团头鲂形态发育相关基因HoxB1b的克隆及功能研究

脊椎动物Hox族基因是一类重要的生长和发育调控基因,它编码具有螺旋—转角—螺旋结构的转录因子,能与下游靶基因特定区域结合并激活表达,从而调节脊椎动物胚胎发育过程中前后轴的形态建成。利用cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆了团头鲂(Megalobrama amblycephala)HoxB1b基因的全长cDNA序列,并研究了该基因的表达模式。结果表明:(1)团头鲂HoxB1b基因cDNA全长为1 479 bp,其中包括一个编码306个氨基酸残基的921 bp阅读框,聚类分析结果表明,该基因与斑马鱼、红鳍东方鲀、青鳉的相似度分别为89%、45%、40%,在脊椎动物中具有一定的保守性;(2)RT-PCR分析结果显示,HoxB1b在团头鲂胚胎发育过程的各时期均有稳定表达,但在成熟卵中未检测到该基因的表达,表明该基因属非母源表达类型。进一步的整胚原位杂交结果显示,HoxB1b在团头鲂不同时期胚胎存在明显的空间表达差异,受精后20 h(20 hours post fertilization,20hpf)胚胎主要在后脑表达,受精后40 h(40hpf)胚胎除了在后脑表达外,在胸鳍也检测到表达;(3)HoxB1b基因在团头...     

矮牵牛PhSPL9b基因的克隆及功能分析

为研究SPL（SQUAMOSA-promoter binding protein-like）转录因子在矮牵牛成花转换中的作用,克隆矮牵牛PhSPL9b基因,并将该基因对应的miR156/157靶位点进行点突变获得rPhSPL9b,将PhSPL9b和rPhSPL9b分别构建超量表达载体,转化矮牵牛和拟南芥,最终获得拟南芥35S∶∶PhSPL9b与35S∶∶rPhSPL9b转基因植株以及矮牵牛35S∶∶PhSPL9b转基因植株。研究结果显示,过表达PhSPL9b和rPhSPL9b导致拟南芥莲座叶显著减少,花期明显提前,其中35S∶∶rPhSPL9b转基因表型更为明显;过表达PhSPL9b促进矮牵牛提前开花。RT-PCR和qRT-PCR分析结果显示,表型明显的转基因株系中,PhSPL9b基因表达量均显著高于对照。转录激活实验结果表明,PhSPL9b是一个具有转录激活活性的转录因子。以上结果表明,矮牵牛PhSPL9b基因对开花时间具有重要调控作用,其功能具有保守性,同时,它可能是通过转录激活下游基因的表达而影响植物开花。     

牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因的克隆及序列分析

为了解牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因的特点,根据GenBank已公布的牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因序列设计4对引物,每个基因分两段扩增,测序并拼接,首次克隆牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因。序列分析表明,扩增到的牦牛应激型 HSPA1A基因全长2 134 bp,开放阅读框全长1 926 bp,编码641个氨基酸,分子质量为70.26 ku; HSPA2基因全长1 911 bp,开放阅读框全长1 911 bp,编码636个氨基酸,分子质量为69.85 ku。将 HSPA1A和 HSPA2基因开放阅读框编码的氨基酸序列进行ScanProsite分析,均得到3个HSP70蛋白家族标记。核苷酸序列同源性分析表明, HSPA1A和 HSPA2基因具有较高的保守性,牦牛与牛的 HSPA1A和 HSPA2基因核苷酸序列同源性最高,分别为99.8%和99.1%。遗传进化关系分析表明,牦牛与牛的应激型 HSPA1A和 HSPA2基因亲缘关系最近。     

苹果矮化砧木T337 MdCBB1基因的克隆与表达分析

为研究油菜素内酯(BR)对苹果矮化砧木T337株高调控机制的影响,以T337盆栽苗为试材,利用RT-PCR技术从T337中分离出BR合成关键基因MdCBB1.1和MdCBB1.2,二者的开放阅读框均为1 707bp,分别编码一个568个氨基酸的蛋白,分子质量分别为6.624 1×104 ku和6.622 8×104 ku。生物信息学分析结果显示,MdCBB1.1和MdCBB1.2基因编码的蛋白含有FAD_binding_4和GlcD 2个明显的结构域,为非核蛋白,属于植物CBB1蛋白家族。表达分析结果显示,MdCBB1.1和MdCBB1.2基因在T337不同组织均有表达,但是顶梢和根中的表达量明显高于其他组织(P0.05)。并且外源芸苔素内酯(BL)处理能够上调二者在木质部中的表达(P0.05)。     

