鲢三、四核苷酸重复微卫星标记的筛选及其特征分析

通过磁珠富集法筛选鲢(Hypophthalmichtys molitrix)的三、四核苷酸重复微卫星分子标记。提取鲢血液大片段基因组DNA,用限制性内切酶Sau3AI进行酶切,蔗糖密度梯度离心收集400~900 bp长度的片段,构建鲢全基因组PCR文库,用生物素标记的微卫星探针(TGA)8、(CAG)8以及(AGAT)6进行筛选,磁珠富集含有微卫星序列的DNA片段,获得含有微卫星的单链序列;将这些序列通过PCR扩增,连接pMD 18-T载体,转入感受态大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,获得微卫星文库;再用γ-32P标记的放射性同位素探针进行二次杂交筛选,获得1 758个阳性克隆,选择测序348个克隆序列中,共含有280个微卫星座位,其中完美型167个(59.64%),非完美型28个(10%),混合型85个(30.36%)。Primer 3.0软件设计60对引物,并用珠江水系的野生鲢群体对引物进行多态性位点检测。统计软件分析显示其中22对具有较高的筛选效率和多态性,可作为鲢种质评价等遗传分析的工具。研究亮点:首次利用多碱基(三、四核苷酸重复)探针筛选出微卫星分子标记结合同位素探针进行两次筛选...     

三疣梭子蟹微卫星文库的构建及序列分析

采用磁珠富集法筛选三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的微卫星序列。经Sau3AI酶切后的200~1000bp DNA纯化片段,与两端已知序列的人工接头连接,用含有生物素标记的(CA)₁₂和(GA)₁₂探针杂交,根据磁珠的链酶亲和素与生物素特异结合的特性,捕获含微卫星序列的单链DNA,以此为模板用人工接头序列为引物进行PCR扩增,随后将获得的片段连接到PMD18-T载体上,转化至DH5α感受态细胞中,成功构建了微卫星富集文库。测序其中的60个阳性克隆,得到42条微卫星序列(基因登录号为:HQ283153-HQ283194),除探针使用的CA/GT、GA/CT重复外,还得到GAGT重复序列。42条微卫星序列中,完美型31个(占73.8%),非完美型9个(占21.4%),混合型2个(占4.8%)。完美型的比例显著高于非完美型,这与其他真核生物微卫星序列的特征相一致。39条微卫星序列的重复次数大于10(占92.9%),其中,重复次数在10~19次之间的有27个,20次以上的有12个。筛选出的微卫星位点可为今后三疣梭子蟹遗传多样性评价、种群遗传结构鉴定及资源保护研究提供一套有用的分子标记。     

利用磁珠富集法开发花榈木微卫星引物

将花榈木(Ormosia henryiPrain)基因组DNA用MseⅠ酶切后,连接相应的接头,PCR扩增后回收500~1000bp片段,与用生物素标记的微卫星探针(GA)12,(AAG)8杂交后,运用磁珠富集含有微卫星序列的DNA片段。获得的序列经PCR扩增,连接载体pMD19-T,构建富含微卫星序列的小片段插入文库;用PCR法筛选文库,获得78个阳性克隆,经测序分析得到24个微卫星序列,成功设计出9对引物。     

用磁珠富集法快速制备银鲫微卫星标记

将磁珠富集法和用γ-32P标记的放射性探针法相结合,快速制备银鲫Carassius auratus gibelio微卫星。用限制性内切酶MboI对银鲫完整基因组DNA酶切,用不同蔗糖浓度梯度离心收集400~900 bp大小的片段,连接Brown接头,构建银鲫全基因组文库。用生物素标记的(CA)16寡核苷酸探针进行筛选,磁珠富集含有微卫星的DNA单链序列;对DNA模板进行PCR扩增,连接pMD18-T载体,转入用CaCl2制备的感受态大肠杆菌Escherichia coliDH5α中,得到微卫星序列文库;经用同位素γ-32P标记的探针(CA)16二次筛选,获得235个阳性克隆,对其测序,得224个含微卫星序列,完美型、非完美型、复合型序列分别占总数的52.8%、28.7%、18.5%。除探针中使用的(CA/GT)n重复单元外,还观察到(GA/CT)n、(ACTC)4的重复序列。设计163对引物,选择合成30对引物,经聚丙烯酰胺凝胶筛选,9对可以获得清晰条带,其中3对为单态,6对为多态。     

