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相似文献
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1.
Chang  KC Kang  T 《安徽农业大学学报》1999,26(3):310-316
将烟曲霉的一种胞外脱乙酰几丁质酶(AF CSN)纯化,并测定该酶N-端氨基酸的序列。用此序列推测的寡核苷酸引物扩增得到脱乙酰几丁质酶(csn)的cDNA,其全长为804bp,编码一种251个氨基酸的单肽,对csn的序列比较分析表明,它与茄病镰刀菌在两个区域具有同源性,这两个区域分别有重复天冬氨酸及苏氨酸残基,这说明它与细菌具有相同的演化起源。cns与已知的细菌脱乙酰几丁质酶没有同源性,Southern杂交分析显示,cns在烟曲霉基因组中的单拷贝的。用质粒栽体pET28a(t),csn cDNA被导入E.coli中得到csn的融合蛋白,在IPTG诱导下,E.coli细胞中可获得大量的约28kDa的成熟蛋白。  相似文献   

2.
几种霉菌产甲壳素脱乙酰酶活力比较及部分酶学性质   总被引:7,自引:0,他引:7  
比较了几种霉菌(毛霉、根霉、曲霉和青霉)在对数生长末期和稳定期末期的胞内和胞外甲壳素脱乙酰酶的活力。研究结果表明:(1)各霉菌的胞内和胞外都具有甲壳素脱乙酰酶活力,而且胞外酶的活力普遍大于胞内酶的活力;(2)处于对数生长期末期的毛霉菌株产甲壳素脱乙酰酶活力最高,其胞外酶活力达到了97.2±4.2 U/g干菌丝体。酶学特性研究表明:该酶的最适温度为50℃,最适pH约为7.2,低温保存稳定性较差,每24小时酶活力下降30%以上。  相似文献   

3.
比较了几种霉菌(毛霉、根霉、曲霉和青霉)在对数生长末期和稳定期末期的胞内和胞外甲壳素脱乙酰酶的活力。研究结果表明:(1)各霉菌的胞内和胞外都具有甲壳素脱乙酰酶活力,而且胞外酶的活力普遍大于胞内酶的活力;(2)处于对数生长期末期的毛霉菌株产甲壳素脱乙酰酶活力最高,其胞外酶活力达到了97.2±4.2 U/g干菌丝体。酶学特性研究表明:该酶的最适温度为50℃,最适pH约为7.2,低温保存稳定性较差,每24小时酶活力下降30%以上。  相似文献   

4.
【目的】克隆人参皂苷生物合成途径中的鲨烯环氧酶(SQE)基因,并进行原核表达与纯化,初步探讨SQE活性与人参皂苷生成量之间的关系。【方法】以4年生人参根组织须根为材料,提取其总RNA,反转录为cDNA。以合成的cDNA为模板,对SQE基因进行克隆,再将其插入原核表达载体pET-30a中,构建pET-30a-SQE重组质粒,经酶切和测序鉴定后,转入Rosetta大肠杆菌,经0.8 mmol/L IPTG 37 ℃诱导表达4 h后,进行SDS-PAGE电泳检测,采用NiAgarose亲和层析柱纯化目的蛋白,利用液相色谱串联质谱联用技术(LC-MS)检测SQE的活性。【结果】获得了人参SQE基因1 611 bp的全长编码区cDNA。酶切和测序结果表明,原核表达载体pET-30a-SQE构建成功;SDS-PAGE分析显示,在Rosetta大肠杆菌中成功诱导表达了SQE融合蛋白,且纯化后的目的蛋白纯度较高;LC-MS联用检测结果发现,随着SQE用量的增加,达玛烯二醇的生成量递增。【结论】克隆了人参SQE基因,获得了在体外具有生物学活性的SQE蛋白,并证实了其活性与人参皂苷生成量有很大的相关性。  相似文献   

