水稻肽链释放因子OseRF1-3基因克隆、表达及启动子分析

为了揭示水稻中肽链释放因子eRF1在蛋白质生物合成中的作用,对水稻eRF1基因的全长cDNA和启动子进行了克隆与表达模式分析。通过RT-PCR技术克隆获得1个水稻eRF1基因,命名为OseRF1-3,序列分析表明,该基因CDS序列全长1 308 bp,编码436个氨基酸,包含N、M、C共3个保守结构域。qRT-PCR结果表明,OseRF1-3是组成型表达,在水稻穗中表达最高。以水稻叶片基因组DNA为模板,通过PCR技术克隆了该基因起始密码子上游2 120 bp启动子序列,构建该基因启动子融合GUS植物表达载体,并通过农杆菌介导法导入水稻愈伤组织。GUS组织化学染色分析表明,OseRF1-3基因启动子驱动GUS基因在水稻各组织部位都表达即组成型表达,在根中表达较弱,在水稻花、硬壳中检测到GUS基因较强表达。GUS检测OseRF1-3基因启动子驱动GUS表达的结果与qRT-PCR得出的结果相一致。因此,该研究将为进一步探索OseRF1-3基因的功能奠定理论基础。     

柽柳GRAS转录因子基因启动子克隆和表达分析

克隆获得柽柳GRAS 转录因子基因启动子序列,并对其表达模式进行分析,从而初步探究GRAS转录因子基因的表达特征和功能。CTAB法提取刚毛柽柳基因组DNA,按照Genome Walking Kit 说明克隆GRAS 转录因子基因启动子序列,将克隆获得的GRAS 转录因子基因启动子序列定向替换pCAMB1301 载体上的35S启动子序列,构建融合表达载体,以驱动GUS 基因表达,瞬时侵染拟南芥后进行GUS 基因的染色。成功克隆获得刚毛柽柳936 bp 的GRAS 转录因子基因启动子序列。PLACE 和PlantCARE 数据库分析结果表明该启动子不仅包含启动子区的核心元件CAAT-box 和TATA-box,还含有多个与逆境应答有关的顺式调控元件。成功将GRAS 基因启动子序列定向置换pCAMBIA1301 的35S 启动子,构建重组载体PGRAS::GUS。瞬时转化拟南芥后GUS 染色,结果显示转基因拟南芥叶片被染色而根部着色较浅。初步表明克隆获得的GRAS 基因启动子具有启动子表达活性,其可能参与了柽柳的抗逆应答,为进一步分析该基因的抗逆功能和抗逆机制奠定了基础。     

甘蔗ScHAK11基因启动子的克隆与初步分析

钾转运体ScHAK11基因是甘蔗钾转运体基因家族的重要成员。本研究以甘蔗为材料,通过染色体步移方法对ScHAK11上游启动子片段(pScHAK11)进行克隆,获得ScHAK11起始密码子ATG上游启动子序列,序列长度为2 018 bp。序列分析表明,该序列包含多个真核生物启动子核心元件TATA-box、CAAT-box以及与逆境胁迫、光响应、激素诱导、分生组织和叶肉栅栏组织表达等顺式作用元件,推测pScHAK11启动子受到多种激素和逆境胁迫诱导表达,并通过分生组织和叶肉栅栏组织等顺式调控元件参与对甘蔗组织发育的调控。将p ScHAK11启动子序列与包含GUS基因的载体pBI121连接进行活性分析,发现pScHAK11启动子片段能驱动GUS基因在烟草茎和根中瞬时表达。荧光定量PCR结果表明,ScHAK11主要在甘蔗叶片和根系表达,且其表达受发育时期的影响,该结果与pScHAK11启动子驱动的GUS基因在烟草中的表达结果不一致,结果表明p Sc HAK11启动子是组织特异型启动子。本研究结果有助于深入了解ScHAK11基因表达调控的分子机制,为研究ScHAK11基因的转录调控机制奠定基础。     

玉米ZmPR4启子的克隆及其在小麦幼胚愈伤组织中的活性分析

以玉米B73基因组DNA为模板, 通过特异PCR扩增, 克隆出玉米启动子ZmPR4序列。序列分析表明, 该启动子与AJ969166序列同源性为100%。构建了ZmPR4或玉米泛素基因(Ubiquitin)启动子控制的报告基因GUS的表达载体。通过基因枪介导法转化小麦幼胚愈伤组织。瞬间表达实验表明, 在小麦幼胚愈伤组织中, 玉米ZmPR4启动子的本底表达活性明显比Ubi启动子的低, 但经纹枯病菌诱导后, ZmPR4 启动子控制的GUS基因的表达明显增强。PCR检测结果证实ZmPR4 启动子在小麦愈伤组织中具有表达活性, 能够驱动GUS基因的表达。因此, 玉米ZmPR4启动子在小麦抗病基因工程育种中具有潜在的应用价值。     