基于磁珠富集法开发的15个三角鲂多态性微卫星标记的特性分析

利用磁珠富集法分离微卫星序列,以开发三角鲂(Megalobrama terminalis)微卫星分子标记。将三角鲂基因组DNA经限制性内切酶RsaⅠ酶切、回收后构建三角鲂基因组PCR文库。用生物素标记的微卫星探针(CA)₁₀与PCR文库杂交,通过磁珠富集含有微卫星序列的DNA片段,将洗脱所得片段进行PCR扩增、克隆及筛选后,共获得15对有效引物。利用获得的15对引物对36尾三角鲂进行多态性分析,15个微卫星标记的观测杂合度范围为0.000 0~0.818 2,期望杂合度范围为0.081 8~0.922 6,多态信息含量范围为0.078 9~0.899 9。其中,6个微卫星标记达到Hardy-Weinberg平衡。本研究制备的15对微卫星标记可用于评估三角鲂种群的遗传参数,为三角鲂种质资源的开发、保护提供有用的遗传标记。     

藏马微卫星标记遗传多样性研究

为研究西藏藏马种群的微卫星多态性,应用生物素标记的微卫星探针与藏马基因组酶切片段杂交,通过链霉亲和素包被的磁珠捕获150～1 000 bp含有微卫星序列的DNA片段,连接到pEASY-T1载体中,构建藏马基因组微卫星富集文库。结果表明:从2 380个转化子中随机挑取112个阳性克隆进行测序后,经筛选比对发现,从62个微卫星中筛选出39个在马属基因组卫星库中未被检测到的微卫星;成功设计了10对藏马微卫星引物,经聚合酶链式反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)方法检测到3个具有多态性的微卫星标记,其中有2个多态性信息含量(PIC)值均大于0.5。因此,这3个微卫星标记可应用于藏马遗传多态性检测、种群遗传结构等方面研究,为藏马遗传连锁图谱的构建、辅助育种、群体遗传学分析、基因组结构分析以及分子进化研究等提供依据。     

中华绒螯蟹部分基因组文库构建和微卫星位点的筛选

利用磁珠富集和放射性杂交相结合构建了中华绒螯蟹基因组微卫星文库.并利用生物素标记的(GA)12探针进行微卫星片段的富集.将得到的片段与pGEM-T载体连接后转入DHSα大肠杆菌中,然后利用γ-32P同位素标记的(GA)12:探针进行第二次筛选.结果共获得微卫星基因组文库1 500个菌,杂交前菌落PCR检测阳性克隆率为62.5%;杂交后得到的阳性克隆为447个,占29.8%.经测序,有248个克隆含有重复次数大于5次的微卫星序列.在得到的微卫星序列中,重复单元除GA/CT外,还观察到三碱基、四碱基重复单元.根据侧翼序列没计引物164对,选择合成50对,通过优化PCR反应条件,结果有21对引物可扩增出清晰可重复的目的条带,15对具有多态性.本研究对中华绒螯蟹基因组资源的开发利用提供了相关资料.     

磁珠富集法分离柿微卫星标记

【目的】分离柿属植物的微卫星标记,为柿种质资源的分类、进化等遗传研究奠定基础。【方法】提取磨盘柿(Diospyros kaki)基因组DNA后,用EcoRⅠ和MesⅠ2种内切酶酶切并连接接头,再用接头特异引物进行PCR扩增。扩增产物与生物素标记的(GA)15和(AC)15探针杂交,杂交复合物用链亲和素包裹磁珠进行结合,得到单链DNA目标片段,经PCR扩增,连接pGEM-T载体,转化入感受态大肠杆菌,得到微卫星富集小插入片段DNA文库。用Colony-PCR法筛选阳性克隆,进行测序分析。【结果】测序96个克隆,54个含微卫星序列,24个为有效微卫星序列,其中完美型(perfect)9个,占37.5%;非完美型(imperfect)7个,占29.2%;混合型(compound)8个,占33.3%(。GA)n重复最为常见。21条含微卫星序列已登录GenBank(Accession Number:EF567396~EF567416)。成功设计21对引物,经初步筛选,14对表现出多态性。【结论】试验方法分离柿基因组微卫星简便有效,得到的多态性引物可用于柿种质资源的遗传研究。     