5.
【目的】研究美国白蛾(Hyphantria cunea)几丁质脱乙酰酶(chitin deacetylase,CDA)基因的酶学性质,了解其在昆虫生命过程中如何发挥功能,为美国白蛾的生物防治提供新靶标。【方法】对家蚕(Bombyxmori)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)和云杉卷夜蛾(Choristoneura fumiferana)3种鳞翅目昆虫的几丁质脱乙酰酶2序列保守域进行分析,采用同源比对方法,设计几丁质脱乙酰酶2基因特异引物,利用PCR扩增该基因全长c DNA序列;构建原核重组表达载体p ET30a-Hc CDA2,克隆获得编码美国白蛾Hc CDA2的基因,IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE电泳检测;构建重组杆状病毒表达载体p Fast Bac-Hc CDA1和p Fast Bac-Hc CDA2,脂质体转染法转染昆虫细胞Hi5,分别获得P1、P2、P3病毒,收集P3病毒上清,得到美国白蛾Hc CDA1(前期研究所得)和Hc CDA2重组蛋白,Western blot分析;重组蛋白Hc CDA1和Hc CDA2经硫酸铵粗纯化后,以对硝基乙酰苯胺为底物,测定重组几丁质脱乙酰酶Hc CDA12的酶活力,对其最适反应温度、最适p H以及金属离子的影响等酶学性质进行研究。【结果】获得了编码美国白蛾几丁质脱乙酰酶2基因全长c DNA序列,命名为Hc CDA2(Gen Bank登录号:KT781841),基因全长1.6 kb,该基因在大肠杆菌中成功表达61 kD目的蛋白,免疫家兔获得Hc CDA2蛋白的特异性多克隆抗体。Western blot分析结果表明,Hc CDA1和Hc CDA2在昆虫细胞(Hi5)中均成功表达约80 k D蛋白。酶学性质研究表明,昆虫细胞中分泌表达的Hc CDA1和Hc CDA2均具有催化活性,两种酶的最适反应温度均为50℃,当温度达到80℃时,Hc CDA2几乎失去酶活力;Hc CDA1酶促反应适宜的p H范围为7.0—9.0,并且Hc CDA1和Hc CDA2酶促反应的最适p H均为8.0;在最适反应条件下,Hc CDA2蛋白酶活力均高于Hc CDA1蛋白酶活力;Mg~(2+)、Zn~(2+)、Mn~(2+)和Ca~(2+)对Hc CDA1和Hc CDA2酶促反应整体呈抑制趋势,随浓度增大,Zn~(2)+对Hc CDA1抑制作用逐渐增强,而Mg~(2+)对Hc CDA1的抑制作用则呈现先升高后降低的趋势,而且Mg~(2+)和Ca~(2+)对Hc CDA2的抑制作用也是呈现先升高后降低的趋势。Co~(2+)和Fe~(2+)对Hc CDA1和Hc CDA2酶促反应有激活作用,随浓度增大,Fe~(2+)激活作用越强,而Co~(2+)激活作用则呈现先升高后降低的趋势。【结论】克隆了编码美国白蛾几丁质脱乙酰酶2基因(Hc CDA2),在原核细胞中表达61 k D目的蛋白,免疫家兔获得Hc CDA2蛋白的特异性抗体。得到具有活性的美国白蛾几丁质脱乙酰酶Hc CDA1和Hc CDA2,两者在体外均检测到催化活性,两种酶的最适反应温度均为50℃,最适pH均为8.0。  相似文献   

6.
[目的]研究蜡梅香基因SAMT的cDNA克隆及在大肠杆菌中的表达。[方法]以蜡梅花瓣总RNA为模板进行RT-PCR,扩增得到与预期大小相同的PCR产物带,回收RT-PCR产物,将其与PMD18-T载体进行T-A克隆连接并导入大肠杆菌DH5,经菌落PCR和双酶切鉴定,筛选带有目的基因的重组质粒并进行测序。[结果]测序证实成功克隆得到蜡梅花香基因SAMTcDNA的ORF片段,其长度为1196bp,编码380个氨基酸残基,与已报导的蜡梅SAMT(ABU88887)的同源性为99.2%将SAMT基因亚克隆到原核表达载体PGEX4T-1中,转化大肠杆菌DH5α获得其原核表达菌株pGSAMT;采用0.01mol/L的IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE分析,SAMT的融合表达蛋白分子量约为66kDa,与预期的26KDa的GST带和42.3KDa的蜡梅SAMT基因编码蛋白构成的融合蛋白大小接近。[结论]该研究成功克隆并表达了蜡梅花香基因SAMT。  相似文献   