玉米ZmPR4启动子的克隆及其在小麦幼胚愈伤组织中的活性分析

以玉米B73基因组DNA为模板,通过特异PCR扩增,克隆出玉米启动子ZmPR4序列。序列分析表明,该启动子与AJ969166序列同源性为100%。构建了ZmPR4或玉米泛素基因(Ubiquitin)启动子控制的报告基因GUS的表达载体。通过基因枪介导法转化小麦幼胚愈伤组织。瞬间表达实验表明,在小麦幼胚愈伤组织中,玉米ZmPR4启动子的本底表达活性明显比Ubi启动子的低,但经纹枯病菌诱导后,ZmPR4启动子控制的GUS基因的表达明显增强。PCR检测结果证实ZmPR4启动子在小麦愈伤组织中具有表达活性,能够驱动GUS基因的表达。因此,玉米ZmPR4启动子在小麦抗病基因工程育种中具有潜在的应用价值。     

大豆硬脂酸-ACP脱饱和酶基因启动子的克隆及其表达活性分析

以吉豆2号基因组为模板,通过TAIL PCR方法,扩增得到大豆硬脂酸-ACP脱饱和酶基因启动子片段SACPD-Cp。PLACE在线启动子预测分析表明, 该序列中含有多种典型的种子特异性表达序列元件。将SACPD-Cp片段取代pCAMBIA1301质粒中的CaMV35S启动子,构建表达载体pCAM-SACPD-Cp,通过农杆菌介导法在大豆组织中进行瞬时表达,GUS组织化学染色和荧光定量研究其表达特性。结果表明, SACPD-Cp驱动GUS基因在种子中的表达活性是CaMV35S启动子的93.01%;SACPD-Cp启动子与现已知启动子无同源性,仅在大豆种子中检测到GUS活性,而在根、茎和叶组织中均未检测到GUS活性,证实 SACPD-Cp是一个新的种子特异性启动子。     

甘蓝型油菜BnaFIL基因启动子的克隆与表达分析

为了进一步了解启动子在甘蓝型油菜FIL基因(BnaFIL)表达调控中的作用,根据甘蓝型油菜基因组数据,以甘蓝型油菜叶片提取的DNA为模板,对甘蓝型油菜BnaFIL基因的启动子序列pBnaFIL进行克隆,长度为1 326 bp。采用PlantCARE在线分析软件对该启动子序列进行生物信息学序列分析,结果表明,该序列含有参与光反应的部分保守DNA模块以及CAAT-box和TATA-box等核心启动子必备元件,与分生组织表达有关的顺式作用的调控元件CAT-box以及光敏反应元件。通过该启动子序列替换pBI121植物表达载体上的CaMV35S启动子,使该启动子与GUS基因融合获得pBnaFIL-GUS表达载体,将载体通过农杆菌花序浸染的方法转入拟南芥中,获得了早花启动子重组质粒阳性转基因株系和晚花启动子重组质粒阳性转基因株系。之后对转基因拟南芥植株进行GUS染色分析,对启动子的表达效果进行了检测,最终在不同的转基因拟南芥植株中均发现了GUS基因的表达。结果表明,早花材料与晚花材料中启动子表达强弱存在差异,早花材料启动子的驱动基因表达效果比晚花材料启动子的驱动效果要好,由此推断,启动子的驱动效果...     

水稻rTGA4转录因子的启动子特征分析

TGA转录因子通过与NPR1基因协同作用参与植物对病害的防御作用。从水稻突变体HX-3基因组中分离到一个TGA转录因子rTGA4的5’非翻译区1 995 bp的序列(pTGA),该序列与日本晴基因组序列仅有94%的相似性。经PLACE和PlantCARE序列分析表明:该片段含有典型的TATA-box、CAAT-box等基本转录元件,以及脱落酸、乙烯、茉莉酸甲酯、赤霉素以及病原菌响应元件等。将得到的pTGA利用T/A克隆法连接到植物表达载体pCXGUS-T/A上,通过花序浸染法转化拟南芥,并对转基因拟南芥进行分子检测及GUS组织化学染色。结果表明,在苗期时GUS主要在幼苗根尖表达,在其他部位均没有表达;而在成熟期GUS在多处均有表达,特异性并不明显,表明该启动子是受生长发育阶段调控的组织特异性启动子。通过对rTGA4启动子的特征研究,为进一步克隆HX-3中的抗性基因以及利用奠定基础。     