大豆GmPIN2b调控根系响应低磷胁迫的功能研究

目的 研究生长素转运蛋白PIN基因家族在大豆Glycine max 根系适应低磷胁迫中的功能。方法 对大豆23个GmPIN家族成员进行进化树分析和表达模式分析,并进一步对GmPIN2b进行功能分析。结果 大豆23个GmPIN家族成员分散在7个不同的亚族,其中,GmPIN2a、GmPIN2b和GmPIN9a、GmPIN9d与拟南芥Arabidopsis thaliana的AtPIN2位于同一亚族。不同GmPIN家族成员在大豆中的组织表达定位及其受低磷调控的表达模式不同,其中,GmPIN2b在大豆根系中的表达水平在低磷胁迫6 d后显著上调,回补表达GmPIN2b能够部分恢复Atpin2突变体的表型。无论在低磷还是高磷条件下,回补表达GmPIN2b的转基因植株鲜质量和主根长均显著高于Atpin2突变体;而且回补表达GmPIN2b显著提高了Atpin2突变体在低磷条件下的一级侧根数,以及高磷条件下根系对重力的敏感性。结论 GmPIN2b在大豆根系形态建成响应低磷胁迫的过程中起重要的调控作用。     

甜樱桃(Prunus avium L.)LEAFY基因的克隆及表达模式分析

为探索LEAFY基因在甜樱桃花芽分化过程中的表达及作用,以甜樱桃(Prunus avium)‘红蜜'(Hongmi)为试材,利用同源克隆和RACE方法克隆甜樱桃中LEAFY同源基因cDNA全序列,对其序列进行分析,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对该基因在花芽分化过程中的表达量进行鉴定。结果显示:在甜樱桃中具有3中不同长度类型,分别为1 532、1 498和1 410bp,主要由3′UTR区长度不同所导致,开放阅读框长1 233bp,编码410个氨基酸,推测蛋白分子量约为45.6ku,等电点约为6.88。结构预测NCBI序列比对发现其氨基酸序列与其他植物中同源基因相似性均在70%以上,故命名为PaLEAFY。qRT-PCR分析发现,在果实成熟至成熟后33d,PaLEAFY在花芽中的表达量由高变低,果实成熟后45d,PaLEAFY表达量开始急剧升高并维持至69d,69d之后表达量再次升高,并于果实成熟后99d达到最高。此外,PaLEAFY在甜樱桃花的柱头中的表达量最高,其次是花瓣、雄蕊和花萼,在甜樱桃的茎和叶中的表达量非常低。说明PaLEAFY参与甜樱桃花芽分化及花发育过程。     

盘基网柄菌DJ-1基因的克隆及生物信息学分析

目的:盘基网柄菌是研究药物作用机理、细胞信号转导和神经退行性病变的模式生物。对盘基网柄菌DJ-1基因进行克隆和序列分析,可以为研究DJ-1基因在肿瘤抑制和神经退行性病变中的作用机理奠定基础。方法:以盘基网柄菌总基因组为模板,利用Primer5.0设计特异性引物扩增盘基网柄菌DJ-1基因,并将扩增的DJ-1基因插入大肠杆菌原核表达质粒pUC18,进行酶切、连接、E.coliDH5α菌株转化和筛选、DJ-1序列测定以及DJ-1的核苷酸和蛋白质序列分析。结果:盘基网柄菌DJ-1基因全长618 bp,无内含子,共编码205个氨基酸。在系统发育上与梭菌属形成两个分支,本属内D. discoideum和D. purpureum亲缘关系相近。盘基网柄菌DJ-1蛋白质的分子量约为22.87 kD,其等电点为5.31,含86个非极性氨基酸和119个极性氨基酸,无信号肽识别序列和跨膜结构。DJ-1蛋白质二级结构以α-螺旋、无规卷曲和延伸链为主。Pretotar软件预测DJ-1位于盘基网柄菌细胞内质网上。结论:盘基网柄菌DJ-1基因与人类DJ-1基因具有高度相似性,对其进行克隆和生物信息学分析可以为今后利用盘基网柄菌模型研究DJ-1基因的功能和机制提供理论支持。     

