GmMYB042基因对类黄酮生物合成的调控作用

MYB类转录因子是植物中最大的转录因子基因家族之一,广泛参与植物生长发育全过程,对植物次生代谢等具有重要的调控作用。本研究对大豆GmMYB042基因的表达特性和功能进行了系统的研究,针对该基因C端的保守氨基酸基序(PDLNLELTIS)和锌指结构进行了一系列的序列删除突变,并将各缺失突变体在烟草中进行了过表达,以验证目的基因及其特殊基序的功能。表达特性分析结果表明GmMYB042基因在大豆的根瘤、根、茎、叶、花、荚果皮和种子中均有表达,且在茎、种子和花中的表达量相对较高;GmMYB042基因在大豆中的表达受PEG、高盐、低温和UV-B辐射的诱导。过表达分析结果表明,GmMYB042基因的过表达使转基因烟草类黄酮代谢途径部分关键酶基因(如PAL、CHS和FLS)的表达量明显上升,转基因烟草总黄酮的含量明显高于对照;各缺失突变体的转基因烟草类黄酮代谢途径相应酶基因的表达量发生相应的变化,进一步证明目的基因对类黄酮生物合成的调控作用;各缺失突变体的转基因烟草的叶缘有明显的皱褶,说明目的基因可能还参与调控叶的形态建成。     

蚜虫基因RNAi载体的构建及其在转基因烟草中dsRNA的表达分析

RNAi机制可以通过dsRNA诱导同源mRNA的降解,从而导致该基因转录后沉默。RNA干扰作用从发现以来就具有了利用转录后基因沉默（PTGS）来进行抗虫的一种潜在可能性。针对dsRNA的这种作用,研究中提取蚜虫RNA,克隆出蚜虫Cathepsin B基因的干扰片段并构建出RNAi载体,转入本氏烟草中,在转基因烟草体内表达dsRNA。成功构建RNAi载体后,通过农杆菌转化和叶盘法将RNAi载体导入烟草中并采用组织培养方法培养出转基因烟草,通过PCR鉴定显示15株生根的转基因烟草中14株显示阳性。提取转基因烟草的RNA进行RT-PCR和Northern表达分析显示转基因烟草植株中dsRNA表达的存在。实验结果说明了在转基因植物体内表达RNAi载体可以产生dsRNA,从而在蚜虫进食植物时达到利用dsRNA抗蚜虫的作用。     

转大豆GmPRP和SbPRP基因烟草对非生物胁迫耐受能力分析

为实现PRPs基因在植物抗逆基因工程中的应用,将大豆中的2个脯氨酸富集蛋白基因GmPRP和SbPRP构建到植物表达载体pRI101上,通过叶盘法转化烟草。共获得GmPRP阳性转基因烟草2株,SbPRP阳性转基因烟草4株。对转基因烟草植株进行高盐、干旱和低温胁迫处理。结果表明,高盐处理后,SbPRP转基因烟草的脯氨酸含量和可溶性糖含量分别显著和极显著高于野生型,丙二醛含量极显著低于野生型。干旱处理对GmPRP和SbPRP转基因烟草脯氨酸含量、可溶性糖含量和丙二醛含量的影响均不明显。低温处理后,GmPRP和SbPRP转基因烟草的脯氨酸含量均极显著高于野生型,丙二醛含量均低于野生型。由此推测SbPRP可以提高转基因烟草的耐盐性和耐寒性,GmPRP可以提高转基因烟草的耐寒性,为后续SbPRP和GmPRP的应用奠定基础。     

棉花HSP70基因植物表达载体的构建及转化烟草的研究

为研究棉花HSP70 基因在转基因植物中抗旱效果,利用前期克隆的GhHSP70 基因,以pCAMBIA1304 质粒为植物表达载体,构建了GhHSP70 基因的植物表达载体CAMBIA1304-HSP70;采用冻融法转入根癌农杆菌EHA105 菌株,通过叶盘法对模式植物烟草进行遗传转化研究。结果表明,在潮霉素(50 mg/L)选择压力下获得的烟草转化不定芽和完整植株,经过PCR方法以及GUS基因组织化学法检测鉴定转基因烟草,其中有5 株为阳性植株。初步证实了GhHSP70 基因已导入烟草基因组中。为进一步研究该基因的功能提供实验基础,同时为后续转化棉花改善其抗旱能力奠定基础。     

转棉花叶绿体Cu/Zn-SOD基因烟草的获得及其功能的初步验证

构建了棉花叶绿体Cu/Zn-SOD基因的植物表达载体,利用农杆菌介导法将其导入NC89烟草,PCR、Southern blotting检测结果显示有4个烟草株系中整合了棉花叶绿体Cu/Zn-SOD基因,SOD酶活性测定结果显示4株转基因烟草植株SOD酶活性都明显高于非转基因烟草,离体叶片暗处理试验结果也证明四株转基因烟草比非转基因烟草SOD酶活下降速度明显减慢,百草枯喷施试验表明,转基因烟草都比非转基因烟草对百草枯的耐性增强,这一系列试验间接地说明外源基因的导入增强了烟草的耐衰老能力,本研究为今后利用SOD基因研究作物的早衰性状奠定了基础.     

