫中分离到40个克隆群体,从中分离鉴定出18个抗原变异型。经间接免疫荧光试验检测,发现其中2个抗原变异型（即HbTatl.18和HbTatl．15）分别能与约80％和60％克隆群体的血清发生较强的阳性反应,初步确定这2个抗原变异型为该虫株的优势代表变异体。这为伊氏锥虫免疫预防、免疫诊断、分子诊断以及遗传进化等的研究奠定了良好的基础。     

12株中国伊氏锥虫对苏拉明的药敏试验

用体外培养生长抑制试验检测了中国伊氏锥虫安徽水牛株（AHB）、广东阳江水牛株（GDB1）、广东水牛株（GDB2）、广东马株（GDH）、广西骡株（GXM）、湖北骡株（HBM）、湖南水牛株（HNB）、江苏高邮水牛株（JSB1）、江苏盱眙水牛株（JSB2）、新疆骆驼株（XJCA）、云南水牛株（YNB）、浙江水牛株（ZJB）对苏拉明的敏感性。它们的50％生长抑制浓度（IC50）依次为0．114、0．041、0．120、0．1490．752、0．252、0．171、0．127、0．339、0．094、0．106、0．118ng/L。结果显示，不同虫株的伊氏锥虫对苏拉明的敏感性明显不同，提示中国伊氏锥虫不同虫株存在抗药性差异。在12株伊氏锥虫中，GXM株对苏拉明的抗药性水平明显高于其他株。小鼠体内治疗试验显示，GXM株以10mg/kg剂量苏拉明治疗无效，在临床上表现出一定的抗药性，而GDB1株以10mg/kg剂量苏拉明治疗则全部治愈。由此可见，体外药敏试验结果与体内治疗结果一致。这一结果提示，多数中国伊氏锥虫株对苏拉明的敏感性偏低，少数虫株已表现出一定的抗药性。     

伊氏锥虫新疆株在动物体内抗原变异程序的观察

为了探明伊氏锥虫在动物体内抗原变异,以伊氏锥虫新疆株克隆感染兔,每３天采兔血１次,共采血５次,并用环磷酰胺处理的小白鼠对各分离期锥虫予以克隆,获得５个锥虫克隆群体,经ＡＢＣ－酶标试验和间接免疫荧光试验,对各克隆锥虫抗原进行鉴定,结果：获得５个表面抗原性互不相同的克隆群体,说明伊氏锥虫新疆株第１次抗原变异发生在４－６日内,以后每３天变异１次,本研究为进一步探明伊氏锥虫抗原变异规律打下了基础。     

伊氏锥虫同工梅,蛋白质和抗原组分的比较研究

本文采用生化技术对八个中国伊氏锥虫株及一个布氏锥虫株的同工酶、蛋白质的抗原组分进行比较研究。根据同工酶电泳结果，可将伊氏锥虫和与其形成形态上不能区分的布氏锥虫区别开来，亦可将伊锥虫分为两个酶株群（Ｚ１、Ｚ２）。根据ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳，等电聚焦电泳和免疫印迹试验的结果，可将酶株群Ｚ１分成五个同多肽群（株）。本研究结果表明：中国伊氏锥虫遗传传 变异程度较低，是一个相对稳定的种群。     

论马媾疫锥虫与伊氏锥虫分类性状之异同

马媾疫锥虫(Trypanosoma equiperdum Doflein,1901)1894年在阿尔及利亚发现,是马属动物通过交配经生殖器粘膜感染的一种慢性原虫病的病原。伊氏锥虫[T.evansi(Steel,1885)Balbiani 1888]1880年发现于印度的马和骆驼,是由吸血昆虫虻类等传播的马、牛和骆驼锥虫病的病原。两种锥虫同属锥虫科锥虫属布氏组。迄今为止,各种教材和专著中,都认为这两种锥虫在形态上无区别,但其生物学特性则彼此不同。本文援引有关文献资料,结合笔者的第一手材料,对马媾疫锥虫与伊氏锥虫分类性状诸问题,进行如下对比性分析。     

伊氏锥虫不同株的表面变异糖蛋白提取和重要特性比较

抗原变异是锥虫的重要特征，主要表现于锥虫表面变异糖蛋白（VariableSurfaceGlycoprotein，VSG）的变化，而且锥虫的VSG变异非常频繁，国外对布氏锥虫的VSG研究较多，对中国伊氏锥虫的VSG，杨汉春［1］、李国清等［2］曾作过分离和生化分析，但对中国不同地理宿主株VSG的分离比较尚无报道。而我国北方新疆骆驼伊氏锥虫和南方牛、马伊氏锥虫存在来源、地理、宿主和生化特性的变异[3,4]，我们对这两个虫株的VSG进行了分离、纯化和特性比较研究，以期为伊氏锥虫的抗原变异和伊氏锥虫病的防治研究提供依据。1材料与方法1．1材料和试剂…     

伊氏锥虫单一或混合抗原免疫小鼠保护性试验

采用广东克隆（广东水牛伊氏锥虫单虫克隆）、安徽克隆１（安徽水牛伊氏锥虫单虫克隆）、安徽克隆２、新疆克隆（新疆骆驼伊氏锥虫单虫克隆）作单一抗原或混合抗原免疫小鼠试验。用安徽克隆１和新疆克隆单一抗原免疫小鼠，再用相应同株克隆攻击，其保护率在８０％以上，而用异株克隆攻击（安徽克隆１、新疆克隆或广东克隆），保护率低于１７％，表明安徽、新疆和广东伊氏锥虫各株间免疫原性存在差异。用新疆克隆抗原和安徽克隆２抗原混合免疫，再用新疆克隆和安徽克隆２攻击，保护率在８０％以上，用新疆克隆抗原和广东克隆抗原混合免疫，再用新疆克隆和广东克隆攻击，保护率亦在８０％以上，且在免疫后１～２个月仍有效。对新疆克隆抗原和广东克隆抗原混合免疫小鼠脾细胞作体外增殖试验，用不同抗原按５００ｍｇ／Ｌ和１２５ｍｇ／Ｌ高低２种剂量刺激，均产生明显增殖，表明各锥虫抗原存在免疫交叉，但在高剂量组，用同株克隆的刺激增殖效果（ＳＩ）高于异株克隆。     

