转TLR4基因的绵羊胎儿成纤维细胞系的建立

为了通过脂质体介导的方法获得高效表达目的基因TLR4的绵羊胎儿成纤维细胞作为供体细胞,以便在胚胎移植前的体外筛选过程中,确定优越的转基因供体细胞,从而提高体细胞核移植生产抗病转基因绵羊的效率。本研究通过优化脂质体与质粒载体的比例浓度,进而再去转染原代培养的绵羊胎儿成纤维细胞,经G418筛选,以EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein )作为报告基因,从形态学与分子水平鉴定出已经稳定表达目的基因：Toll样受体4(Toll Like Receptor4,TLR4)基因的细胞系。最终经过筛选与纯化得到3个表达目的基因TLR4的细胞克隆,经RT-PCR与相对荧光定量PCR分析,在第二代转染的细胞中TLR4的表达最高,相对于未转染的绵羊胎儿成纤维细胞升高了9.65倍(P<0.01),并藉此为最终制备抗病转基因羊新品种,从提供稳定表达TLR4基因的转基因供体细胞系角度奠定基础。     

有机无机配施对春花果柠檬产量和品质的影响

为探讨不同有机无机配施对柠檬产量、花果发育动态和品质的影响,筛选出适合云南德宏柠檬生产的施肥配方,选择常用的3种复合肥和2种有机肥对尤力克柠檬进行配施或单施。结果表明：有机无机配施能够提高柠檬的产量,比单施有机肥处理产量高0.53 -7.16kg/株,比单施无机肥处理产量高0.43-9.80 kg/株;周甲有机肥与柠檬专用肥配施有利于柠檬开花与坐果;有机无机配施能改善柠檬的果实品质,以周甲有机肥与柠檬专用肥配施效果最佳,施用第二年,其出汁率、vc含量、可滴定酸含量、可溶性固型物含量分别比其他处理高0.02%-4.93%、0.75 mg / 100g -5.74 mg / 100g、0.16-1.76 g/kg、0.07%-0.63%。有机无机配施有利于柠檬的产量与品质的提升,并以周甲有机肥与柠檬专用肥配施效果最好,可在生产中推广使用。     

犬SLAM基因真核表达载体的构建及Vero细胞系转染的研究

为了研究犬瘟热病毒细胞受体SLAM基因的特性和功能。将基因SLAM克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,构建真核表达载体pCDNA3.1/SLAM,重组质粒纯化后应用脂质体2000转染到Vero细胞中,通过RT-PCR和免疫印迹方法检测犬SLAM基因在Vero细胞中的转录和表达情况。结果表明：成功构建了表达SLAM基因的真核表达载体,RT-PCR和免疫印迹显示SLAM基因获得表达;pcDNA3.1/SLAM载体的构建为研究犬SLAM基因在Vero细胞中的稳定表达奠定了基础。     

O型FMDV P1-2A基因与猪IFN-γ基因共表达质粒的构建及其在BHK-21细胞中的表达

为了构建O型FMDV P1-2A基因与猪IFN-γ基因共表达质粒并在BHK-21细胞中进行表达,本研究利用聚合酶链式反应(PCR)从阳性质粒pGEM-P12A克隆到P1-2A基因,将扩增产物纯化、双酶切后连接到pBudCE-IFN载体,构建重组质粒pBudCE-IFN-P1-2A.重组表达质粒鉴定后,在脂质体介导下转染BHK-21细胞,用RT-PCR和直接免疫荧光试验分别检测P1-2A 和IFN-γ在BHK-21细胞中的表达.RT-PCR检测显示,重组表达质粒转染细胞后P1-2A 和IFN-γ基因成功转录出mRNA;免疫荧光试验表明目的基因在BHK-21细胞中获得了表达.结果证明,本研究成功构建了重组质粒pBudCE-IFN-P1-2A并在体外进行了表达,这为研制抗FMDV DNA疫苗和IFN-γ的佐剂作用奠定了坚实基础.     

