农杆菌介导甜高粱转Bt cry1Ah的研究

 【目的】建立一套高效、稳定的甜高粱农杆菌遗传转化体系,并在甜高粱中验证来源于苏云金芽胞杆菌新型杀虫基因cry1Ah表达产物的杀虫活性。【方法】以甜高粱幼穗愈伤组织为转化受体,通过农杆菌介导法将密码子优化过的Bt cry1Ah导入2个甜高粱品种“BABUSH”和“MN-3025”中。对获得的再生植株进行PCR检测、RT-PCR分析及除草剂抗性、目的蛋白表达水平和抗虫性鉴定分析。【结果】对336块幼穗愈伤组织块进行了农杆菌侵染,经双丙氨膦（Bialaphos）梯度筛选后共获得66株再生植株,PCR鉴定在8个转化事件中有22株为阳性植株,平均转化率为2.38%。RT-PCR检测结果表明,cry1Ah在T0甜高粱转基因植株中能够正常转录。Western blotting分析和ELISA定量测定显示,有5株可检测到Bt蛋白,但Bt蛋白含量差异较大,最高可达165.69 ng•g-1叶片鲜重（FW）,最低的仅为1.93 ng•g-1叶片鲜重（FW）,平均为87.50 ng•g-1 FW。饲虫试验表明,有2株转基因甜高粱植株对亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）表现为抗性。【结论】利用建立的以甜高粱幼穗为外植体的农杆菌遗传转化体系,可获得具有玉米螟抗性的转基因甜高粱植株,其后代遗传稳定性还有待于进一步的研究。     

农杆菌介导的Bt cry1Ⅰa基因转化花椰菜的研究

利用苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)cry1Ⅰa基因构建了双T DNA边界的植物表达载体pCS1Ⅰa-LR,以瑞士雪球花椰菜具柄子叶和下胚轴为外植体,通过农杆菌介导法将cry1Ⅰa基因导入花椰菜中,共获得30株转化植株,经PCR检测,其中18株为PCR阳性植株,PCR阳性率为60%;RT-PCR和Western杂交检测结果表明,cry1Ⅰa基因在转基因花椰菜中可以正常转录和正确表达。转基因植株用小菜蛾幼虫进行饲虫试验,结果表明,转cry1Ⅰa基因花椰菜对小菜蛾具有很强的毒杀作用,昆虫幼虫的校正死亡率高达100%。获得的转基因花椰菜可用于下一步的抗虫花椰菜的培育。     

转Bt cry1Ah/cry1Ie双价基因抗虫玉米的研究

构建了含有人工改造的抗虫基因Bt cry1Ah、cry1Ie和耐除草剂基因2mG2-epsps的植物表达载体pMUHUESGM,利用基因枪法将表达盒片段转化玉米愈伤组织,以2mG2-epsps基因为筛选标记基因,经草甘膦异丙胺盐筛选获得24株T0代再生植株,其中PCR检测阳性植株有20株。T0和T1代植株的分子检测结果证明了外源基因已经整合到玉米基因组中并能够稳定遗传和表达,转基因株系在田间生物活性检测中表现出较好的抗虫性,这为培育抗虫玉米新品种提供了参考,同时本研究中采用了基因枪片段转化法,提高了转基因的生物安全性。     

利用农杆菌介导法获得转cry2A抗虫基因水稻的研究

稻纵卷叶螟等鳞翅目害虫对cry2A＊编码的Bt毒性蛋白有明显的排斥效应,从而可达到抗虫的效果。本研究利用农杆菌介导法,将载有cry2A＊基因的pC-2A质粒转入受体水稻品种镇稻88基因组内,获得转基因植株。由于cry2A＊与抗Basta基因紧密连锁,通过Basta抗性筛选,进而得到转cry2A＊基因阳性株。PCR和AGE分析结果表明,外源基因cry2A＊已成功整合到镇稻88基因组内。田间试验结果显示转基因阳性植株有明显的抗虫效果。     