大豆低温诱导启动子GmERF9P的克隆及活性鉴定

为获得低温诱导基因GmERF9启动子,并分析该启动子的功能,利用PCR技术从大豆叶片基因组DNA中克隆1885bp的GmERF9启动子序列GmERF9P。序列分析表明,GmERF9P序列中含有多种与逆境相关的顺式作用元件。将GmERF9P构建到植物表达载体pCAMBIA1301上并转化烟草。通过PCR检测共获得6株T_1阳性转基因烟草株系。对野生型烟草和转基因烟草进行低温处理2h,通过GUS组织化学染色和实时荧光定量PCR检测GUS基因的表达量。结果显示GmERF9P在低温处理下能够提高GUS基因的表达量,具有低温诱导启动活性。     

利用转基因番茄生产人胰岛素的研究

利用转基因番茄作为生物反应器生产人胰岛素，研究以口服方式摄入胰岛素在抑制自身免疫攻击以及预防I型糖尿病中所起到的作用。为了提高人胰岛素在植物细胞中的表达量并正确折叠形成有活性的胰岛素分子，用双链法人工合成了人胰岛素基因，该基因全部采用植物偏爱密码子，并将B链与A链用一可以形成典型的β转角的6氨基酸短肽连接起来。分别将其与组成型表达启动子35S和番茄果实专一性启动子2A12融合构建了植物表达载体pCAM35S-Ins和pCAM2A12-Ins，并通过农杆菌介导的叶盘转化法分别导入烟草和番茄。用PCR对pCAM35S-Ins转基因烟草进行了鉴定，并用Western印迹实验对转基因烟草中胰岛素的表达及其与抗体结合活性进行了初步的鉴定。后续工作将致力于动物实验和功能分析。     

陆地棉GhSAD2基因表达载体的构建、转化及抗寒性初步分析

为研究Δ9-硬脂酰-ACP脱氢酶基因的功能及其与植物抗寒性的相关性,以陆地棉GhSAD2基因(KX197920)为目的基因,构建植物表达载体pBI121-GhSAD2,将该表达载体通过电击法导入根癌农杆菌GV3101中,采用根癌农杆菌介导的叶盘法转化烟草。通过PCR和GUS活性染色鉴定外源GhSAD2基因是否导入并整合到烟草基因组上转录表达。将转pBI121-GhSAD2型和野生型烟草置于4℃下处理48 h后,检测其电解质渗漏率并观察其表型。研究结果证明目的基因GhSAD2已整合到烟草及棉花的基因组中,共获得转基因植株9株,转化率为75%。陆地棉GhSAD2基因能够显著增强非低温驯化植物烟草的抗寒性,从而提高植物细胞的低温防御能力,为进一步探究该基因的功能鉴定了基础。     

棉花arf1启动子驱动Cry1A基因在烟草中特异性表达研究

在新一代Bt作物以及Bt作物安全性研究方面, Bt毒蛋白在植物特定发育阶段的表达特性渐受关注。本研究构建了植物表达载体pGBI121.A1Bt, 其携带棉花arf1启动子驱动Cry1A基因的表达盒, 启动子后面有一个Ω序列; 对照载体pGBI121.4AB携带P2E35S启动子(增强子加倍的修饰CaMV 35S启动子)驱动Cry1A基因的表达盒, 在启动子后面也有一个Ω序列。利用根癌农杆菌介导法, 将植物表达载体pGBI121.4AB和pGBI121.A1Bt转化烟草, 分别获得44株和42株转基因烟草再生植株。ELISA检测表明, 在pGBI121.A1Bt转基因烟草的蒴果、蒴果壳、花瓣和叶中Cry1A基因的平均表达水平分别为pGBI121.4AB的1.5、1.5、1.4和0.3倍。棉花arf1启动子在烟草中表达, 证明了该启动子在植物生殖器官中具有优势表达特性, 为arf1启动子应用于转基因抗虫棉, 在棉花蕾铃中优势表达Bt毒蛋白, 提高转基因棉花蕾铃抗虫性的新一代抗虫棉研究提供了依据。     