草莓FaSKP1-1基因的克隆与表达分析

为研究草莓中SCF复合体的功能,以栽培草莓品种‘74’为试材,采用同源克隆的方法分离出2个SKP1基因。这2个基因核苷酸序列全长均为519bp,核苷酸序列相似性为98.46%,氨基酸序列相似性为98.84%,并具有特殊的‘GVDED’尾巴结构,分别命名为FaSKP1-1a和FaSKP1-1b(基因登录号分别为KU975057和KU975058)。RT-PCR和dCAPS分析发现FaSKP1-1a和FaSKP1-1b在草莓根、茎、叶、花托、花粉、花柱、果实中均高表达,在花瓣中表达量低。上述结果表明FaSKP1-1可能在草莓SCF复合体的形成过程中发挥重要作用。     

GhCDPK4基因的克隆和功能分析

为了研究棉花中GhCDPK4基因在响应非生物胁迫中所起的作用,通过PCR的方法克隆GhCDPK4基因,利用基因重组技术,构建植物过表达载体,采用农杆菌介导的叶盘法转化模式植物烟草,分析干旱和盐胁迫处理对转基因烟草表型和生理生化指标的影响。本研究成功克隆了属于棉花CDPK家族的基因GhCDPK4,构建了植物过表达载体pCAMBIA2300-GhCDPK4。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测发现转基因烟草中GhCDPK4基因高水平表达,并且转基因烟草相比于野生型烟草表现出较强的耐旱和耐盐性,其中SOD、POD和CAT活性显著升高,而相对电导率和MDA含量降低。研究结果表明GhCDPK4基因可正向参与应答干旱和盐胁迫。     

黄鳝csf1r基因的克隆及时空表达特征分析

【目的】克隆黄鳝csf1r基因,并对其时空表达特性进行分析,为探明csf1r基因在黄鳝不同体色形成中的作用奠定基础。【方法】采用RACEs（Rapid-amplification of cDNA ends）技术从黄鳝皮肤cDNAs中克隆得到csf1r基因的全长cDNA序列,对其编码蛋白进行生物信息学分析。采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法检测csf1r基因在黄鳝不同组织、不同发育时期胚胎或个体及3种体色黄鳝（黄黑斑鳝、碎花斑鳝和隐花斑鳝）皮肤和肾脏中的相对表达量,分析该基因的表达特征。测定3种体色黄鳝肝脏中的碱性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和总抗氧化能力（T-AOC）。【结果】黄鳝csf1r cDNA序列全长为4 430 bp（GenBank收录号：OP589303）,其编码区长度为2 937 bp,编码978个氨基酸,存在免疫球蛋白结构域和蛋白激酶催化结构域2个保守结构域。荧光定量PCR结果表明,csf1r基因在黄鳝脑、精巢、卵巢、肠、心脏、肾脏、肝脏、肌肉、皮肤和脾脏等组织中均有表达,在脾脏和心脏中表达量较高,其次是肾脏、皮肤和肌肉,卵巢中表达量最低;csf1r在胚胎眼晶体形成期开始大量表达,显微观察发现该时期胚胎的躯干上开始有色素颗粒出现。在3种体色黄鳝皮肤和肾脏中,csf1r基因在黄黑斑鳝的皮肤中表达量最低,而在其肾脏中表达量最高。3种体色黄鳝肝脏氧化应激指标测定结果发现,黄黑斑鳝肝脏中的碱性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和总抗氧化能力比其他2种体色黄鳝高,但是差异未达显著水平。【结论】csf1r基因可能不仅参与了黄鳝体色的形成,还与黄鳝非特异性免疫相关。     

溴氰菊酯在团头鲂体内的富集消除规律研究

【目的】对溴氰菊酯(DM)在团头鲂体内的富集及消除规律进行研究,为水环境中污染物残留及水产品的质量安全问题研究提供理论依据。【方法】在(18±0.5)℃水温下,以团头鲂为研究对象,经5μg/L DM药浴后,利用气相色谱法分析不同时间DM在血浆、肝脏、肌肉、皮肤、鳃、胆组织中的药物残留,采用3p97药代动力学软件对DM在血浆中的血药浓度时间数据进行拟合,构建DM在各组织中的消除曲线方程。【结果】DM在血浆中的峰值浓度(Cmax)为75.96μg/L,达峰时间(Tmax)为7.05h,药-时曲线下面积AUC为1 524.69(μg·h)/L,吸收半衰期(T1/2(ka))为3.66h,消除半衰期(T1/2(ke))为6.73h;DM在团头鲂各组织中富集的浓度从高到低依次为鳃血浆肝脏皮肤肌肉胆;肝脏、肌肉、皮肤、鳃及胆组织对DM的消除半衰期(T1/2)分别为13.75,12.55,12.55,5.35和3.28d。团头鲂血浆、肝脏及鳃组织中的DM含量于药浴12h后明显降低,各组织中的DM含量84h后均降至(14.37±11.65)μg/kg以下,低于我国规定的DM在鱼肌肉中的最高残留限量(30μg/kg);但低含量DM在团头鲂体内维持时间较长,768h(32d)时在皮肤、肝脏、鳃及肌肉组织中仍有残留。【结论】DM在团头鲂体内吸收分布迅速,在鳃、血浆和肝脏组织中富集浓度较高,其消除时间也较长,药浴后768h(32d)在大部分组织中仍能检出。     