转cry1Ab基因抗虫水稻的培育

采用农杆菌介导的遗传转化法,将cry1Ab基因导入优良三系恢复系明恢63,共获得了92个独立转化株,其中13株为单拷贝。通过发芽试验,获得了11个单拷贝转基因纯合系。ELISA检测结果表明:不同株系其Bt蛋白含量不一样,但杂种的Bt蛋白含量与其亲本一致。室内人工接虫试验及田间抗虫性试验初步表明:5个纯合株系表现高度抗性,且农艺性状与原品种没有显著差异。由此说明,所获得的这些单拷贝转基因株系可作为育种材料,用于抗虫水稻的培育。     

利用密码子优化提高Bt cry1Ah基因在转基因玉米(Zea mays L.)中的表达

Bt cry1Ah基因是本实验室从苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)菌株BT8中克隆的一种新型杀虫蛋白基因。在前期工作中已根据植物密码子偏好性对cry1Ah基因进行过一次优化。根据玉米密码子偏好性对cry1Ah基因进行第二次优化,并将两次优化的cry1Ah基因分别构建了pAhmG和pmAhb植物表达载体,利用农杆菌介导法转化玉米自交系综31,分别得到10株和9株阳性转基因玉米植株。通过ELISA、Western blot检测及生物活性检测,比较不同优化的基因在玉米中的蛋白表达量及抗虫情况。初步结果表明外源基因在玉米植株中可以稳定表达并可以遗传。二次优化基因比一次优化基因在玉米中的蛋白表达量更高,抗虫性更好。表明密码子优化有利于提高外源基因的表达。     

农杆菌介导法获得草地早熟禾转Bt基因植株

以草地早熟禾品种超级伊克利成熟种子为外植体材料,当愈伤组织诱导培养基中琼脂的用量增加至16g/L时,诱导产生的颗粒状胚性愈伤组织占愈伤组织总数的40%以上。愈伤组织经携带pGBI4AB农杆菌LBA4404的感染和共培养后,在继代培养基上添加50mg/L筛选剂G418,可较好地筛选出具有卡那霉素抗性的愈伤组织,进而获得具有卡那霉素抗性的再生植株。PCR分子检测结果表明,Bt基因已导入转化植株。生物学抗虫性鉴定结果显示,转Bt基因当代植株对1～2龄棉铃虫具有不同程度的抗性。     

农杆菌介导法转化宁夏水稻的研究

通过对HAL1抗盐基因农杆菌介导法转化宁夏水稻的研究,建立起了以优育28成熟胚诱导的愈伤组织为转化受体的农杆菌介导法转化体系,为宁夏水稻遗传转化研究奠定了基础。     

农杆菌介导的大花蕙兰转ICE1基因

大花蕙兰属热带植物,在北方组培成本很高,从拟南芥的RNA中克隆到耐寒基因(COR)的转录激活因子ICE1,连上CaMV35S启动子构建成植物表达载体pCAM BIA1300-35S.ICEl-poly,通过农杆菌介导的方法转化大花蕙兰.经过抗性筛选、诱导生芽、诱导生苗、诱导生根等过程.获得了70多棵潮霉素抗性植株,PCR鉴定12.9%为阳性.且部分PCR阳性植株通过了Southern检测,确定为转基因植株.     

QTLs for Sugar Content of Stalk in Sweet Sorghum (Sorghum bicolor L.Moench)

High sugar content of sorghum stalk is an important factor in the sorghum silage production. To identify the genomic regions controlling sugar content and to develop molecular markers linked to sugar content in sweet sorghum, we used an Early Folger, and a normal inbred line, N32B, for genetic linkage mapping and quantitative trait locus (QTL) analysis. We constructed a genetic linkage map spanning 983.5 cM based on a total of 327 markers comprising 31 restriction fragment length polymorphism (RFLP) markers, 254 amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers, and 42 simple sequence repeat (SSR) markers. In the 20 linkage groups detected, 98.2% of markers aligned to the 10 linkage groups of sorghum.Variations in sugar content at different growth stages and among internodes suggested that the sugar content of middle internodes is stable and suitable for measuring at early dough stage. The broad sense heritability (hB2) of sugar content was 0.64 and 0.62 estimated from the data of F3 families and each parent in 2003 and 2004. We identified one and two QTLs accounting for 22.2 to 25.0% of phenotypic variance using simple interval mapping method in 2003 and 2004, respectively.These two QTLs showed a negative additive effect, and over-dominance effect. A QTL on LG-D was detected in both two years. Above results will be help us to understand the genetic mechanism of sugar content in sorghum and the QTL detected in this study might be useful in the improvement of sugar content by marker-assisted selection.     