7.
【目的】对玉木耳漆酶基因Aclac进行克隆及原核表达分析,为深入研究漆酶基因在玉木耳子实体发育中的生物学功能提供理论依据。【方法】克隆Aclac基因的cDNA和DNA全长序列,对其进行生物信息学分析,并将目的基因连接至pET-28a质粒上以构建原核表达载体pET28a-Aclac,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。【结果】克隆获得的Aclac基因cDNA序列长度为1734 bp,编码577个氨基酸残基;Aclac基因DNA序列长度为2521 bp,含14个内含子。AcLAC蛋白理论分子量为64.75 kD,理论等电点为5.70,不稳定指数为34.01,无跨膜区域,存在1个信号肽,在4个铜离子结合区高度保守,且含有Cupredoxin超家族蛋白保守功能域。AcLAC蛋白与真菌的漆酶蛋白聚为一支,其中,AcLAC蛋白与木耳属真菌的漆酶蛋白亲缘关系最近。AcLAC融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)表达宿主中成功表达,分子量为67 kD。【结论】克隆获得的Aclac基因属于Cupredoxin超家族基因,可在原核表达系统中异源表达,推测其与其他真菌漆酶基因在生物学功能上具有一致性,丰富了真菌漆酶资源。  相似文献   

8.
 【目的】揭示棉田杂草薤白(Allium macrostemon Bunge)抗草甘膦的分子机理,开发利用其草甘膦抗性特性。【方法】运用RT-PCR结合RACE技术,分离克隆了薤白中草甘膦作用的靶酶EPSP合成酶(EPSPs)基因cDNA,并将其构建成原核表达载体在大肠杆菌中诱导表达和鉴定其抗性。【结果】薤白EPSP合成酶基因cDNA序列全长1 821 bp,编码一段522个氨基酸的推导蛋白质。经BLAST及蛋白质结构预测,蛋白具有EPSPs的特征序列,并与已报道的EPSPs序列有高同源性,确认克隆的cDNA序列即是薤白EPSPs基因序列,命名为EPSPsA。将该cDNA与原核表达载体pRSET-A重组后,构建成重组表达质粒pRSET-A-EPSPsA,并转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导了目标蛋白的高效表达。经SDS-PAGE电泳分析显示,该蛋白的分子量约为55 kD,与预期大小一致。通过草甘膦对表达细菌处理,表达菌对草甘膦的抗性显著提高。【结论】薤白EPSPs对草甘膦具有一定抗性。  相似文献   

9.
采用RT-PCR方法扩增五指山猪SLA-DQA基因cDNA,克隆入测序载体,测序结果与Gene Bank(登陆号:AY243104)的序列相同,大小为768 bp,该基因编码255个氨基酸残基和一个终止密码,预计蛋白分子量为28 kD.将这个基因克隆到原核表达载体PET-28a(+)中,经酶切、PCR扩增和测序分析确证其正确,插入到表达载体中,阅读框是正确的,从而构建成重组表达载体PET-28a(+)-DQA.重组质粒转化至宿主菌BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导表达,对表达的蛋白用SDS-PAGE电泳分析,结果表明得到了与预计分子量相同的蛋白.  相似文献   

