丙烯酰胺人工抗原的合成及其多克隆抗体的制备

摘 要：利用偶联方法合成丙烯酰胺人工抗原,通过免疫方法获得抗丙烯酰胺多克隆抗体;应用戊二醛法将丙烯酰胺与牛血清白蛋白(BSA)进行偶联,并对这两种物质及其复合物进行紫外扫描,并用此复合物免疫兔子,利用间接酶联免疫吸附法测定抗体的效价;应用牛血清白蛋白与丙烯酰胺偶联人工抗体成功,抗体效价大于8100;应用人工抗原免疫成功制备抗丙烯酰胺多克隆抗体。     

人工合成氯霉素抗原免疫血清效价的比较及多克隆抗体的制备

【研究目的】人工合成氯霉素抗原及氯霉素多克隆抗体的制备,比较氯霉素人工抗原免疫血清效价。【方法】采用重氮化法,分别以BSA、OVA为载体蛋白合成CAP-BSA,CAP-OVA两种完全抗原,并对两种合成抗原的免疫效果进行比较。分别以这两种抗原作为免疫抗原用弗氏佐剂乳化后免疫新西兰大白兔,免疫四次后,心脏采血,分离血清,再用两种抗原分别作为包被原对兔血清进行间接竞争ELISA分析。【结果】大白兔经免疫后产生了抗氯霉素特异性抗体,两种抗原得到的抗体效价均达到1:8100,氯霉素最低检出限为9ng/mL。【结论】综合比较认为,CAP-OVA作为免疫原,CAP-BSA用作包被原是比较理想的实验方案,可用于制备氯霉素抗体和研制生产氯霉素酶联免疫试剂盒。     

西马特罗人工抗原的合成及鼠源多克隆抗血清的制备

拟合成并鉴定西马特罗(Cimaterol,CIM)人工抗原,通过动物免疫生产亲和力高、特异性好的鼠源CIM多克隆抗血清.通过重氮化方法将西马特罗偶联于载体蛋白BSA和OVA上,分别合成免疫抗原BSA-CIM和包被抗原OVA-CIM,并采用紫外分光光度法和SDS-PAGE进行了鉴定.结果表明,半抗原CIM和载体蛋白偶联成功.动物免疫试验结果显示,6只小鼠效价均达1×10-3以上,且4号小鼠多抗血清抗CIM的IC50为86.9 ng/mL,表明成功获得了高效价、特异性好、亲和力高的的鼠源抗CIM多抗血清.     

特布他林人工抗原的合成及鼠源多克隆抗血清的制备

合成并鉴定特布他林（Terbutaline,TBL）人工抗原,通过动物免疫生产亲和力高、特异性好的鼠源TBL多克隆抗血清。分别通过1,4丁二醚法和EDC法将特布他林偶联于载体蛋白BSA和OVA上,分别合成免疫抗原BSA-TBL和包被抗原OVA-TBL,并采用紫外分光光度法和SDS-PAGE进行鉴定,通过动物免疫试验获得鼠源多抗血清,并使用ELISA和阻断ELISA的方法对多抗血清进行了鉴定。结果表明半抗原TBL分别和载体蛋白BSA及OVA偶联成功;受免6只小鼠效价均达1×10-4以上,且1号小鼠多抗血清抗TBL的IC50为55.88 ng/mL。本试验成功合成了TBL人工抗原,并生产了高效价、高敏感性的鼠源多克隆抗血清,为TBL单克隆抗体制备及其快速检测试剂的研制奠定了坚实的基础。     

大豆GmLCL2蛋白的多克隆抗体制备

大豆(Glycine max L.)是典型的短日照植物,光周期反应对开花至关重要. GmLCL2 可能是大豆生物钟中的生物振荡器关键基因.为进一步研究 GmLCL2 基因的功能及与其他生物钟基因的相互作用,本试验克隆了 GmLCL2 的特异片段,制备了多克隆抗体并对细菌及大豆不同组织进行了免疫印迹检测.试验结果表明,多克隆抗体效价为1∶ 2000,并且在大豆不同组织(上胚轴、下胚轴、根、茎尖生长点和叶片)中均检测到GmLCL2蛋白的特异表达.获得的GmLCL2多克隆抗体效价较好,特异性较强,为后续GmLCL2功能研究提供良好探针.     

大肠杆菌内毒素多克隆抗体的制备与纯化

为制备大肠杆菌内毒素多克隆抗体,应用大肠杆菌内毒素作为抗原免疫5周龄家兔,辛酸-硫酸铵法和葡聚糖凝胶层析法分离提纯抗血清,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳方法鉴定多抗纯度,紫外分光光度计测定抗体蛋白含量,ELISA法检测抗血清效价与交叉反应;大肠杆菌内毒素抗体含量和效价分别为6.95mg/ml和1:12800;成功制备出抗大肠杆菌内毒素多克隆抗体,为大肠杆菌内毒素病诊断试剂盒的研制奠定基础。     

除草剂丁草胺人工抗原合成及其抗体制备研究

以除草剂丁草胺、巯基丙酸为原料,合成丁草胺半抗原,用氢核磁共振、电喷雾质谱、红外光谱方法进行鉴定;通过活泼酯法将半抗原与载体蛋白偶联制备丁草胺人工抗原,用紫外扫描法鉴定;免疫动物后,间接竞争ELISA检测鉴定抗体.结果表明,巯基丙酸与丁草胺连接生成半抗原,半抗原被连接到载体蛋白上,抗血清能被丁草胺阻断,丁草胺人工抗原合成成功,获得了抗丁草胺多克隆抗体.     