团头鲂咽齿发育相关基因系统进化及其表达分析

为探明鱼类咽齿发生发育的分子机制,以我国特有的经济鱼类团头鲂（Megalobrama amblycephala）为研究对象,通过团头鲂全基因组序列Blast获得团头鲂分泌型钙结合磷蛋白（secretory calciumbinding phosphoprotein,SCPP）家族基因的cDNA序列,采用实时荧光定量的方法比较分析SCPP家族基因在团头鲂咽齿发生发育关键时期第四、第五鳃弓中的表达情况,以及在1龄团头鲂不同组织中的表达情况,筛选调控咽齿发育的关键调控基因。研究结果显示,团头鲂enam、scpp1、ambn、scpp9、odam、spp1与斑马鱼具有较高同源性,进化树中距离较近;通过比对不同脊椎动物enam与odam这2个基因编码的氨基酸序列,发现在鱼类中均存在2段氨基酸序列的缺失。1龄团头鲂不同组织的SCPP家族基因定量表达结果显示,enam、scpp1、ambn、scpp9和spp1在第五鳃弓（有咽齿）和肋骨里面有很高的表达量,与其他组织中的表达水平大多存在显著性差异（P<0.05）,且在第四鳃弓（无咽齿）中的表达量最低。团头鲂第四、第五鳃弓早期（9~54 d）咽齿发育阶段定量结果显示enam、ambn、scpp9、odam、spp1在第五鳃弓表达量显著高于第四鳃弓表达量,其中scpp9在第五鳃弓中的表达量极高。以上研究结果表明enam、scpp1、ambn、scpp9、odam、spp1均参与团头鲂咽齿发育的调控,其中scpp9在团头鲂咽齿发育过程中调控作用较为明显,推测其与咽齿发育关系更为密切。     

两种复合式池塘养殖团头鲂的氮磷收支分析

为比较团头鲂在分隔式和序批式两种复合式池塘养殖中的氮磷收支情况,于2016年8—11月分别选取分隔式、序批式和传统团头鲂养殖池塘进行采样分析。结果显示,饲料是池塘养殖团头鲂氮磷的主要来源,饲料氮输入比例分别为传统池塘(68. 53%)分隔式池塘(72. 03%)序批式池塘(76. 22%),饲料磷输入比例分别为传统池塘(42. 87%)分隔式池塘(53. 37%)序批式池塘(56. 64%); 3种池塘养殖中,氮支出主要是底泥沉积和水体排放,其中,序批式池塘氮的底泥沉积和水体排放量最低,其次是分隔式池塘,传统池塘的底泥沉积和水体排放量最大;磷支出主要是养殖水产品产出,养殖水产品磷占磷输出比例分别为分隔式池塘(54. 55%)传统池塘(52. 20%)序批式池塘(43. 38%)。结果表明,复合式养殖池塘中的氮磷沉积和水体排放所占支出比例低于传统池塘,通过构建复合式养殖池塘可以减少氮磷沉积与排放,提高氮磷利用率,提高饲料利用效率,尤其是序批式池塘用于团头鲂养殖有较高的物质利用效率。     

团头鲂SOCS家族基因的分子特征及其对嗜水气单胞菌胁迫的响应

为探究团头鲂细胞因子信号转导抑制因子（suppressor of cytokine signaling,SOCS）家族基因的序列特征和功能,从NCBI数据库获取socs1、socs2、socs3a、socs3b、socs4、socs5a、socs5b、socs6、socs7、socs9共10个socs基因的cDNA序列,利用ExPASy、SMART等在线网站对其进行生物信息学分析,预测团头鲂10个SOCS的理论分子质量、理论等电点与结构域等分子特性。系统进化（MEGA 6软件）分析结果显示,10个SOCS可分为2个亚族：Ⅰ型亚族包括SOCS4、SOCS5a、SOCS5b、SOCS6、SOCS7与SOCS9,Ⅱ型亚族包括SOCS1、SOCS2、SOCS3a与SOCS3b。半定量PCR结果显示,健康团头鲂10个socs基因在被检测组织中具有明显的组织特异性,socs1、socs2、socs3在多个组织中表达量较高。在嗜水气单胞菌感染后,采用实时定量PCR检测团头鲂socs基因在脾脏、体肾、头肾中的表达量,其中socs1、socs2、socs3a、socs3b表达量均显著上调。结果表明,团头鲂SOCS家族基因的表达模式各不相同,预示其功能的多样性,其中socs1、socs2、socs3在免疫应答中发挥重要作用。     