10.
2种泥鳅生长激素基因cDNA的克隆和原核表达研究   总被引:1,自引:0,他引:1  
从脑垂体中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增并克隆到了泥鳅和大鳞副泥鳅的生长激素(GH)基因cDNA,分析了其核苷酸序列和推测的氨基酸序列.结果表明:2种泥鳅生长激素基因的开放阅读框(ORF)均包括633个核苷酸,编码210个氨基酸,其中包括22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽.在cDNA序列上2者有11个核苷酸的差异;在蛋白质水平上,2者的差异仅为1个氨基酸,位于信号肽中,在成熟多肽中,2者的氨基酸序列相同.把GH成熟肽的cDNA克隆入表达载体pET-28 a,用IPTG诱导重组蛋白的表达,其表达量超过细胞蛋白总量的50%,主要为不溶性的包含体.细菌裂解液沉淀溶于浓度为8mol/L的尿素后,用固定化金属配体亲和层析纯化,获得了分子量为24 kDa的单一蛋白带.  相似文献   

11.
【目的】通过对羊草 Leymus chinensis CDPK 基因进行克隆及原核表达,为进一步研究CDPK基因的功能,探讨羊草适应生境分子机制提供理论基础.【方法】用RT-PCR结合RACE技术克隆了羊草钙依赖蛋白激酶(CDPK)基因,命名为Lc-CDPK;构建了羊草CDPK基因的原核表达载体,转化到大肠埃希菌Escherichia coli BL21(DE3),异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,经SDS-PAGE分析CDPK蛋白的表达情况.【结果和结论】羊草CDPK基因全长cDNA序列为1 704 bp,包括1个1 647 bp的开放阅读框,编码548个氨基酸,从第81~339个氨基酸构成了具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化活性的S-TKc结构域,有4个保守的EF手型结构域;编码区核苷酸序列与其他禾本科作物比对后发现,与小麦CDPK基因的相似性最高,相似度为96%;IPTG诱导表达出相对分子质量为61 350的融合蛋白,表达产物大小与预计理论值相符.诱导7 h蛋白表达量最高,表达量占菌体总蛋白的49.1%.  相似文献   

12.
【目的】克隆红鳍东方鲀Sirtuin1(Sirt1)基因编码阅读框(ORF),并对其进行原核表达。【方法】采集红鳍东方鲀脂肪组织,提取其总RNA,采用RT-PCR方法扩增和克隆红鳍东方鲀Sirt1基因的ORF,构建其原核表达载体pET32a/Sirt1,并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行表达。【结果】红鳍东方鲀Sirt1基因ORF区由2 070个核苷酸组成,编码689个氨基酸。根据红鳍东方鲀Sirt1ORF核苷酸序列推测的氨基酸序列与其他物种进行比对,发现其与罗非鱼(Oreochromis niloticus)、非洲齿鲤(Nothobranchius furzeri)、科恩氏假鳃鳉(Nothobranchius kuhntae)、斑马鱼(Danio rerio)、人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)的同源性分别为82%,82%,81%,66%,72%和69%;成功构建了重组质粒pET32a/Sirt1,用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果显示,在约105ku处有特异性的蛋白条带出现。【结论】克隆得到红鳍东方鲀Sirt1基因的ORF序列,并成功对其进行了原核表达。  相似文献   

13.
【目的】克隆梨小食心虫(Grapholita molesta)普通气味结合蛋白2(GmolGOBP2)的全长cDNA序列并进行原核表达,为研究该蛋白在梨小食心虫化学感受系统中的作用奠定基础。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆GmolGOBP2的全长cDNA序列,并使用原核表达载体pET-32a在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,用SDSPAGE和Western blot检测其表达情况。【结果】GmolGOBP2的cDNA全长序列为637bp(GenBank登录号:JN857940),开放性阅读框长度为483bp,编码161个氨基酸残基,成熟蛋白分子质量为15.98ku,等电点为4.85。GmolGOBP2预测蛋白的N末端具20个氨基酸残基组成的信号肽序列,并且氨基酸序列中具有6个保守半胱氨酸的典型气味结合蛋白家族标志。将GmolGOBP2编码序列重组到表达载体pET-32a中,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行原核表达,SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,梨小食心虫普通气味结合蛋白基因在大肠杆菌中成功地表达出分子质量约为32ku的融合蛋白,与预测的融合蛋白分子质量大小一致。【结论】克隆并原核表达了GmolGOBP2的cDNA序列,可用于研究该蛋白分子结构及其在化学感受系统中的功能。  相似文献   