合浦珠母贝微卫星DNA标记的分离与筛选

[目的]研究合浦珠母贝微卫星DNA标记的分离与筛选。[方法]采用生物素标记的5个探针,用磁珠富集法构建合浦珠母贝基因组微卫星富集文库,并对文库进行筛选、测序与引物多态性筛选。[结果]对500个克隆进行PCR筛选,测序分析发现130个克隆含有微卫星重复单元。序列比对后最终获得109个具有特异微卫星序列的阳性克隆,其中包含179个微卫星DNA结构域。基于微卫星两端的侧翼序列设计并获得了13对能够在合浦珠母贝基因组有效扩增的微卫星引物,其中8对在种群中（n=32）具有扩增多态性,其多态信息含量PIC值在0．239～0．787;等位基因数在2～9个;观测杂合度介于0．22～0．56;期望杂合度的变化范围为0．25～0．83。[结论]这研究为进一步开展合浦珠母贝的遗传分析提供了基础资料。     

三角帆蚌微卫星的分离及遗传多样性分析

通过磁珠富集法筛选三角帆蚌微卫星标记并对其特征进行分析。用生物素标记的寡核苷酸探针(CA)16进行微卫星序列的富集,挑选96个阳性克隆测序获得77个含有微卫星的DNA序列,设计并合成了30对微卫星引物。以三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)基因组DNA为模板,进行PCR扩增,结果筛选出11个多态性微卫星标记,1对引物等位基因数(NA)3~14,观察杂合度(HO)0.098~0.976,期望杂合度(He)0.336~0.917,多态信息含量(PIC)0.306~0.898,11个微卫星位点都偏离Hardy-Weinberg平衡,呈极显著差异(P0.01),说明洞庭湖养殖群体遗传多样性不高,遗传变异小,可能存在近交现象。     

犬蠕形螨混合金黄色葡萄球菌和大肠杆菌感染的病原鉴定与诊治

为了对1例皮肤病患犬进行诊断和有效治疗。结合患犬临床症状，采用寄生虫学、血液学和微生物学等方法进行诊断检查，并进行对因和对症治疗。结果显示，经皮肤刮片和皮肤细胞学镜检，观察到犬蠕形螨；血常规和生化指标检查显示白细胞数和中性粒细胞数显著升高、总蛋白含量升高，表明患犬有严重慢性感染和炎症；细菌分离培养获得1株呈金黄色菌落的革兰氏阳性菌和1株呈乳白色菌落的革兰氏阴性菌，利用VITEK 2 Compact全自动微生物分析仪鉴定为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌；药敏试验结果显示2种细菌均对丁胺卡那霉素敏感，而对其他8种药物存在耐药差异；经选用多拉菌素抗犬蠕形螨治疗、丁胺卡那霉素抗菌治疗，结合对症治疗和提高犬体免疫力等综合治疗方法，连续治疗4周后，患犬病症消失，生理生化指标恢复正常，治疗效果明显。本治疗方法可为犬蠕形螨混合细菌感染的诊治提供参考。     

东方圆盘菌及其无性型

【目的】东方圆盘菌Orbilia orientalis及其无性型的鉴定.【方法】从枯树枝上采集标本;通过子囊孢子弹射法分离到其无性型.【结果和结论】该标本被鉴定为Orbilia orientalis;无性型被鉴定为Drechslerella cf.brochopaga;建立了有性型Orbilia orientalis和无性型Drechslerella cf.brochopaga之间的对应关系.     

外来害虫椰心叶甲入侵灾变的生态学基础及控制技术体系

椰心叶甲Brontispa longissima(Gestro)是一种重要的寄生在棕榈科植物上的害虫,2002年入侵海南并暴发成灾,导致椰子、槟榔等严重减产,严重威胁我国椰子、槟榔产业的健康持续发展,同时对南方沿海地区的绿色生态安全和热带自然景观构成了巨大威胁。经过10多年的研究,在阐明该虫发生危害规律和入侵成灾机理的基础上,研发和集成创新了应急防控与持续控制关键技术体系,并较为广泛地应用于南方椰心叶甲入侵发生区域,取得了显著的效益。     