大豆CHI1基因启动子的克隆及功能初探

为了解大豆ClassⅠ几丁酶基因(Chitinase gene)对不同胁迫响应的分子机制。利用PCR技术克隆了大豆ClassⅠChitinase基因的启动子片段(Gm CHI1p),序列分析表明,扩增片段(1 641 bp)与Gen Bank中的已知序列同源性达99.8%,且含有多个胁迫响应调控元件。利用GUS基因上游无启动子的表达载体p CAMBIA1391Z,构建GmCHI1p与GUS基因融合的植物表达载体pCAM-Gm CHI1p,并通过农杆菌介导法导入烟草中。在转基因烟草愈伤组织中检测到GUS活性,表明该启动子具有启动活性。对转基因烟草中的GUS活性进行初步定性分析,结果表明,GmCHI1p可驱动GUS基因在转基因烟草的根部特异性表达,而且在伤害处理的叶片中检测到GUS的强烈表达,表现出明显的根组织特异性及伤害诱导性。这种伤害诱导仅在伤害组织部位及其附近高效表达而没有被长距离传递,预计该启动子在转基因抗虫分子育种中具有巨大的应用前景。     

家稗Pdk基因叶片特异性表达载体的构建及农杆菌的导入

【研究目的】构建含家稗Pdk基因的叶片特异性表达载体;【方法】通过PstI和SalI单酶切分别从质粒pRGN及pUCm-Pdk上获得Rubisco小亚基启动子和Pdk基因,将其连入表达载体pCAMBI1301, 并通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌EHA105;【结果】构建了由Rubisco小亚基启动子调控的Pdk基因植物表达载体p1301-Prbs-Pdk,选择标记基因为Hpt（潮霉素磷酸转移酶基因）,经酶切和PCR鉴定,表达载体已成功导入农杆菌EHA105中;【结论】丙酮酸磷酸双激酶（PPDK）是C4光合途径中的关键光合酶,本实验中构建了含有rbcs启动子的适于单子叶植物转化的Pdk基因表达载体,为提高转基因植物光合效率奠定了基础。     

Agrobacterium-mediated transformation of Japanese lawngrass (Zoysia japonica Steud.) containing a synthetic cryIA(b) gene from Bacillus thuringiensis

Transgenic Japanese lawngrass plants containing a synthetic cryIA(b) gene from Bacillus thuringiensis under the control of a maize ubiquitin promoter were developed by Agrobacterium -mediated transformation. A total of 1540 embryogenic calluses derived from dormancy-removal mature seeds were co-cultured with the disarmed strain EHA105 harbouring the binary vector pKUB. Three days after co-culture with EHA105 in the dark at 21°C, transient β -glucuronidase (GUS) expression frequency was 74.2%. After selection with 100 mg/l hygromycin B, a total of over 50 independent resistant cell clones and 25 regenerated plants were obtained. The integration and expression of the cryIA(b) gene into the genome was confirmed in 22 regenerated plants by the GUS histochemical assay, PCR amplification, Southern blotting and Western blotting analysis, with a transformation efficiency of 1.4%. The entire process from callus induction of mature seeds to production of transgenic plantlets was 80–100 days. T₁ progeny segregation analysis of these transgenic lines demonstrated that 59.1% of the transgenic events were inherited in a typical Mendelian fashion.     

转录因子基因ZmDREB3转化玉米的研究

利用玉米转录因子ZmDREB3基因(Gene ID:EU964828.1)构建了Ubiquitin启动子驱动的植物表达载体PGM0229-ZmDREB3-EP-SPS,以EPSPS基因为抗性筛选标记,通过花粉管通道法将农杆菌EHA105介导的植物表达载体转化到玉米自交系吉444、Mo17中,通过喷洒350mg/L草甘膦除草剂筛选,得到7株草甘膦抗性植株,用PCR检测得到2个同时整合EPSPS标记基因和ZmDREB3目的基因的转基因株系,用PCR-Southern进一步验证,结果呈阳性。以上结果证明外源基因已经被整合到玉米基因组中。     

INO启动子克隆及胚珠特异表达载体的构建

为了观察转基因植株胚珠特异性表达,采用CTAB法提取拟南芥基因组DNA,构建了35S::pCAMBIA1304-L117载体并对番茄进行遗传转化。根据已报道的INO启动子序列设计并合成一对特异引物,通过PCR对启动子进行扩增、连接并对其进行测序,结果表明：与GenBank中已注册的INO启动子序列的同源性为100%,并且构建了以INO代替CAMV35S启动子的pCAMBIA1304-L117植物表达载体,采用冷冻法将其转入根癌农杆菌EHA105。成功构建了35S::pCAMBIA1304-L117载体,并为进一步检测奠定了基础。     