花生Δ~9-硬脂酰-ACP脱氢酶基因启动子的克隆及功能分析

Δ~9-硬脂酰-ACP脱氢酶(SAD)是决定植物体内饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸比值的关键酶。以花生品种豫花9326基因组DNA为模板,通过基因组步移技术,克隆到花生Δ~9-硬脂酰-ACP脱氢酶基因(Ah SAD)起始密码子ATG上游720 bp片段,利用5'RACE方法获得了该基因的5'UTR序列,通过序列比对确定720 bp片段为Ah SAD启动子区域。PLACE在线启动子预测分析表明,该序列具有真核生物启动子必需的核心元件TATA-box和CAAT-box,含有多个与光诱导和激素响应相关顺式序列元件。将Ah SAD启动子片段替换pBI121质粒中的CaMV35S启动子驱动下游GUS基因表达,构建植物表达载体pBI-PAh SAD。通过农杆菌介导法转化拟南芥和在花生不同组织中瞬时表达,利用GUS组织化学染色研究其表达特性。表明在拟南芥和花生受体中,AhSAD启动子主要调控下游基因在根、茎、叶片和子叶中表达,在花生的果针中也检测到GUS活性;拟南芥的茎生叶只有叶脉中具有GUS活性,而花生整个叶片中都具有GUS活性。     

绵果荠CBF基因启动子克隆及诱导特性分析

CBF基因不仅是植物CBF抗冷途径的枢纽,而且可以提高植物的抗冷能力。而植物的抗冷能力的提高是由于CBF基因调控下游抗冷基因的表达来实现的。本研究根据前期已克隆得到的绵果荠Ll CBF基因(JQ687132)序列,利用TAIL-PCR方法从新疆早春短命植物绵果荠基因组DNA中分离得到Ll CBF基因编码区上游1 172 bp启动子序列;将该序列连入克隆载体并测序,通过生物信息学分析表明,该序列含TATAbox、CAAT-box等典型的真核生物核心启动子元件,同时具有等逆境响应相关元件。在烟草叶片中的瞬时表达分析,进一步表明,在低温、干旱及盐胁迫诱导下该启动子序列具有驱动GUS报告基因表达的特性。本研究对新疆早春短命植物种质资源的开发利用及丰富作物逆境基因工程诱导启动子资源具有重要的实践意义。     

转录因子CBF4诱导型启动子的克隆及功能分析

根据已有文献及公开的拟南芥基因组序列,利用PCR方法从拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组DNA中扩增得到了转录因子CBF4上游的DNA片断,对其进行序列分析表明与GenBank序列高度同源,同时对其进行初步的功能分析。采用生物信息学方法对这一序列分析的结果显示这一片段具有启动子的特殊结构域;与GUS基因融合构建双元表达载体,转化烟草的组织特异性表达检测可见明显的GUS活性,初步表明所获片断为CBF4基因的诱导型启动子。     

草鱼MyoG基因的克隆及其组织表达谱分析

为了获得草鱼(Myogenin) MyoG基因序列,阐明其在草鱼不同组织的表达规律。根据鲤鱼(Cyprinus carpio)基因MyoG序列(AB012881)设计引物,通过RT-PCR技术克隆草鱼MyoG的cDNA全序列,并对cDNA序列的氨基酸同源性、理化性质等进行了预测和分析。同时利用半定量RT-PCR分析草鱼MyoG基因在草鱼不同组织中的mRNA表达特性。结果表明：得到草鱼MyoG序列789 bp,开放阅读框(ORF)序列762 bp, GenBank登陆号为JQ793897。编码253个氨基酸,具有MyoD家族基因的典型性碱性螺旋-环-螺旋(Basic helix-loop-helix,bHLH)结构,与斑马鱼、鲤鱼、虹鳟、大西洋鲑等同源性较高,为73%~95%,但与哺乳动物和禽类如人、小鼠、猪、牛和鸡的同源性较低,为53%~57%。在草鱼红肌、白肌、脂肪、肝胰脏、肾脏、脑、肠、心脏、鳃中均检测到MyoG基因的表达,并且在白肌中表达量显著高于其他组织(P＜0.05),在脑、肝胰脏和鳃中亦有较高水平表达。成功获得草鱼MyoG基因序列,并在白肌中的表达显著高于其他组织,为研究MyoG在草鱼肌肉发育过程中的作用提供基础资料。     