甜高粱蔗糖积累与茎秆中SPS表达的相关性研究

 【目的】以甜高粱为原料生产酒精作为替代能源近年来引起人们的广泛关注,本文试图通过检测蔗糖合成的关键酶-蔗糖磷酸合成酶（SPS）在高粱叶片（源）与茎秆（库）中的表达量,了解高粱体内SPS表达与蔗糖积累的关系,进而探讨蔗糖的代谢机理。【方法】以甜高粱和普通高粱为材料,利用Western blot技术对SPS的蛋白质表达进行检测。【结果】在高粱的生长发育过程中,茎秆中蔗糖含量、叶片和茎秆中SPS蛋白质表达量持续上升,灌浆期达到最高,腊熟期略有下降,它们之间的变化趋势基本一致,甜高粱茎秆蔗糖含量与叶片SPS蛋白质的表达相关系数为0.895,与茎秆SPS蛋白质的表达相关系数为0.781;甜高粱和普通高粱相比,其叶片中SPS表达量差别不明显,而甜高粱茎秆中SPS表达量明显高于普通高粱。【结论】蔗糖为高粱糖分的主要形式,蔗糖积累与叶片和茎秆中SPS的表达相关。在甜高粱中,蔗糖积累主要与茎秆中SPS的表达相关。     

高粱苗期耐盐性转录组分析和基因挖掘

【目的】探究高粱耐盐胁迫响应机制,挖掘高粱耐盐胁迫基因,为高粱耐盐育种提供理论基础。【方法】 以高粱感盐品种L甜和耐盐品种石红137为供试材料,采用水培试验。待高粱植株长至三叶一心期,使用2%NaCl溶液对幼苗进行盐胁迫,分别设置0（对照）、1和24 h处理,每个处理3次重复。测定不同处理样品株高、根长、干物重、Na ⁺含量和叶绿素相对含量（SPAD值）,并依托Illumina HiSeq 2000平台进行转录组测序分析。利用FPKM方法计算基因表达量,在差异表达基因检测过程中,将差异表达倍数（fold change）≥2且FDR<0.001作为筛选标准。通过Gene Ontology和KEGG Pathway数据库对参与高粱不同时间盐胁迫差异表达基因进行分析注释。 【结果】 盐胁迫处理对高粱株高、根长、干物重等性状无显著影响,对钠离子含量和SPAD值影响显著。石红137株高、根长、钠离子含量和SPAD值均高于L甜。转录组测序结果鉴定得到已知基因26 628个,新基因866个。石红137中的差异基因数目高于L甜。石红137中,0 h VS 1 h、0 h VS 24 h、1 h VS 24 h三组的差异基因数目分别为375、4 206和3 750个。感盐品种L甜中,0 h VS 1 h、0 h VS 24 h、1 h VS 24 h三组的差异基因数目分别为167、2 534和1 612个。GO分析共获得25个功能注释,分别为光合作用、细胞物质代谢、翻译过程以及激素合成等与盐胁迫相关的差异表达基因。KEGG分析发现盐胁迫1 h表达差异基因富集在植物激素信号转导途径,涉及脱落酸（abscisic acid,ABA）、生长素（auxin,AUX）、细胞分裂素（cytokinin,CTK）、赤霉素（gibberellins,GS）、乙烯（ethylene,ETH）过程等共71个基因。盐胁迫24 h表达差异基因富集于光合作用相关途径,涉及Lhca、Lhcb、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase,PPC）、磷酸核酮糖激酶（phosphorylribonucleic kinase,PRK）等20个基因。类黄酮生物合成代谢途径差异可能是引起石红137和L甜的耐盐能力差异的原因之一,花青素还原酶（anthocyanidin reductase,ANR）和黄酮醇合成酶（flavonol synthase,FLS）参与类黄酮生物合成途径。【结论】 高粱的盐胁迫过程是一个复杂的生物过程,依赖于多个基因在复杂网络中的平衡表达。盐胁迫条件下,高粱应对环境刺激受到激素信号转导和光合作用的控制。类黄酮生物合成途径在耐盐品种中起到了重要作用。     

