新城疫病毒河北分离株F基因的克隆及序列分析

参照GenBank中NDV的核酸序列设计一对引物,利用RT-PCR扩增,基因并得到长约1.7 kb的全基因片段,并将其构建到pMD.19T载体上.核苷酸序列测定结果表明:该基因片段全长1 662 bp,编码553个氨基酸,与GenBank下载的13株参考毒株,基因比较,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为97.2%～99.2%和96.9%～98.7%;但与IJasota、F48E9及Bl等常见疫苗株的氨基酸同源性仅为88.6%～91.5%.NDV分离株F蛋白裂解位点的氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F-I-G119,属于基因Ⅵ NDV.     

无花果ACC合成酶基因克隆及序列分析

为进一步利用基因工程手段调控无花果乙烯的合成,以无花果果肉为材料提取基因组DNA,根据已报道的无花果ACC合成酶基因序列设计引物,采用PCR技术扩增得到一条约600 bp的特异片段,将该片段克隆到pGM-Teasy vector上经PCR、酶切和测序鉴定。序列分析结果表明,基因全长590 bp,编码196个氨基酸,该序列与GenBank上已登陆的Masui Dauphine-ACS1的cDNA序列同源性达99%,氨基酸同源性达98%。结果表明,成功克隆到了无花果ACS基因片段。     

传染性喉气管炎病毒河南株ILTV-CG GX基因的克隆与序列分析

根据GenBank中收录的鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)GX基因核苷酸序列,设计并合成了1对引物,应用PCR技术扩增ILTV河南株(ILTV-CG)GX基因。将ILTV-CG接种10日龄鸡胚,提取ILTV基因组DNA进行PCR扩增。将回收的PCR产物与pGEM-T Easy载体进行连接,转化JM109感受态细胞,经蓝白斑筛选,对菌液PCR和酶切鉴定为阳性的菌株进行测序。测序结果表明,所克隆的GX基因全长为950 bp,含有一个开放阅读框,编码299个氨基酸的多肽。推导的氨基酸有4个潜在的N-糖基化位点,有11个与二硫键形成有关的半胱氨酸。序列分析表明,克隆的ILTV-CGGX基因与GenBank中发表的ILTV-SA2株GX基因核苷酸同源性为97.2%,变异点为第124位插入1个碱基G,第136位又插入2个碱基C,从而引起该毒株GX基因推导的氨基酸序列在第33位插入1个亮氨酸,还存在多处氨基酸发生变化,氨基酸同源性为95.3%。GX基因的成功克隆为构建ILTVGX基因缺失的病毒活载体奠定基础。     

鸡集落刺激因子(CSF)基因的克隆、序列分析及蛋白结构预测

根据GenBank中报道的红原锦鸡集落刺激因子(Colony-stimulating factor,CSF)cDNA序列,利用Primer Premier5.0软件设计一对特异性引物,对本地肉鸡注射100 μg/mL ConA试剂,饲养24 h后,取脾脏提取淋巴细胞总RNA,利用RT-PCR技术克隆集落刺激因子(CSF)的cDNA片段.对克隆片段进行测序,并利用DNAstar软件进行不同物种间同源性比较.序列分析表明,CSF的cDNA开放阅读框为435 bp,编码144个氨基酸,与红原锦鸡的序列比较,其核苷酸的同源性为98.4%,氨基酸的同源性为95.2%,同人、犬、印度野牛、野猪、绵羊和老鼠的CSF序列作比较,其核苷酸的同源性分别为28.7%,29.2%,33.6%,30.8%,29.4%和34.7%,氨基酸的同源性分别为8.3%,9.0%,15.3%,12.4%,11.0%和12.0%.然后利用DNAstar和DNAman软件,对鸡CSF的结构进行预测,结果表明,鸡CSF基因为一结构松散的蛋白分子.鸡的CSF基因被成功克隆,它存在着种属特异性.这为进一步研究该基因的生物学作用特别是利用CSF增强DNA疫苗的免疫效果奠定了基础.     

