甜瓜枯萎病菌原生质体的制备及再生条件筛选

获得甜瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. melonis)具有再生功能的原生质体,是构建其高效遗传转化体系的重要途径之一。本研究采用单因素分析法分析了甜瓜枯萎病菌菌丝摇培时间、裂解酶浓度、酶解时间和温度、渗透压稳定剂的种类和浓度及p H对原生质体释放的影响,并对再生培养基种类和培养基琼脂浓度等再生条件进行优化,建立了高效制备甜瓜枯萎病菌原生质体的稳定体系。结果表明,将分生孢子培养18 h后收集菌丝体,以1.2 mol/L的KCl作为稳定剂,在pH 6.0的条件下,加入10 mg/m L的裂解酶,32℃酶解4 h,获得的原生质体产量最高,在琼脂浓度为0.5%(W/V)的SR固体培养基中进行原生质体再生,再生率最高,可达26.32%。本研究结果为甜瓜枯萎病菌的分子生物学研究和抗病育种提供技术支持。     

大豆组织培养再生系统的研究进展

大豆因其愈伤组织难以分化、原生质体再生困难等因素,其再生体系一直不够完善。直到20世纪80年代初期,才成功建立了大豆的体细胞胚胎发生和器官发生再生系统。80年代末期原生质体培养获得突破。介绍了大豆器官发生再生系统、体细胞胚胎再生系统和原生质体再生系统的研究进展;对这3种再生系统进行遗传转化的优缺点作了比较;并提出了关于大豆遗传转化再生系统的几点展望。     

PEG介导的棉花枯萎病菌原生质体转化体系的建立

 通过酶解尖孢镰刀菌萎蔫专化型（Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum）FOV1和FOV4菌株幼嫩菌丝的细胞壁产生原生质体,PEG8000介导外源DNA随机插入的方法,分别获得具有抗潮霉素及荧光信号的转化子27个和39个,转化效率（以单位质量的DNA的转化子数计）分别为1350 mg^-1和1950 mg^-1。选取FOV1和FOV4菌株的代表性转化子各3株,经过5代继代培养后,其产孢量、荧光稳定性和致病性均无明显变化。因此,可以认为棉花枯萎菌原生质体的这种转化方法是一种比较稳定高效的遗传转化体系。     

甘蓝原生质体制备体系优化及瞬时转化体系的建立

为研究甘露醇浓度、酶解时间、离心力大小和不同外植体对原生质体产量和活力的影响,采用正交试验方案对甘蓝原生质体制备体系进行了优化,并建立了甘蓝原生质体的瞬时转化体系,同时利用该体系对甘蓝CRISPR/Cas9基因编辑系统进行了初步研究。结果表明:以下胚轴为材料,酶液组成为1%纤维素酶+0.5%离析酶+0.6 mol/L甘露醇+10 mmol/L MES+1 mmol/L CaCl_2+0.1%BSA+5 mmol/Lβ-巯基乙醇,26℃,60 r/min,黑暗酶解6 h后,用2 115 r/min离心5 min收集细胞,可获得高质量的原生质体,原生质体产量约为3.0×10~6个/g,活力约为90.9%;另外,在20%PEG4000介导下,将带有绿色荧光蛋白的载体(PYBA 1132)分别转入从甘蓝下胚轴、子叶、叶球分离获得的原生质体中,在荧光显微镜下观察到GFP绿色荧光信号,转化效率分别为43%,35%,19%,表明下胚轴分离获得的原生质体最适于瞬时转化。同时以下胚轴分离获得的原生质体为受体,分别转化线粒体特异表达载体COX和质体特异表达载体969,也观察到了荧光信号,成功建立了甘蓝原生质体瞬时转化体系,为甘蓝功能基因定位与功能分析提供了技术平台。最后,利用该体系对CRISPR/Cas9基因编辑载体(PBSE401-BoPDS)中sgRNA的靶向编辑能力进行了检测,结果显示,靶点1和靶点2附近的序列中有碱基替换和插入,表明该体系能够应用于甘蓝瞬时基因编辑,为甘蓝基因功能研究以及新种质的创制建立了重要的技术平台。     