苏打盐碱胁迫对甜高粱叶片结构及抗性指标的影响

为确定以Na2CO3和NaHCO3为主要成分的苏打盐碱胁迫对甜高粱叶片结构及抗性影响,研究了盐碱胁迫下甜高粱品种314B和M-81E叶片结构与幼苗生理指标的变化。结果表明:针对应试的两个甜高粱品种,苏打盐碱胁迫可极显著减小叶片厚度、中脉厚度和最大导管直径,极显著增加叶片上下角质层及下表皮厚度(P<0.01)。增加叶绿体中淀粉粒和嗜锇滴颗粒数,且发生叶绿体被膜和基质分离现象;使线粒体内膜上嵴数量减少,甚至消失。株高和茎基周长均比对照极显著减小,叶绿体色素极显著增加(P<0.01);叶片质膜相对透性和脯氨酸含量极显著升高,品种间丙二醛含量的变化差异较大。过氧化物酶(POD)活性和过氧化氢酶(CAT)活性均极显著升高,超氧化物歧化酶(SOD)的活性极显著降低(P<0.01)。比较叶片结构和抗性生理指标变化可知,品种M-81E比314B抗盐碱性强。     

能源甜高粱遗传改良研究进展

甜高粱是最有应用前景的再生能源作物之一,它的能源转换效率取决于植株总生物量和茎秆汁液含糖量的高低。探明决定甜高粱总生物量和茎秆汁液含糖量积累相关过程的生物学机制并开发相应分子标记,是选育生物能专用甜高粱品种的有效途径。该文从甜高粱糖分积累、遗传多样性研究、遗传图谱的构建、含糖量相关性状的定位及遗传工程研究等方面介绍了近年来甜高粱遗传研究进展。     

不同耐盐性高粱在盐逆境下的比较转录组分析

【目的】土壤盐渍化是制约作物生产的重要非生物胁迫因子之一,高粱耐盐性强,进行高粱耐盐基因挖掘及分子机制研究是开发和利用盐渍土壤的有效途径,通过转录组测序分析与高粱耐盐相关的基因调控机制和代谢通路,挖掘高粱耐盐潜力。【方法】 通过以筛选出的极耐盐品种八叶齐和盐极敏感品种PL212为试验材料,采用盆栽沙培,在播种后20 d（5叶期）采用180 mmol·L ^-1的 NaCl 溶液漫灌模拟盐逆境,盐胁迫48 h后取幼叶,并连同对照（未经过盐处理）的同期幼苗共4个样品提取RNA,进行转录组测序,采用qRT-PCR方法对测序结果进行验证。 【结果】 耐盐和盐敏感材料分别在盐渍和非盐渍处理下的4个样品间共检测到1 338个差异表达基因,包括819个上调基因和519个下调基因。聚类分析发现在应答盐渍胁迫逆境时,5个依赖性氧合酶超家族蛋白、4个富含半胱氨酸的激酶、3个谷胱甘肽S-转移酶和3个重金属运输/解毒超家族蛋白相关基因表现出明显的上调表达和下调表达,还发现1个K ⁺转运蛋白基因在耐盐调节中起着重要作用。GO分析发现在15 418个基因中获得4 528个有效GO注释条目,同时耐盐和盐敏感材料在遭受盐逆境时的生物过程、细胞组分和分子功能3个方面均存在较大差异。生物过程中代谢过程、细胞过程耐盐材料明显高于盐敏感材料,耐盐材料的生理过程中较盐敏感材料增加了多生物过程和定位这两个过程,很可能与耐盐材料盐抗性较强密切相关。差异基因KEGG分析结果显示耐盐和盐敏感材料在对照和盐渍胁迫条件下的苯丙烷类生物合成、苯丙氨酸代谢、类黄酮生物合成3个途径中差异基因表达较多,可能是造成耐盐和盐敏感材料耐盐性差异较大的重要原因。 【结论】 高粱耐盐调控基因表达涉及生物过程、细胞组分和分子功能多个方面,生物过程和定位这两个过程是提高高粱耐盐性的关键;苯丙烷类生物合成、苯丙氨酸代谢、类黄酮生物合成3个途径的基因表达很可能是造成盐害的重要原因。