番茄果实特异性启动子2A11的基因克隆及功能研究

采用巢式PCR技术从番茄基因组DNA克隆到长度1.3kp的果实特异性2A11启动子基因。序列分析表明,克隆到的基因序列2A11启动子转录起始位点上游的621bp处缺失了已报道的番茄2A11启动子基因（GenBank ID M87659,1993）序列中的“tatattgttaacttcttgttgaattaaagcaat”片段,其同源性为61%,登入GenBank,ID号为DQ453963;构建植物表达载体pCAMBIA2A11,用农杆菌介导侵染番茄果实,GUS基因瞬间表达结果表明,该2A11启动子基因具有驱动GUS基因在番茄果实中特异性表达的功能。研究结果表明成功地获得2A11果实特异性启动子基因,为下一步转基因番茄口服疫苗的研制奠定了一定的基础。     

有机肥对茄子品质和产量的影响研究

有机肥与无机肥对于作物的品质与产量有着不同的影响,而茄子作为人们喜爱的蔬菜,其产量的提升成为了必然。通过对试验方法的研究,记录过程与结果变化,由此得出不同品种和不同使用量的有机肥对茄子品质与产量的影响情况,并最终得出相关结论。     

口蹄疫病毒3D基因真核表达载体pEGFP-3D的构建及其融合蛋白分子在BHK细胞中的定位

为研究口蹄疫病毒RNA聚合酶3D基因的分子生物学特性及定位,构建了3D基因真核表达载体pEGFP-3D,观察了3D在BHK-21细胞中的瞬时表达情况.从重组质粒pMDl8.T-3D扩增到3D基因,与pGEM-T easy载体连接,将鉴定为阳性的重组质粒pGEM-3D与表达载体pEGFP-N1分别经Barn H Ⅰ/Hind Ⅲ酶切,进行定向亚克隆;重组表达质粒pEGFP-3D经PCR、酶切鉴定.阳性质粒进行测序.利用脂质体介导阳性pEGFP-3D质粒转染BHK-21细胞.免疫组化检测转染细胞中3D基凶表达情况和3D基因在细胞中的定位,Western blotting验证pEGFP-3D融合基因的表达.结果表明,成功构建了重组表达质粒pEGFP-3D,并在BHK-21细胞中进行了表达.免疫组化分析表明,3D蛋白主要定位于细胞核;Western blotting证实pEGFP-3D融合蛋白在80 kDa处出现阳性条带,说明表达的外源蛋白具有免疫活性.pEGFP-3D表达载体转染细胞后很快就能通过观察荧光蛋白而检测出基因的瞬时表达情况,为基因转染研究中确定转染效率、3D的表达情况及蛋白定位等提供了直观的靶标,有望应用于FMDV聚合酶分子的生物学特性研究.     

柞蚕核型多角体病毒IE-1基因启动子的克隆与分析

以柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)DNA为模板,运用PCR技术钓取ApNPV(IE-1)基因的启动子片段,并将其克隆到pMD18-T载体上进行测序分析.将测序的2.7 kb DNA片段用EcoR I和Bgl II双酶切,回收3＇端1.6 kb的DNA片段.将该片段插入到pGFP-N2表达载体上构建以其作为启动子的IE-1/pGFP-N2重组质粒.重组质粒经脂质体介导转染Hela细胞,结果可见绿色荧光蛋白(GFP)在细胞中的表达,证明钓取的IE-1基因启动子片段具有启动子的转录活性.     

绣球属植物SRAP-PCR反应体系优化及引物筛选

为了确定绣球属植物SRAP-PCR最适宜的反应体系,以19种绣球属植物为材料,利用单因素分析法对影响SRAP-PCR反应体系的5个因素（DNA模板量,Mg2+浓度,dNTPs浓度,Taq聚合酶量和引物浓度）在11个水平上进行优化试验。结果表明,最佳的25 μL反应体系为：10×PCR Buffer 2.5 μL,DNA模板量30 ng,Mg2+浓度1.6 mmol/L、dNTPs浓度0.6 mmol/L,Taq聚合酶量3.5 U,引物浓度为0.2 μmol/L。单因素分析法获得的最佳反应体系适合绣球属植物SRAP的遗传多样性研究。     

甘草不同时期愈伤组织细胞形态与线粒体变化的研究

此实验为甘草愈伤组织继代培养和进一步研究提供方法依据。以乌拉尔甘草不同来源愈伤组织为材料,采用石蜡切片法观察了不同时期甘草愈伤组织细胞大小变化;采用悬滴法观察了不同时期甘草愈伤组织线粒体形态、大小变化。试验结果表明：愈伤组织细胞大小受外植体来源影响显著（P<0.05）,芽来源愈伤组织细胞大小（均值31.40 μm）大于叶来源愈伤组织细胞大小（均值29.41 μm）且大于根来源愈伤组织细胞大小（均值25.67 μm）;愈伤组织细胞大小受培养时期影响极显著（P<0.01）,培养到30天时细胞达最大,均值为37.45 μm,之后到40天时,细胞平均减小到29.55 μm。芽和叶来源愈伤组织细胞内的哑铃状线粒体数目高于根来源愈伤组织细胞内的哑铃状线粒体数目。愈伤组织细胞线粒体大小与外植体来源及培养时期有显著交互作用（P<0.05）,根来源愈伤组织在培养30天时线粒体长度均值最大,达2.60 μm。芽来源愈伤组织在培养40天时线粒体长度均值最大,达2.07 μm。叶来源愈伤组织在细胞培养40天时线粒体长度均值最大,达2.01 μm;培养时期对愈伤组织细胞线粒体大小影响极显著（P<0.01）,培养到30天时细胞最大,均值为2.06 μm。此研究结果,为甘草愈伤组织继代培养奠定了基础,同时为甘草脱分化及再分化调控提供细胞学方面的依据。     