青稞转录因子HvnANT1基因的克隆与表达分析

为探究HvnANT1基因在青稞粒色形成过程中的基因表达模式,以紫粒青稞‘涅如姆扎’和白粒青稞‘昆仑10号’为试材,利用简化基因组GBS(Genotyping-by-Sequencing)对青稞紫粒进行基因定位,克隆到HvnANT1基因,对其进行生物信息学分析。结果表明:1)在7H染色体的84.30—86.00 cM获得1个MYB类转录因子,命名为HvnANT1。2)该基因长1 033 bp,其完整开放阅读框为762 bp,编码253个氨基酸。HvnANT1蛋白分子量为27.14 kU,是亲水性的不稳定碱性蛋白且不存在跨膜结构,无信号肽。该蛋白的二级结构主要是由无规卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角组成,具有2个SANT结构域(分别位于第13—第63个;第66—第114个氨基酸)。3)同源比对与系统进化分析表明:青稞HvnANT1蛋白与大麦、乌拉尔图小麦、高梁、玉米、二型花、小米、水稻、土瓶草、车轴草和杨梅10种植物的ANT1蛋白序列相似性分别为100.00%、88.85%、54.64%、60.95%、60.82%、58.46%、57.61%、37.76%、36.05%和36.33%;这些序列都具有2个高度保守的2个SANT结构域;与大麦的亲缘关系最近,其次是与乌拉尔图小麦,与水稻最远。4)亚细胞定位结果表明,该基因定位在细胞核内。5)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示:与籽粒颜色形成的乳熟早期和乳熟晚期相比,软面团期的HvnANT1基因在‘涅如姆扎’中表达量极显著上调,而在‘昆仑10号’中各时期的表达量较低且差异不显著;且软面团期的‘涅如姆扎’籽粒HvnANT1基因的表达量极显著高于‘昆仑10号’(P<0.01)。花青素合成相关的结构基因HvnCHI、HvnANS和HvnDFR与该基因表达量模式相似。综上,青稞HvnANT1蛋白结构中的SANT结构域在物种进化过程中比较保守;该基因定位在细胞核内,符合转录因子特性;HvnANT1基因表达模式与结构基因HvnCHI、HvnANS和HvnDFR相似,在籽粒颜色形成的软面团期表达量极显著升高。     

孟加拉鲥、美洲鲥和中国鲥形态学比较分析

观察、解剖107尾孟加拉鲥Tenualosa ilisha、美洲鲥Alosa sapidissima和中国鲥Tenualosa reevesii,详细记叙了孟加拉鲥外部形态和内部结构,运用传统形态学方法比较分析了3种鲥鱼的形态差异.三者形态7项可量性状比值的聚类分析结果显示,孟加拉鲥和中国鲥先聚为一类,再和美洲鲥聚为一类,这与它们的分类地位相一致.外观上,孟加拉鲥臀鳍鳍条短,被1层薄鳞覆盖;美洲鲥的纵列鳞数及体长/体高、体长/头长都大于其他2种鲥鱼.可数性状上,第一外鳃弓鳃耙和脊椎骨数目能明显区分3种鲥鱼.孟加拉鲥、中国鲥和美洲鲥的第一外鳃弓鳃耙数分别为181～219+153～224、95～131+170～175和24～31+47～55;脊椎骨数分别为46～48、37～39和55～57.在内部结构上,根据胃的形状、盲囊部的大小、幽门垂的长短和数量、肠道的弯曲数目及相对长度可以准确鉴定这3种鲥鱼.孟加拉鲥肠道最长,中国鲥次之,美洲鲥肠道最短.3种鲥鱼在消化道结构的差异,预示食性已产生分化.     

小立碗藓PpLBD20基因敲除载体的构建及功能研究

LBD(Lateral organ boundaries domain)是植物中特有的基因家族.前期研究发现灰霉菌处理小立碗藓导致配子体中的PpLBD20上调表达,但PpLBD20的功能尚不明确.因此提取小立碗藓DNA,PCR扩增PpLBD20基因的上下游片段,依次插入PTN182载体,利用同源重组原理构建敲除表达载体,酶切和测序验证插入序列的正确性.通过工作浓度为20％的PGE 6000介导小立碗藓原生质体转化,筛选鉴定得到敲除PpLBD20后的突变体植株,观察到敲除后小立碗藓不形成茎叶体结构且配子体成丝状.结果为深入探究PpLBD20在小立碗藓的形态建成调控病原菌侵染的抗性作用奠定基础.     