兜兰二氢黄烷酮醇-4-还原酶基因的克隆及其表达特性

克隆同色兜兰二氢黄烷酮醇-4-还原酶基因DFR,分析其序列特征,了解其在不同组织部位的表达情况。采用RT-PCR和RACE技术从花中克隆DFR的全长cDNA,用生物信息学方法分析序列特征,并用半定量RT-PCR研究其在不同组织的表达。分离到DFR,该cDNA全长1267 bp,具有1个1074 bp的完整开放阅读框,编码357个氨基酸。序列分析表明,该DFR蛋白含有1个NADB_Rossmann superfamily保守结构域,1个NADP(H)结合域和1个底物特异性结合域,其与文心兰、石斛兰和大花蕙兰等的DFR同源性在75%~80%。系统进化树显示,该DFR蛋白与兰科植物的DFR蛋白亲缘关系比较近。半定量RT-PCR表明,该DFR在成熟花和营养叶中的表达量最高,在子房、苞叶、萼片和花瓣中的表达量相当,在唇瓣中的表达量次之,在蕊柱中的表达量较唇瓣中的低,在花茎中的表达量最低,在根中几乎检测不到。原核表达结果表明,该DFR在大肠杆菌中获得表达。从兜兰中克隆到花色代谢途径中的关键酶基因DFR,该基因可能参与调控花色素的合成。     

牡丹类psDHN-YSK2基因全长cDNA的克隆与表达分析

为了获得牡丹类脱水素基因的全长cDNA序列,推测其在休眠解除进程中的生物学功能,以不同低温处理时间的牡丹花芽为供试材料,末端快速扩增方法克隆全长cDNA序列,实时定量PCR分析其表达模式。结果表明牡丹类脱水素基因全长cDNA序列为1187 bp,包括831 bp的开放阅读框,114 bp的5’非编码区和242 bp的3’非编码区。其编码的蛋白具有两个植物脱水素蛋白特征性K片段,根据Close的分类方法,属于YSK2类脱水素蛋白。系统发生分析表明psDHN-YSK2基因与葡萄亲缘关系最近。在花芽内休眠解除前期随着低温处理时间的延长psDHN-YSK2表达呈上调趋势。本研究克隆了牡丹psDHN-YSK2的全长cDNA序列,分析了其在花芽内休眠解除过程的表达趋势,暗示了其参与了牡丹花芽的内休眠过程。     

大豆CML38-like基因的克隆及表达载体构建

类钙调蛋白(CaM-likeprotein,CML)在植物抵抗逆境中发挥了重要的作用,因此研究CML基因是植物抗逆分子育种的一个重要分子基础。本实验室在前期工作中筛选得到1个片段大小为264 bp的大豆CML基因,对该基因序列设计特异性引物,利用PCR技术对该基因进行扩增,并获得大小为264 bp的片段,利用无缝克隆技术连接到pMD18T载体上,获得克隆载体。通过对该基因的核苷酸序列分析,在NCBI上发现该基因序列与大豆Calcium-binding protein(CML38-like)基因序列相似度为98.53%。目前对CML38-like基因的功能还未见报道,本研究根据克隆测序得到的基因序列构建系统进化树并分析,随后对该基因的蛋白质二级结构和蛋白质三级结构进行预测,发现该基因可能对大豆抗旱有着一定的影响。最后通过克隆载体构建CML38-like基因的过表达载体以及RNA干扰表达载体。本研究为鉴定大豆CML38-like基因的功能和了解该基因对大豆的非生物胁迫反应的影响提供了理论依据。     

rd29A启动子的克隆及提高烟草抗逆性的研究

根据GenBank上公布的rd29A基因序列(D13044),利用PCR方法从拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组DNA中扩增得到了rd29A基因的启动子片段.序列分析表明,该片段与D13044有99%的同源性,它包括了DRE等4种完整的顺式作用元件.与GUS基因融合构建双元植物表达载体pBI-rd.转基因烟草的GUS活性组织染色分析及Northern杂交分析均表明,3种胁迫处理均可诱导GUS基因大量表达.其中,15%PEG和0.5%NaCl胁迫处理的转基因烟草比0℃低温处理的转基因烟草的GUS表达量高,而未经胁迫处理的转基因烟草的GUS基因只有少量表达.这些结果表明,rd29A属胁迫诱导型启动子,当植物遭受逆境胁迫时,rd29A启动子可以驱动下游目的基因超量表达,这就为通过基因工程途径提高植物抗逆性奠定了基础.     