梨ISSR-PCR反应体系的优化及在SRAP、SSR标记中的通用性研究

为获得最佳的梨ISSR-PCR反应体系,以及验证在其他标记上具有通用型,以‘新世纪梨’ב崇化大梨’杂交F1代为试验材料,采用L₂₅(5⁶)试验正交设计法及单因素方法,对反应体系中的模板DNA量、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶这4个单因素进行优化。结果表明,梨ISSR-PCR最优的20μL体积的反应体系中,含模板DNA 3 ng/μL,dNTPs 0.20 mmol/L,引物0.5μmol/L,TaqDNA聚合酶0.03 U/μL。采用优化后的反应体系对试验材料进行了SRAP、SSR标记方法的扩增,结果显示该反应体系也适用于梨属的SRAP、SSR分析。为梨属在以后的多标记的遗传多样性分析、种质资源评价和遗传图谱的构建等提供理论基础,并在试验中减少费用和提高效率。     

克氏原螯虾ISSR体系优化

为了获得最佳的克氏原螯虾ISSR-PCR 反应体系,采用单因素实验法将反应体系的Taq 聚合酶、 dNTPs和Mg2+ 3 个主要因素设定5 个梯度,根据每个因素量的变化对扩增结果产生的影响进行了研究,最后确定最佳反应体系为：总体积10 μL,1 μL 10×Taq Buffer、dNTPs 浓度0.6 mmol/L、0.6 U Taq DNA polymerase、MgCl2浓度1.8 mmol/L、20 ng DNA,引物浓度0.8 μmol/L。     

MC4R与Leptin、MC3R和CCKAR基因的互作研究

为了研究4个与采食量相关功能基因可能存在的互作关系,采用基因重组的方法构建了黑素皮质激素受体-4(MC4R)基因的真核表达载体,采用脂质体法将该表达载体转染入成纤维细胞,瞬时转染24 h后,采用Real-timePCR的方法检测和分析了Leptin、黑素皮质激素受体-3(MC3R)和猪缩胆囊素受体(CCKAR)基因mRNA的表达变化情况。结果表明,在成纤维细胞中,过表达MC4R基因后,Leptin、MC3R和CCKAR基因的mRNA水平均无显著变化。据此推测,MC4R基因与其他3个基因虽都参与调节动物的采食量,但很可能是通过不同的调控路径来发挥功能的。     

大白菜单拷贝序列的长片段PCR体系优化

目的序列长片段PCR产物可作为FISH技术的有效探针进行分子细胞遗传学研究。然而,传统PCR技术对于5 kb以上的长片段进行有效扩增很难。合适的反应条件及反应体系是进行长片段PCR有效扩增的必要前提。为了获得目的序列长片段PCR产物以用于FISH研究,根据大白菜A03染色体顶端无重复序列区段设计了80对长片段PCR引物,从基因组DNA模板质量、d NTPs浓度以及退火温度和延伸时间方面对PCR技术体系进行了优化。试验证明,选用幼苗嫩叶的基因组DNA和LA Taq DNA聚合酶可以提高长片段PCR引物的扩增质量和扩增效率;确定了适合5~15 kb长片段PCR的反应体系为20μL:50 ng/μL模板DNA 2μL,2.5 mmol/L d NTPs 1.6μL,10μmol/μL正反引物各1μL,10×LA PCR BufferⅡ(含Mg2+)2μL,5 U/μL LA Taq酶0.2μL;反应条件为98℃变性15 s;58~64℃退火10 s,68℃延伸5 min,35个循环;68℃延伸10 min,4℃保存。在大白菜基因组中成功获得了60对5~15 kb的扩增片段。为在大白菜粗线期染色体上开展长片段PCR-FISH技术研究及在近缘种间开展比较染色体涂染揭示进化关系奠定了理论基础。     