14.
【目的】克隆盐芥谷胱甘肽过氧化物酶(GPXs)基因ThGPX8,对其进行序列分析,构建原核表达载体,为进一步研究ThGPX8的结构和功能奠定基础。【方法】以盐芥为材料,利用RT-PCR技术获得其ThGPX8基因的全长cDNA序列;应用生物信息学手段对该基因编码的蛋白结构和系统进化关系进行分析;构建原核表达载体pET-ThGPX8,转化E.coli BL21(DE3),进行IPTG诱导表达、SDS-PAGE检测和Western blotting鉴定。【结果】获得的ThGPX8基因序列的开放阅读框(ORF)为504bp,编码167个氨基酸,具有GPXs的特征结构域,不是跨膜蛋白;其二级结构主要由无规则卷曲组成,三级结构为二聚体。进化树分析表明,盐芥ThGPX8与拟南芥AlyGPX8、AtGPX8和油菜BnGPX8具有较高的同源性。盐芥ThGPX8与ThGPX6的理化性质存在差异,但具有相似的二级结构和三级结构。将ThGPX8转入E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达得到了分子质量约23ku的蛋白,该蛋白在37℃下诱导5h可获得较高的表达量。【结论】获得的ThGPX8基因cDNA序列所编码的蛋白属于植物GPXs家族成员,利用构建的原核表达载体pET-ThGPX8转化E.coli BL21(DE3)获得了融合表达蛋白。  相似文献   

15.
龙眼己糖激酶基因的克隆及原核表达   总被引:1,自引:0,他引:1  
【目的】克隆龙眼Dimocarpus longan己糖激酶(Hexokinase,HXK)基因,并对其进行生物信息学分析及原核表达分析.【方法】以龙眼总RNA为模板,采用RT-PCR结合RACE法获得基因全长c DNA序列,构建p ET-32a-Dl HXK原核表达载体,转化到大肠埃希菌Escherichia coli Rosetta(DE3)中诱导表达.【结果和结论】成功克隆龙眼己糖激酶基因的c DNA全长序列,命名为Dl HXK,登录号为KF776906.1.龙眼Dl HXK序列全长2 101 bp,包括1个1 488 bp的开放阅读框,预测编码495个氨基酸;进化树和相似性分析发现,该基因与温州蜜柑Citrus unshiu的相似性最高,达到了82%;荧光定量表达分析表明,Dl HXK基因随着果实的发育成熟表达量逐渐上升;经IPTG诱导和SDSPAGE检测,所构建的原核表达载体表达的融合蛋白与预期蛋白大小相吻合.由此可见,利用RT-PCR结合RACE方法成功克隆了龙眼的己糖激酶基因,构建原核表达载体,并在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中获得高效表达.  相似文献   

16.
【目的】克隆胞内分枝杆菌肝素结合血凝素(HBHA)基因,并对其进行生物信息学分析和原核表达。【方法】应用巢式PCR克隆胞内分枝杆菌HBHA基因,利用在线分析软件对其基因序列及编码蛋白序列进行生物信息学分析。构建原核表达载体pET32a-HBHA,并进行诱导表达。【结果】胞内分枝杆菌HBHA基因完整的ORF全长618bp,编码205个氨基酸,该基因氨基酸序列与M.avium ATCC 25291有较高的相似性。HBHA蛋白为碱性、亲水性蛋白质,含12个潜在的磷酸化位点,存在抗原表位,亚细胞定位主要存在于细胞核,蛋白空间结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。构建了pET32a-HBHA原核表达载体,其可在原核表达系统中诱导表达大小约为38ku的HBHA重组蛋白。【结论】胞内分枝杆菌HBHA是一种抗原指数较高的碱性、亲水性蛋白,可在原核表达系统中被表达。  相似文献   