苹果赤霉素3-氧化酶1(MdGA3ox1)启动子区

通过研究苹果赤霉素3-氧化酶1(MdGA3ox1)的启动子来探索MdGA3ox1的转录调控机制。采用染色体步移法结合锚定PCR法扩增了MdGA3ox1的上游序列,用PLANT CARE启动子分析软件分析此启动子序列,并把其构建到载体上,转化入根癌农杆菌中初步验证了其功能。获得一个754 bp的DNA序列,分析此序列发现有CAATbox、TATAbox、赤霉素、光、乙烯、脱落酸等顺式反应元件。把此序列构建到pCAMBIA 1381载体上,并把此质粒命名为p1381-GA3ox1p。把p1381-GA3ox1p转化入农杆菌EHA105中,利用GUS染色液染色,农杆菌呈蓝色。获得了MdGA3ox1的上游序列,此序列上含有与GA调节相关的顺式反应元件,并且初步证明此序列具有启动子活性。     

三角帆蚌Rab3 cDNA全长克隆及其原核表达

根据三角帆蚌消减杂交cDNA文库获得的EST序列,运用cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends,RACE）技术获得三角帆蚌Rab3基因的全长cDNA序列（GenBank登录号为HQ190954）。序列全长1707 bp,开放阅读框666 bp,编码221个氨基酸,5’端非编码区为158 bp,3’端非编码区为883 bp。软件推测其编码蛋白相对分子量为24.92 KDa。NCBI Blastp进行氨基酸序列同源性分析表明,与居蟹皮海绵（Suberites domuncula）的Rab-3like（SdRab3）氨基酸相似性最高,为64%,构建进化树的结论也是先与居蟹皮海绵的Rab3-like（SdRab3）聚为一支。根据获得的Rab3基因cDNA全长序列,设计特异性引物扩增获得完整开放阅读框序列,并将已克隆到的三角帆蚌Rab3开放阅读框定向插入原核表达载体PQE-His质粒中,转化大肠杆菌BL21（DE3）。在30℃,5 h,1 mM IPTG的诱导条件下,Rab3蛋白得到高效表达,重组菌体经裂解和SDS-PAGE电泳分析,发现一条26 kDa左右特异的蛋白表达条带,其表达量约占菌体总蛋白30%。Western-blot检测表明,在健康组和病变三角帆蚌肝脏中,Rab3蛋白与β-actin的表达量比值分别为0.438和0.580。这一结果说明,Rab3基因在三角帆蚌经病原菌侵染后,表达量上调,且已有研究表明Rab3有通过调节中性粒细胞的胞吐作用来抵抗细菌侵入、防止机体感染的功能,从而初步推测三角帆蚌Rab3蛋白可能与三角帆蚌瘟病有关。     

虹鳟Hepcidin cDNA的克隆及序列分析

为了从虹鳟肝脏中扩增出Hepcidinc全长DNA序列,预测出氨基酸序列,并进行序列分析。通过RT-PCR和RACEPCR的方法,从虹鳟肝脏中克隆获得了Hepcidin全长cDNA序列,利用在线工具和软件包分析。结果表明:虹鳟Hepcidin全长cDNA序列(GenBank登录号HQ711993)为883bp,5’端非翻译区211bp,3’端非翻译区为405bp,以及一段267bp的编码序列,编码88个氨基酸,由信号肽(24个氨基酸)、原肽(39个氨基酸)和成熟肽(25个氨基酸)组成,成熟肽C端含有Hepcidin类抗菌肽的8个半胱氨酸保守性结构,可形成4个分子内二硫键。与已报道的鲑形目大西洋鲑Hepcidin氨基酸序列的一致性为93%,与其他鱼类Hepcidin氨基酸序列的一致性为44%~88%,是Hepcidin家族的新成员。     

粉花石榴二氢黄酮醇还原酶基因cDNA片段的分离及鉴定

为了研究二氢黄酮醇还原酶（DFR）在石榴花色形成中的作用,根据GenBank中登录的相关物种DFR基因的保守序列设计简并引物,采用RT-PCR方法,从‘重瓣粉花’石榴花瓣总RNA中扩增出cDNA片段。测序结果表明,该cDNA片段长446 bp,编码148个氨基酸,序列分析表明,该片段与蓝灰石竹、水蓼、苦荞麦、荞麦、甜樱桃、金荞麦、菠菜、马六甲葡萄、山葡萄、马蹄纹天竺葵、仙客来等物种的氨基酸同源性在78%~81%以上,存在一个底物结合特异性决定的氨基酸基序“TVNVQPVQRPVHDETSWSDLDFVWAT”,说明已成功克隆到‘重瓣粉花’石榴DFR基因的cDNA片段,在GenBank中登录号为JN381544。