全球茶与咖啡生产和研究现状的分析

基于世界粮农组织、汤森路透公司Web of Science等公开数据库,系统分析了2000年以来全球茶(Camellia sinensis)与咖啡(Coffea arabica L)的生产和研究情况。结果表明,2000—2013年,累计产茶与咖啡最多的国家分别是中国(总量的29.1%)和巴西(总量的30.6%)。2011年至2015年茶与咖啡的研究论文数量年增长率分别是4.3%与5.6%。美国茶与咖啡的研究论文无论总量还是质量上为最高,自2011年起中国的年产论文量已超过美国;茶与咖啡研究领域呈现出多学科交叉的特性;热点研究领域是生物化学、营养学以及与医学交叉的学科。     

绣线菊内生真菌的分离及对植物病原菌的抑制作用

采用组织分离法,以PDA培养基为分离培养基,从绣线菊的根、茎和叶中分离获得39株内生真菌。平板对峙结果表明, 21株活性菌株对6种植物病原菌（辣椒疫霉病原菌、番茄枯萎病原菌、苹果腐烂病原菌、苹果炭疽病原菌、葡萄灰霉病原菌、小麦赤霉病原菌）有不同程度的抑制作用,其中菌株XXT10对苹果腐烂病原菌、苹果炭疽病原菌、番茄枯萎病原菌、小麦赤霉病原菌的抑制率分别达到73.2%、72.5%、39.5%和42.7%。通过测得的ITS rDNA 序列与GenBank数据库中已知序列比对后该菌为链格孢属菌。生物学特性试验表明,该菌株在28～32℃时,选择PDA培养基,分别以乳糖和蛋白胨作为碳、氮源,酸碱度中性的条件下,菌落的生长状况最佳。     

中国小黄黝鱼种群遗传结构和分化研究

小黄黝鱼(Micropercops swinhonis)是广布于中国长江及北方各水系的一种小型淡水虾虎鱼类。本研究采集了来自松花江(哈尔滨)、辽河(沈阳)、海河(北京)、黄河下游(濮阳)、高邮湖、长江水系(邵阳资水、洪湖、荆州、靖江市、巢湖、太湖、郎溪、洞庭湖)和云南腾冲的88个样品。通过分析线粒体细胞色素b(Cyt b)和控制区D-loop基因序列的变异研究小黄黝鱼不同地理种群的相互关系,并探讨其遗传结构和物种分化。Cyt b和D-loop的序列串联共得到63个单倍型,133个变异位点。AMOVA、SAMOVA、网络图以及贝叶斯建树分析结果都支持将其分为邵阳资水种群(A种群)、太湖种群(B种群)、其他地区种群(C种群)3个差异较大的分支,其中C种群又大致可以分3个子种群。错配分布分析表明靖江(Fu’s FS:-4.119,P=0.009)和洪湖(Fu’s FS:-2.814,P=0.016)两地的种群历史上发生过种群扩张。     

禽多杀性巴氏杆菌、副鸡嗜血杆菌和大肠杆菌多重PCR检测方法的建立及应用

为了建立鉴别禽多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、副鸡嗜血杆菌(Haemophilus paragallinarum)和大肠杆菌(Escherichia coli)的多重PCR检测方法,参照GenBank中登录的3种细菌基因组序列,合成3对特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立快速检测3种细菌的多重PCR方法。特异性试验结果表明,可分别扩增出3种细菌对应的目的片段,对Ⅰ群禽腺病毒4型(FAV-4)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌(Salmonellaspp)、鸡胚成纤维细胞(DF-1)的DNA和灭菌双蒸水均无扩增;敏感性试验结果表明,最低检测量分别为24.3pg/μL禽多杀性巴氏杆菌、21.4pg/μL副鸡嗜血杆菌和28.6pg/μL鸡大肠杆菌的基因组DNA;应用该方法对83份临床病料进行检测,结果与其他已建立的单重PCR检测一致,说明所建立的方法可用于临床上3种细菌的鉴别诊断。