转基因技术在大豆育种上的应用与研究

近年来,转基因技术在大豆上的研究重点主要集中在建立高效再生体系和稳定地遗传转化体系方面,随着遗传转化技术的发展,我国已获得了抗病、抗虫转基因的大豆植株并取得突破性进展。笔者就大豆遗传转化在受体系统(器官发生受体系统、体细胞胚胎发生受体系统、原生质体受体系统)以及转化方法(农杆菌介导法、基因枪法)等方面的研究进展情况进行了综述,并对今后大豆转基因研究方向进行了探讨。     

探究姜和大蒜粗提取液对甘蓝枯萎病菌的抑制作用

研究旨在了解不同浓度姜和大蒜粗提取液对甘蓝枯萎病菌的抑制效果及对菌丝形态结构的影响,以此初步获得最适合的抑制病原菌的植物粗提取液浓度。以姜和大蒜粗提取液为供试材料,测定不同浓度2种粗提取液对甘蓝枯萎病菌尖孢镰刀菌的生长情况、孢子浓度、孢子萌发率及菌丝结构的影响。结果表明,2种粗提取液均能抑制并降低尖孢镰刀菌的生长速率、孢子浓度和孢子萌发率,且大蒜粗提取液比姜粗提取液抑制效果更显著,在低浓度下对菌丝形态结构的影响也比姜粗提取液明显,大蒜粗提取液在各浓度下与对照相比均达极显著差异,且大蒜浓度为0.4 g/mL时对尖孢镰刀菌孢子萌发率抑制达100%。该试验证实大蒜对甘蓝枯萎病菌有极显著抑制作用,为使用间种或轮作大蒜进行田间防治甘蓝枯萎病菌提供了参考。     

菜豆再生体系及遗传转化体系研究进展

菜豆分子育种及功能基因组学分析需要高效稳定的再生体系和遗传转化体系。归纳了近年来国内外菜豆再生体系及遗传转化体系的研究进展。首先阐述了菜豆再生方法及研究现状,其中包括基于器官发生和体细胞胚发生不同途径菜豆再生体系的建立和相关的影响因素。其次概括了农杆菌介导法在菜豆遗传转化方面的研究进展,并分析了影响农杆菌介导遗传转化效率的主要因素,包括受体外植体类型和外植体损伤、农杆菌菌株及菌液浓度、共培养条件(时间、温度、光照时间)、乙酰丁香醇浓度等。然后叙述了有关基因枪介导菜豆遗传转化的研究进展。最后对目前菜豆再生体系和遗传转化体系存在的难题进行了总结,以期为建立菜豆的高效离体再生体系和遗传转化体系提供重要参考。     

禾谷类作物原生质体培养研究进展

植物原生质体在品种改良、基因遗传转化、远缘杂交的应用研究以及生物学的基础理论研究中有着重要的研究价值。为了给禾谷类作物原生质体培养体系的建立提供理论依据,推动禾谷类作物品种遗传改良工作的开展,从原生质体制备、培养、再生、应用四个方面对禾谷类作物原生质体的培养研究进行了详细的阐述,分析了禾谷类作物原生质体制备和培养的主要影响因素,归纳了禾谷类作物原生质体再生的3种途径,对其在遗传改良和理论研究方面的应用进行了总结,并提出了禾谷类作物原生质体培养、遗传转化、细胞融合三个方面存在的问题和今后努力的方向。     