苹果不同HRM反应体系分析效果评价

高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)分析是一种新型的DNA多态性快速筛查技术。本研究以苹果品种"富士"和"舞姿"为试材,用来自苹果基因组的SSR标记CH03d11对不同反应体积、不同DNA浓度以及不同PCR退火程序下的HRM分型效果进行了测试与评估。结果表明:采用5μL反应体积可以获得与10μL或20μL反应体积相同的检测效果。在5μL反应体积中,DNA浓度小到0.25ng/μL时,PCR扩增及随后的HRM分析效果依然良好。另外,研究表明,采用降落PCR扩增模式也能取得良好的HRM多态性检测结果。     

白蜡属SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

本研究建立了适合白蜡SSR-PCR反应的最佳体系,并利用该体系从50对白蜡引物中筛选出了3对条带清晰、多态性好的引物,用于白蜡SSR标记的进一步研究。该研究采用L₁₆(4⁵正交设计和单因素试验对影响白蜡SSR-PCR的Taq聚合酶用量、Mg²⁺浓度、DNA模板浓度、dNTP浓度和引物浓度等5个因素在4水平上进行筛选。优化后的白蜡SSR反应体系为：Mg²⁺ (25 mmol/L) 0.8μL、引物(10μmol/L) 0.2μL、DNTP (10 mmol/L) 0.3μL、Taq酶(5 U/μL) 0.05μL、DNA模板(5~10 ng/μL) 2.00μL、10×PCR缓冲液1.0μL,ddH2O 5.45μL,总体积10.0μL。该结果为今后利用SSR-PCR标记技术研究分析白蜡奠定了基础。     

牡丹杂交品系SRAP-PCR反应体系优化及引物筛选

通过研究牡丹杂交新品系的遗传多样性,解决其在牡丹品种分类体系中位置的问题。利用正交设计,从Mg2+、dNTPs、引物浓度、DNA聚合酶和不同模板DNA浓度5种因素4个水平来优化牡丹杂交品系SRAP-PCR反应体系,对引物进行筛选。建立牡丹杂交品系SRAP-PCR反应最佳体系(25 μL)为： 2.0 mmol/L Mg2+、1.5 U Taq酶、0.25 mmol/L dNTPs、2 ng/μL模板DNA、0.25 μmol/L引物;运用试验结果从100对引物中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的SRAP引物30对。优化体系的建立及引物的筛选,可为利用SRAP标记技术研究牡丹杂交品系的遗传多样性及亲缘关系提供技术基础和理论依据。     

油葵SRAP-PCR反应体系的建立与优化

为建立油葵SRAP-PCR的反应体系,采用单因素试验法,对Mg2+、dNTPs、引物浓度、Taq DNA聚合酶、模板DNA分别设置5~7个水平梯度,筛选出适宜的用量范围,以此为基础,再通过L16(45)正交试验设计,对影响SRAP-PCR的5个因素进行优化,建立了油葵SRAP-PCR的最佳反应体系：20 μL体系中含10×Buffer 2 μL,Mg2+ 2.75 mmol/L,dNTPs 0.18 mmol/L,Taq DNA聚合酶1.25 U,正反引物各0.3 μmol/L,模板DNA 60 ng,最佳退火温度为52.2℃。用22份油葵材料对该体系进行验证,结果显示扩增条带清晰、多态性高,说明该体系稳定可靠,可有效的用于油葵种质资源的鉴定、遗传图谱构建等研究。     

花生SSR-PCR体系的优化

以花生品种丰花3号为材料,研究了花生SSR技术中PCR反应体系的主要成分对SSR 扩增效果的影响及不同引物的退火温度。结果表明dNTP 对扩增影响较大,每对引物都有其扩增适合的退火温度。确立了适合花生SSR 分子标记研究的优化体系。最终确定总反应体系为20 μl,其中25 mM MgCl2 1.5 μl,2.5 mM dNTP 1.6 μl,5 U/μl Taq 酶 0.17 μl,100 ng/μl模板DNA 0.4 μl,2.5 mM 引物 5 μl。优化后的扩增程序退火温度为54℃。     

芹菜RAPD反应体系的优化研究

本试验以一般RAPD反应程序为基础,采用单因素递进筛选方法,针对Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、随机引物和DNA模板5个主要影响因素,分别设置5个不同浓度梯度,对芹菜进行RAPD-PCR扩增,建立了芹菜RAPD技术最优体系。结果表明：25 μL反应体系中含Taq DNA聚合酶1.0 U、Mg2+ 3.0 mM、dNTPs 0.2 mM、引物28 ng、模板DNA 70 ng,10×PCR Buffer 2.5 μL;扩增程序为：94℃预变性5 min,94℃变性1 min,36℃退火1 min,72℃延伸1 min,进行42个循环,最后72℃延伸10 min。