17.
【目的】克隆杜仲黄酮醇合成酶基因(Fls)全长,对其开放阅读框(ORF)进行原核表达分析。【方法】以杜仲叶片为材料提取总RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆杜仲Fls基因;Fls基因的ORF经限制性内切酶酶切,构建其原核表达载体pET-28a-Fls;最后利用IPTG诱导Fls基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。【结果】获得了黄酮醇合成酶基因全长序列,长度为1 220bp,ORF为1 011bp,编码336个氨基酸;成功构建了原核表达载体pET-28a-Fls;利用IPTG诱导Fls在BL21(DE3)中表达,SDS-PAGE电泳结果显示,在约44ku处有特异性的蛋白条带出现。【结论】获得了杜仲Fls基因的全长和ORF,并成功对其进行了原核表达。  相似文献   

18.
为初步探究暗纹东方鲀sox9基因在性腺发育和性别分化过程中的作用,通过设计兼并引物、RACE及荧光定量PCR技术,成功克隆出暗纹东方鲀sox9基因的cDNA全长序列,并分析其相应的生物信息学特征及其在雌雄个体的组织表达水平。结果表明:sox9a基因cDNA全长为1 248 bp(NCBI登录号:MH218818),包括684 bp的ORF,编码227个氨基酸,297 bp的5′UTR和267 bp的3′UTR。sox9b基因全长为1 941 bp(NCBI登录号:MH218819),包括1 470 bp的ORF,编码489个氨基酸,306 bp的5′UTR和165 bp的3′UTR。同源性和系统发育分析结果表明暗纹东方鲀sox9基因与红鳍东方鲀同源性最高,亲缘关系最近。氨基酸多重序列比对结果显示两个Sox9氨基酸序列的HMG box结构域在哺乳动物和鱼类中均高度保守。荧光定量PCR分析显示两个sox9基因普遍存在于雌鱼和雄鱼的各个组织中,且均在雌鱼下丘脑中表达量最高,在精巢中有少量表达,卵巢中几乎不表达。总体来说,除少数组织外,两个sox9基因在雌鱼组织中的表达量普遍高于雄鱼。本研究为了解暗纹东方鲀sox9的遗传特性及相关的生理功能,探索性别分化与性腺发育的分子调控机制提供理论依据。  相似文献   

19.
从红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)肝脏组织中提取总RNA,通过RT–PCR扩增,获得SIRT3基因的编码阅读框(ORF),用原核表达载体p ET32a(+)构建p ET32a/SIRT3重组质粒,用异丙基–β–D–硫代半乳糖苷(IPTG)将重组质粒p ET32a/STRT3在大肠杆菌Rosetta(DE3)进行诱导表达,并用镍柱纯化融合表达蛋白。结果显示,红鳍东方鲀SIRT3基因(tr SIRT3)ORF区大小为1 263 bp大小,编码420个氨基酸。经IPTG诱导表达后,获得1个带组氨酸(His)标签的融合蛋白,目的蛋白主要存在于上清溶液中,为可溶性表达。用镍离子亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,获得了相对分子质量约66 000的重组蛋白。  相似文献   

20.
为探索青海枸杞抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因信息,并对枸杞APX基因进行生物信息学分析以及基因表达研究,通过RT-PCR和RACE方法克隆枸杞APX基因,利用生物信息学软件预测基因结构,采用实时荧光定量PCR方法分析基因表达的变化。结果显示:枸杞APX基因的全长cDNA序列为1 047bp(Genbank No.KX981601),命名为LcAPX基因。该基因含有1个753bp的完整开放阅读框(ORF),编码250个氨基酸,包含亚铁血红素结合位点、底物结合位点和K~+结合位点。枸杞LcAPX与茄科植物的APX蛋白聚为一类,说明两者的亲缘关系较近。LcAPX基因在枸杞的成熟叶中表达量最高,花中表达量最少。其在聚乙二醇(PEG)、氯化钠(NaCl)胁迫下诱导表达,显示LcAPX在枸杞抗干旱和抗盐逆境过程起一定作用。  相似文献   

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