杉木愈伤组织的高效诱导和瞬时转化体系的建立

本研究参考已有的杉木(Cunninghamia lanceolata)体细胞胚胎发生系统,建立了以杉木针叶为外植体的愈伤组织高效诱导体系和原生质体瞬时转化体系,并初步探讨了细胞壁再生和以茎段为受体材料的稳定遗传转化技术。以杉木针叶为外植体,在添加有1.0 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、2.0 mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)、1.0 mg/L 6-糠基氨基嘌呤(KT)以及0.5 mg/L萘乙酸(NAA)的MS培养基诱导愈伤组织,愈伤组织形成率可以达到87.5%;对分离得到的杉木次生木质部原生质体采用40%PEG-4000介导法进行原生质体瞬时转化,外源基因的转化率达到30%,并实现了原生质体多次分裂形成细胞团;以上结果表明,以杉木针叶作为外植体可高效诱导形成愈伤组织,且在增殖培养基上生长状态良好。本研究建立了杉木原生质体瞬时转化体系并实现了原生质体的细胞壁再生和分裂。     

西瓜‘SM1’高效遗传转化体系的构建

为构建高效的西瓜再生和遗传转化体系,本研究以西瓜‘SM1’材料子叶节为外植体,研究不同激素配比对子叶节再生的影响。在此基础上,通过农杆菌介导法导入外源基因,研究潮霉素浓度、农杆菌侵染时间、共培养时间等因素对遗传转化效率的影响,建立遗传转化体系。结果表明,‘SM1’不定芽分化最佳培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+IAA 0.1 mg/L,不定芽分化率为91.7%。最优遗传转化组合为农杆菌侵染时间15 min,共培养3 d,之后进行选择培养。外植体不定芽分化潮霉素最适浓度为10 mg/L,最适生根培养基为1/2MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.01 mg/L。通过潮霉素筛选和PCR鉴定,获得12株阳性转化株系,转化率为6.5%。本研究建立了高效西瓜‘SM1’再生及遗传转化体系,为进一步开展基因功能研究及西瓜遗传改良提供了技术支撑。     

杏鲍菇原生质体制备条件初探

为了提高杏鲍菇原生质体产量,以杏鲍菇菌株为材料,通过单因素试验研究酶浓度、酶解时间、酶解温度、菌丝培养方式、菌龄以及稳渗剂种类对杏鲍菇原生质体制备的影响。结果表明：杏鲍菇原生质体制备的最佳条件为:酶浓度2%、酶解时间2.5 h、酶解温度29℃、菌丝液体静置培养5天,以甘露醇为稳渗剂,在此条件下原生质体产量为33.4×106个/mL,为杏鲍菇原生质体技术育种提供参考。     

玉米胚乳细胞原生质体的分离与流式纯化

玉米胚乳是籽粒淀粉形成的主要场所,胚乳细胞的发育对籽粒的器官建成具有重要意义。分离胚乳细胞原生质体,能为胚乳培养、转录组分析等后续研究提供均一实验材料。本文在借鉴前人研究的基础上,通过调整酶的搭配种类、浓度以及质膜稳定剂、渗透压稳定剂的使用,优化了一套有效的玉米籽粒胚乳原生质体分离方法,并进一步运用流式分选技术纯化原生质体。结果表明,以1%纤维素酶、0.5％离析酶、0.5%半纤维素酶,在渗透压调节剂0.7~0.8 mol L^-1和质膜稳定剂0.8mol L^-1的MS培养液内,30℃消解4 h,能够获得大量完整的粗制原生质体,二乙酸荧光素(FDA)染色表明纯化的原生质体仍能保持90%以上的生活力。流式分选术可将有活力原生质体从粗制原生质体悬浮液中富集、纯化出来。对一些原生质体分离和流式分选时的技术参数和影响因素进行了讨论。     

白灵菇原生质体制备条件的优化

以白灵菇单核菌丝为材料,利用溶壁酶进行原生质体的制备,考察各因素对原生质体产量的影响,采用单因素试验和正交试验确定最佳条件。结果表明：原生质体产量最高的条件是取菌龄为7天的液体静置培养的菌丝体,以0.6 mol/L甘露醇为稳渗剂,在酶解温度27℃、酶浓度2%的条件下酶解150 min。研究结果可为白灵菇原生质体融合及转基因研究提供理论依据。     