马媾疫锥虫SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种特异、快速的媾疫锥虫检测方法,本研究通过PCR方法从马媾疫锥虫动基体基因组中扩增得到395 bp的特异的保守序列,将其克隆到pMD-18T载体中构建重组质粒标准品,以10倍倍比稀释的质粒标准品为模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立马媾疫锥虫荧光定量PCR的检测方法。结果表明:该方法的检测灵敏度可达到1拷贝/μL,并且与马属动物其他传染病无交叉反应。其组间及组内变异系数分别小于3.183%和3.842%。该方法的建立为快速及特异性检测马媾疫锥虫提供了有效的方法。     

泰氏锥虫抗原制备及实验室诊断研究

应用体外培养的泰氏锥虫制备可溶性抗原Ⅰ、抗原Ⅱ和代谢抗原.经测定,其蛋白含量每毫升分别为6.5mg、7.4mg和7.1mg.薄层等电聚焦电泳测定结果表明,抗原Ⅰ出现22条区带,抗原Ⅱ21条区带,代谢抗原28条区带,对照的伊氏锥虫琼脂免疫扩散抗原14条区带.经分析,泰氏锥虫抗原和伊氏锥虫抗原有4条区带在同一迁移率上.琼脂免疫扩散反应中,3种泰氏锥虫抗原均与相应免疫兔血清发生沉淀反应,抗原Ⅰ出现1条致密沉淀线,抗原Ⅱ和代谢抗原出现2～3条沉淀线,抗原效价为1:4～16.免疫电泳显示了类似的结果,抗原Ⅰ与免疫兔血清出现1条弧形沉淀线,抗原Ⅱ和代谢抗原与免疫兔血清出现了3条弧形沉淀线.间接血凝试验结果表明,泰氏锥虫自然感染牛血清效价为1:20～40,免疫兔血清为1:1280～5120.所制泰氏锥虫抗原对伊氏锥虫和媾疫锥虫血清也能很好地发生交叉反应,3份伊氏锥虫病马血清和3份伊氏锥虫人工感染兔血清血凝效价分别为1:10～40和1:8～1024;5份媾疫马血清有4份血凝效价为1:20～320.4份环形泰勒虫病牛血清均为阴性.     

伊氏锥虫动基体DNA序列比较

对伊氏锥虫新疆骆驼株（ＸＪＣＡ）、安徽水牛株（ＡＨＢ）和云南水牛株（ＹＮＢ）的动基体ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增后,用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧核糖核酸法测定扩增产物的序列。结果表明,各虫株间ＤＮＡ序列同源性为９７％。内聚分析表明,ＡＨＢ株与ＸＪＣＡ株相似性高属一类,而ＹＮＢ株与中国伊氏锥虫ＳＨ株相似性高属另一类。证明我国不同伊氏锥虫在动基ＤＮＡ序列上存在一些差别,这可能由于点突变的缘故。     

伊氏锥虫同工酶、蛋白质和抗原组分的比较研究

本文采用生化技术对八个中国伊氏锥虫株及一个布氏锥虫株的同工酶、蛋白质和抗原组分进行比较研究。根据同工酶电泳结果,可将伊氏锥虫和与其形态上不能区分的布氏锥虫区别开来,亦可将伊氏锥虫分为两个酶株群(Z1、Z2)。根据SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳和免疫印迹试验的结果,可将酶株群Z1分成五个不同多肽群(株)。本研究结果表明,中国伊氏锥虫遗传变异程度较低,是一个相对稳定的种群。     

两株水牛伊氏锥虫内转录间隔区基因序列的测定与系统进化关系

为研究从水牛分离到的伊氏锥虫广西株和湖北株的分类学地位,对2株伊氏锥虫的核糖体基因内转录间隔区(ITS1-5.8S-ITS2)基因进行了克隆和测序分析.用CLUSTALXl.83软件多重比对分析了序列差异,应用MEGA4.0软件绘制系统进化树.结果表明,这2株水牛伊氏锥虫的ITS1-5.8S-ITS2 rRNA基因扩增产物分别为1 102 bp和1 095 bp,序列存在多态性,其中广西株的ITS-1序列长为340 bp,ITS-2序列长为582 bp,湖北株的ITS-1序列长为339bp,ITS-2序列长为587 bp.系统进化分析显示,这2株伊氏锥虫分布在同一大枝的不同亚群中.     

检测伊氏锥虫循环抗原的McAb-RPHA试验

用一株抗伊氏锥虫、马媾疫锥虫和布氏锥虫共同抗原(与泰氏锥虫等抗原无交叉反应)的单克隆抗体建立了检测伊氏锥虫循环抗原(TcA)的反向间接血凝试验。用以检测人工感染兔,于感染后8～10天TcA转阴;如不治疗直至观察期结束持续阳性;治疗后一周即转阴。用以检测疫区36份虫血症阳性水牛血清,25份阳性(69.44％);16份虫血症阴性、IHA阳性水牛血清,3份阳性;25份虫血症和IHA阴性水牛血清,全部阴性。