苹果抗ASPV病毒RNAi载体构建及转化砧木M26的研究

为获得抗病毒的转基因植物新材料,采用同源重组法构建了抗苹果茎痘病毒的植物表达载体,并对苹果砧木材料M26进行了遗传转化,成功获得了转基因阳性植株。首先以感病的皇家嘎拉叶片为材料,反转录合成c DNA第一链,采用PCR方法克隆获得了489 bp的ASPV外壳蛋白基因的保守片段,通过TOPO克隆技术将该基因片段连接进入载体p ENTR/SD/D,构建了入门克隆载体p EN-ASPV,再通过LR反应置换该片段连接进入目标载体p Hellsgate12,构建了RNAi植物表达载体Phe-ASPV,并采用冻融法转入根癌农杆菌菌株EHA105中,获得了可用于植物遗传转化的工程菌EH-ASPV。采用农杆菌介导的方法转化苹果砧木M26叶盘,经抗生素筛选和脱菌培养获得了Kan抗性芽,进一步进行生根培养后获得了完整的Kan抗性植株,对生根植株提取总RNA后RT-PCR检测结果显示,RNAi表达载体上携带的外源基因片段(489 bp)已成功转入苹果砧木材料M26中,并在转基因植株内RNA水平上得到表达。获得的转基因新材料,为进一步通过病毒接种进行抗病性评价及抗病毒分子育种奠定了基础。     

番茄果实特异性启动子2A11的基因克隆及功能研究

采用巢式PCR技术从番茄基因组DNA克隆到长度1.3kp的果实特异性2A11启动子基因。序列分析表明,克隆到的基因序列2A11启动子转录起始位点上游的621bp处缺失了已报道的番茄2A11启动子基因（GenBank ID M87659,1993）序列中的“tatattgttaacttcttgttgaattaaagcaat”片段,其同源性为61%,登入GenBank,ID号为DQ453963;构建植物表达载体pCAMBIA2A11,用农杆菌介导侵染番茄果实,GUS基因瞬间表达结果表明,该2A11启动子基因具有驱动GUS基因在番茄果实中特异性表达的功能。研究结果表明成功地获得2A11果实特异性启动子基因,为下一步转基因番茄口服疫苗的研制奠定了一定的基础。     

拟南芥WUS基因的克隆及植物表达载体的构建与鉴定

克隆得到正确的拟南芥WUS基因,成功构建WUS基因组成型植物表达载体和WUS-EGFP融合基因诱导型植物表达载体,分别转化了根癌农杆菌EHA105,并用WUS基因组成型植物表达载体转化橡胶树愈伤组织,得到组织化学检测阳性的愈伤组织,为深入研究WUS基因生理生化功能做准备。用双酶切切下植物表达载体PBI121的35S-GUS片段,将其连接到pCAMBIA2301上成为中间植物表达载体pCAMBIA2301-35S-GUS。提取拟南芥总RNA,通过RT-PCR方法获得WUS基因,经过TA克隆连接到pEASY-T1载体上,再用双酶切切下WUS基因,将其取代pCAMBIA2301-35S-GUS中的GUS片段,形成pCAMBIA2301-35S-WUS植物表达载体。同时以质粒pCAMBIA2301-EGFP为模板,PCR获得EGFP,用重叠延伸PCR技术（gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR）获得WUS- EGFP融合基因,经双酶切将融合基因连接到诱导型植物表达载体pER8上,构成pER8-WUS-EGFP诱导型植物表达载体。通过电击转化法将这两个载体成功转入根癌农杆菌EHA105中,经过双酶切检测、PCR检测与测序分析,检测结果皆完全正确,克隆的WUS基因与WUS-EGFP融合基因序列和NCBI上公布的序列也完全一致,说明这两个植物表达载体已经构建成功。另外用pCAMBIA2301-35S-WUS植物表达载体遗传转化橡胶树易碎胚性愈伤组织,经GUS染色为蓝色,说明愈伤组织转化成功。     

草莓乙烯受体FaEtr2基因的克隆及其反义表达载体的构建

为了构建草莓乙烯受体FaEtr2基因的反义表达载体,在已报道的FaEtr2基因序列的基础上,设计特异引物,克隆草莓乙烯受体FaEtr2基因部分特异序列,将该片段反向插入植物表达载体pBI121的CaMV 35S启动子和NOS终止子之间,构建了反义表达载体pBI121Etr2。通过双酶切鉴定后,导入农杆菌EHA105中,酶切和PCR鉴定表明质粒已导入到农杆菌中。本研究为后期该反义基因转化草莓品种以改良草莓果实耐贮运性打下基础。     

PpDREB2基因植物表达载体的构建

以p3301-BI121质粒为基础,通过中间载体pGEX-KG,构建了由CaMV35S启动子调控的PpDREB2基因植物表达载体p3301-BI121-PpDREB2,选择标记为PPT(Phosphinothricin),通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌EHA105, 为通过根癌农杆菌介导法将PpDREB2基因导入植物奠定基础。