旱稻原生质体培养和植株再生的研究

旱稻仿野生87-707品系具有多年生趋势，是我院研究多年生旱稻的一个材料。我们用它进行原生质体培养，想为研究多年生旱稻基因改良打下基础。现用该品系的成熟胚诱导的愈伤组织，在含有氨基酸丰富的AA培养基中进行细胞悬浮培养。取该细胞悬浮培养物游离的原生质体，用琼脂糖包埋于改良的KM8P培养基中，发生了持续分裂。经一系     

博落回叶肉组织原生质体的分离条件筛选

博落回(Macleaya cordata)是一种罂粟科博落回属的多年生草本植物,其体内的血根碱(sanguinarine,SAN)具有抗炎、调控肠道菌群和促进动物生长的作用,因此长期以此作为饲用抗生素的天然源替代品在全世界70个国家和地区广泛销售。随着全世界越来越多的国家限用甚至禁止饲用抗生素,博落回资源的需求逐年增加。因此,通过育种等方法来提高博落回中血根碱的含量具有十分重要的意义。而利用原生质体技术进行品种改良是一个快速高效的方法,其中制备原生质体是第一步。本研究以博落回无菌苗叶片为材料,进行了原生质体分离和纯化。在一定条件下,通过比较不同的酶解渗透压、温度、时间和pH值,得到最适甘露醇浓度为0.6 mol/L,最适温度为30℃,最适时间为6 h,最适酶液pH值为5.8,在该条件下的产量可达到6.03×10^5个/mL,活力为87.3%。该研究为未来博落回的种质资源创新提供了前期研究依据。     

植物原生质体再生细胞壁研究进展

原生质体作为单细胞且具有全能性,为研究植物细胞壁生物合成提供了独特的视角和模型.原生质体细胞壁再生过程复杂,涉及诸多细胞信号转导通路,应用普通的研究方法难以全面解析整个再生壁过程的分子网络.为充分了解植物原生质体再生壁内在特性,推动植物原生质体再生壁的分子机理进一步完善,笔者从原生质体再生细胞壁培养、细胞壁再生的细胞生...     

辣根叶片原生质体分离条件的研究

分离优质原生质体是进行细胞功能性以及生物膜特性研究的基础,建立适宜的"酶液浓度与酶解时间以及酶液渗透压"组合是获得高产优质原生质体的重要条件.本实验以辣根叶片为材料,研究了不同酶液浓度、溶液渗透压以及酶解时间对其原生质体分离的影响.结果表明,用浓度为1%纤维素酶+0.1%果胶酶+0.9mol/L甘露醇组成的混合酶液,在28.5℃条件下,pH为5.8的酶液组合中酶解50min时,可获得较高的原生质体产量,且原生质体活力较高.     

冬瓜枯萎病菌核糖体rDNA ITS区的克隆与序列分析

采用镰刀菌核糖体基因转录间隔区(ITS)通用引物,PCR扩增冬瓜枯萎病菌核糖体基因ITS区,并对产物进行克隆和序列分析;利用Mega 4.1软件对序列及GeneBank中以葫芦科为寄主的镰刀菌不同专化型ITS序列进行聚类。冬瓜枯萎病菌ITS全长1 063 bp,其中包括18S rDNA一部分序列,5.8S rDNA,ITS1和ITS2全部序列及28S rD-NA部分序列。聚类结果将15个菌株ITS序列划分为2个类群,类群I包括4个菌株,分别为2个西瓜枯萎病菌株和2个甜瓜枯萎病菌株;类群II包括11个菌株,其中冬瓜枯萎病菌株就在该类群中,其余为甜瓜枯萎病菌株5个、西瓜枯萎病菌株3个、黄瓜枯萎病菌株、丝瓜枯萎病菌株和葫芦枯萎病菌株各1个。