种植密度对小麦产量和群体质量影响的研究进展

合理密植是小麦生产中构建合理群体结构、夺取高产的重要栽培措施。分析了种植密度对小麦产量及其构成和群体质量的影响。分析表明：种植密度对小麦产量和群体质量有显著性的影响。种植密度的调整可以有效协调小麦单位面积穗数与穗粒数、千粒重的关系,进而获取高产;还可以有效控制小麦群体结构的变化,使之更加合理。     

阪崎肠杆菌多克隆抗体的制备与鉴定

为制备高效价的阪崎肠杆菌单克隆抗体,分别以福尔马林灭活的阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii)菌体和菌体破碎细胞为免疫原免疫雌性清洁级大白兔,制备抗C.sakazakii多克隆抗体,获得的抗体效价分别为256000和64000,选取菌体免疫原制备抗体。采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体,抗体纯度用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。斑点杂交法检测抗体特异性,所获抗体与S.aureus, L.monocytogenes, S.typhimurium, S.flexneri, E.coli无交叉反应,与沙门氏菌有轻微交叉反应,采用杂菌抗原反向吸附法去除了该交叉反应。选取菌体免疫原免疫动物,杂菌抗原反向吸附法纯化制备获得了对C.sakazakii特异性高的多克隆抗体,为阪崎肠杆菌免疫学检测奠定了基础。     

氯霉素多克隆抗体的制备及其免疫学特性鉴定

将氯霉素（CAP）进行化学修饰引入羧基活性基团,合成具有半抗原结构特征的氯霉素半琥珀酸酯（CAP-HS）;采用混合酸酐（MA）法将CAP-HS与牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）偶联合成人工免疫原BSA-CAP-HS和包被原OVA-CAP-HS,用红外（IR）、紫外（UV）、凝胶电泳（SDS-PAGE）进行鉴定;用BSA-CAP-HS免疫新西兰白兔和SPF鸡制备多克隆抗体（pAb）,间接ELISA测定其效价,阻断ELISA鉴定其敏感性,琼脂双扩散试验、WestGold膜杂交试验和交叉反应试验鉴定其特异性。结果表明,BSA-CAP-HS偶联成功,其分子结合比为15.6∶1,获得了高价、敏感、特异的CAP pAb,为CAP残留免疫学检测方法的建立奠定了基础。     

卡那霉素人工抗原的制备及鉴定

为了人工制备卡那霉素完全抗原。将卡那霉素标准品与牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(OVA)偶联,制备人工抗原。利用两种不同的偶联方法：碳二亚胺法(EDC)和戊二醛法(GDA),分别制备出KAN-BSA（作为免疫原）,KAN-GDA-OVA（作为包被原）。利用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定和动物免疫试验等,鉴定了完全抗原偶联情况。结果显示：制备的卡那霉素完全抗原能刺激小鼠机体产生相应抗体,且抗血清效价均达到1:2.56×10⁴,其中一号小鼠的IC₅₀值为22.28 ng/mL,说明完全抗原免疫原性良好,抗原制备成功。     

家蚕化学感受蛋白BmCSP8表达谱及多克隆抗体制备

为阐明昆虫化学感受蛋白(Chemosensory Proteins,CSPs)基因在昆虫不同组织部位和发育时期表达特性。运用半定量RT-PCR的方法分析了家蚕BmCSP8基因的时空表达谱。结果显示：（1）BmCSP8基因在雌、雄蛹中均表达,但在卵期不表达,在幼虫阶段,低龄期高于高龄期的表达量;（2）BmCSP8基因广泛分布于成虫身体各组织,但雌雄间的表达存在差异性,在主要感受器官触角中的表达量较低;运用重组BmCSP8蛋白成功制备兔多克隆抗体,Western-blot分析发现抗血清与触角蛋白发生特异性结合,为深入研究其生理功能打下基础。以上结果表明：BmCSP8基因可能参与了家蚕觅食的生理过程,且具有其他尚未明确的非嗅觉功能。     

EDS1多肽抗体的制备和应用

EDS1蛋白是植物寄主SA信号转导通路中重要调控功能的蛋白,为获得效价高和选择性强的EDS1抗体,本研究根据NCBI GenBank中报道的EDS1蛋白一级结构信息,采用Blastn和Blastx等生物信息学软件进行序列同源性分析,获得三段序列特异性较高的多肽,并从中优选一段序列特异性多肽,采用9-氟甲氧羰基固相合成法获得序列特异性最好的多肽,采用HPLC和GC-MS测定合成多肽的浓度和分子量,试验表明目的多肽纯度达89.37%,目的多肽分子量为1978.33。采用碳化二亚胺法将多肽与KLH进行偶联获得免疫原-Pep-KLH,并将其免疫新西兰大白兔以获得抗血清和多克隆抗体,采用ELISA和Western blotting测定其效价和特异性,经ELISA检测表明抗血清和多克隆抗体可与Pep发生特异性免疫反应,经Western blotting试验表明抗血清和多克隆抗体可识别烟草叶片特异性条带,其相对分子量为70 kD,与预测分子量相符,表明利用该方法制备的EDS1多肽抗体具有较高特异性和灵敏度。     