不同生长阶段团头鲂的赖氨酸需要量研究

为探讨不同生长阶段团头鲂的赖氨酸需要量,以不同生长阶段的团头鲂[规格Ⅰ:(52.49±0.18)g,规格Ⅱ:(101.85±1.8)g]为研究对象,配制赖氨酸含量为1.29%、1.71%、2.09%、2.48%、2.88%和3.27%的等氮等能饲料进行10周养殖实验。结果表明:与对照组相比,(1)2.88%和3.27%组显著提高了规格Ⅰ的增重率、特定生长率和蛋白质效率,显著降低了饵料系数和摄食量;2.48%组显著提高了规格Ⅱ的特定生长率,显著降低了饵料系数,3.27%组提高了规格Ⅱ的特定生长率和摄食量;(2)2.88%和3.27%组分别显著提高了规格Ⅰ和规格Ⅱ的鱼体粗脂肪含量;(3)2.48%组显著降低了规格Ⅰ和规格Ⅱ的血清谷丙转氨酶活性,显著提高了规格Ⅰ的尿素含量;3.27%组显著提高了规格Ⅱ的血清白蛋白、总蛋白和球蛋白含量;表明适宜水平赖氨酸可能对鱼体肝脏具有保护作用,能够提高其代谢及免疫力;(4)2.48%、2.88%和3.27%组均显著提高了规格Ⅰ和规格Ⅱ的血清赖氨酸含量,显著降低了规格Ⅰ的血清精氨酸和总必需氨基酸含量。以鱼体特定生长率为评价指标,经折线模型回归分析得到规格Ⅰ和规格Ⅱ的最适赖氨酸需要量分别为饲料干重的2.07%和2.19%(饲料粗蛋白含量的6.27%和6.63%)。     

团头鲂肠道菌株MA35产纤维素酶分离纯化及性质分析

对团头鲂肠道菌株Aspergillus niveus MA35发酵得到一种内切型纤维素酶采用Q-琼脂糖凝胶FF阳离子交换层析和葡聚糖G-100凝胶层析进行分离纯化。酶的比活力由22.3 U/mg提高到30.6 U/mg。SDS-PAGE结果显示,酶的分子量约为45 ku。该酶水解羧甲基纤维素钠的最适温度为45 ℃,最适pH 4.5,在pH 4.0~8.0以及30~55 ℃之间具有良好的稳定性。在终离子浓度为1 mmol/L以及10 mmol/L下,Zn²⁺、Mn²⁺对酶的活性有激活作用,Mg²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Cd²⁺、Co²⁺对酶的活性有抑制作用,其中Mg²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺抑制作用较强,Na⁺、K⁺、Ca²⁺对酶的活性几乎没有影响。     

饥饿胁迫对团头鲂鳃组织结构及Na+/K+-ATP酶、抗氧化酶的影响

为了研究不同饥饿时间(0、5、10、15、20、25和30 d)对团头鲂耐低氧F_4幼鱼鳃组织的影响,在温度(25±1.0)℃、溶解氧(7.0±0.5)mg/L条件下,以体质量为(30.5±2.6)g的团头鲂耐低氧F_4幼鱼为研究对象,利用组织切片、扫描电镜技术和分光光度计法研究饥饿胁迫对其鳃组织结构、Na~+/K~+-ATP酶和抗氧化酶的影响。酶活性结果显示:随着饥饿时间的延长,团头鲂耐低氧F_4鳃组织的Na~+/K~+-ATP、SOD和CAT酶活性逐渐降低(P0.05),恢复投喂7 d后基本恢复到正常水平。形态学观察显示:随着饥饿时间延长,团头鲂耐低氧F_4鳃小片平均伸出长度增加(P0.05),层间基质的厚度减小(P0.05),这种变化导致鳃小片呼吸面积增加和层间基质体积减小(P0.05)。恢复投喂7 d后,基本恢复到正常投喂时的形态。由此可见,在饥饿胁迫情况下,团头鲂耐低氧F_4幼鱼抗氧化系统受到严重干扰,鱼体主动调整鳃小片呼吸面积适应饥饿胁迫。