植物甜蛋白马宾灵(MabinlinⅡ)多克隆抗体的制备与鉴定

马宾灵(Mabinlin Ⅱ)是中国所特有的植物马槟榔种子中的甜味蛋白,将其作为新型甜味剂有着广阔的市场前景。为了给重组马宾灵的基因工程应用提供可靠的蛋白质检测与鉴定的抗体,通过离子交换法从马槟榔(Capparis masaikai Lévl)种子中分离纯化马宾灵,将其作为抗原免疫新西兰大白兔,收集免疫后血清经抗原亲和纯化制备马宾灵多克隆抗体。结果表明,制备的马宾灵多克隆抗体经ELISA检测效价比达到1:256000,Western-blot检测表明其具有良好的反应性和特异性。本研究制备的马宾灵多克隆抗体可用于马宾灵在不同生物反应器中表达的检测,为马宾灵的基因工程研究提供灵敏可靠的免疫学鉴定。     

病程相关蛋白-1a多克隆抗体的制备与应用

为获得效价高和选择性强的PR-1a抗体。根据NCBI GenBank中普通烟PR-1a一级结构信息,采用Blastn、Blastx和Expasy等软件进行序列同源性分析,获得1段序列特异性多肽,采用9-氟甲氧羰基固相合成法获得目的多肽,采用HPLC和LC-MS测定目的多肽的浓度和分子量。试验表明：目的多肽纯度达93.92%、分子量为2088.17;采用碳化二亚胺法制备获得Pep-KLH,并通过免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,采用间接-ELISA和Western blot测定其抗体效价和特异性,结果表明：抗血清在1:32000条件下,抗血清的吸光值(OD)约为1.0;经Western blot试验表明：抗血清和多克隆抗体可特异性识别烟草叶片组织内的PR-1a;同时,试验采用系统性获得性的免疫激活剂-BTH作用普通烟K-326,对作用后的0、6、12、24、48、76、144、96 h的烟草叶片总蛋白进行间接-ELISA,发现：BTH作用普通烟K-326 144 h后,PR-1a蛋白表达呈上调趋势;同时采用半定量RT-PCR试验也同样证实了BTH可诱导PR-1a基因表达上调,其表达上调趋势与间接-ELISA的研究结果相似。表明采用该方法制备的PR-1a多肽抗体具有较高的特异性和灵敏度,可用于免疫诱导剂等方面的研究。     

小鼠骨形成蛋白BMP3的原核表达及多克隆抗体制备与鉴定

为构建小鼠BMP3蛋白原核表达载体,纯化BMP3蛋白,制备并鉴定BMP3蛋白小鼠多克隆抗体,以及对BMP3进行系统进化关系研究。采用RT-PCR方法从小鼠肝脏中克隆获得BMP3蛋白的表达菌株;利用SDS-PAGE电泳切胶纯化、尿素梯度复性获得BMP3蛋白,免疫小鼠制备BMP3蛋白多克隆抗体;采用ELISA法检测抗体滴度达1∶3 200倍,Western Blotting证实抗血清具有很好的特异性。通过DNAMAN软件对BMP3序列同源性分析发现其C-端在不同动物间存在较高同源性;MEGA软件对BMP3序列的系统发生分析证实BMP3在动物间具有明显的进化趋势。为BMP3蛋白调控骨代谢及与肿瘤的关系研究奠定基础。     

黄曲霉毒素B1完全抗原合成及鼠源多抗血清的制备

为了合成黄曲霉毒素B1(AFB1)完全抗原,制备鼠源AFB1多克隆抗体血清。通过琥珀酰亚胺酯法在黄曲霉毒素B1(AFB1)分子上引入羧基,生成黄曲霉毒素B1肟(AFB1O)。用EDC法和DCC法合成AFB1-BSA和AFB1-OVA。采用薄层层析技术、紫外光谱技术(Uv)、SDS-PAGE鉴定完全抗原的合成。通过免疫BALB/c小鼠,获得鼠原多克隆血清,采用间接ELISA方法测定多抗血清的免疫效价,用竞争ELISA检测多克隆血清的敏感性和特异性。结果表明：免疫小鼠血清效价都在1:3200以上,其中6号鼠效价最高,到达1.28×10-4,敏感性好,半数抑制浓度IC50为22.268 ng/mL,交叉反应率低。本研究成功制备了AFB1完全抗原,获得了敏感的AFB1多克隆抗体血清,为以后制备AFB1单克隆抗体及免疫学快速检测方法奠定了基础。