淮南猪IL-2全基因的克隆与遗传进化分析

参照GenBank发表的猪IL-2cDNA基因序列,设计l对引物,将河南地方品种淮南猪脾淋巴细胞在伴刀豆球蛋白A(Con A)的刺激下体外培养27 h后,提取激活淋巴细胞总RNA,进行反转录.聚合酶链反应(RT-PCR)扩增,克隆到pGEM-T Easy载体上并测序.测序结果显示,克隆的HuainanPIL-2 eDNA全长为516 bp,开放阅读框(ORF)包含465bp,编码154个氨基酸,分子量为17.4 kDa,等电点为5.27,疏水氨基酸38.3%,亲水氨基酸42.O%.碱件氨基酸11%,酸性氨基酸23%.此cDNA与已报道的猪IL-2同源性为100%,与猫、牛、鸡、狗、鸭、山羊、马、人、家鼠等的IL-2基因进行比较分析,核苷酸同源性分别为83.7%,82.6%,28.2%.80.6%,29.6%,83.4%,81.3%.82.O%,61.5%.     

辽宁绒山羊SRY基因编码区的分子特征研究

根据GenBank中山羊SRY基因序列设计一对引物,采用PCR在雄性辽宁绒山羊个体中扩增出了包含SRY基因整个编码区的特异片段,将特异PCR产物克隆到pMD18-T 载体中,转化DH5α菌,筛选出SRY基因的阳性克隆,进行了测序,将其序列与GenBank中部分偶蹄目动物的SRY基因序列进行同源性比较,用NJ法构建了系统进化树.结果表明,辽宁绒山羊SRY基因编码区长度为723 bp,共编码240个氨基酸,其中包含长度为231 bp 的HMG-box,位于编码区的第190至420位核苷酸之间,编码77个氨基酸(H64-A140).辽宁绒山羊SRY基因编码区序列与GenBank中山羊、绵羊、牛、牦牛、水牛、梅花鹿、麝香鹿及猪等偶蹄目动物的同源性分别为100%,97.09%,89.21%,89.21%,88.38%,87.55%,86.16%和68.04%;基于SRY基因编码区的核苷酸序列,构建的物种间系统树结果基本上与这些偶蹄目动物的传统系统分类相一致.     

萼脊兰Actin基因片段的克隆及序列分析

从萼脊兰叶片中克隆Actin基因,为研究其生理功能及其他基因在萼脊兰中的表达和调控奠定基础。根据GenBank中登录的植物肌动蛋白基因同源核苷酸保守序列设计简并引物,以萼脊兰叶片总RNA为模板,利用RT-PCR技术得到了3个Actin基因片段。序列分析结果表明,3个Actin基因片段长度均为1062 bp,编码354个氨基酸,具有Actin基因的功能位点;与其他植物同源序列进行分析表明,其核苷酸序列的同源性在80%以上,氨基酸序列的同源性在96%以上。本研究中得到的3个基因序列是Actin基因的同源片段,分别命名为SeACT1、SeACT2和SeACT3,并在GenBank注册,登录号分别为JN981138、JN981139和JN981140。     

黑曲霉木聚糖酶结构基因和5'调控区基因克隆及其分析

以黑曲霉(Aspergillus niger)A3的基因组DNA为模板,根据已报道的xynB基因序列设计简并引物,在合适的PCR反应条件下有效地扩增出了xynB的结构基因及其5＇调控区序列片段,并克隆到pBS-T载体上,序列测定表明,该目的片段全长1 611 bp.通过序列分析:结构基因部分长744 bp,其中含有一个66 bp的内含子和18个氨基酸的信号肽序列;xynB基因的cDNA序列大小为678 bp,编码225个氨基酸,与GenBank上检索的木聚糖酶基因的核苷酸序列同源性最高达98%,氨基酸序列同源性达99%.在翻译起始点上游92 bp和118 bp处找到转录起始位点和类"TATA"box的核心启动子区特征元件以及"CAAT"box,表明所克隆的调控区序列具有真核生物启动子特点,这为构建木聚糖酶高效表达载体,用于工业育种奠定了基础.     

鸡白细胞介素2的克隆及其序列分析

旨在从分子生物学角度进一步研究鸡免疫刺激因子白细胞介素2(IL-2),探究IL-2蛋白结构。根据GenBank发表的IL-2序列设计引物扩增IL-2基因,将其克隆到p GM-T载体后进行鉴定,鉴定正确的pT-IL-2重组质粒,然后对其进行序列分析。应用生物信息学软件对IL-2序列进行跨膜区、磷酸化位点、氨基酸序列、开放阅读框进行分析和IL-2蛋白的三级结构进行预测。核苷酸序列测定结果表明:IL-2基因片段为430 bp,编码143个氨基酸。生物信息学分析结果表明:本实验获得的IL-2基因编码的蛋白质中含有1个丝氨酸和3个苏氨酸,这可能成为蛋白激酶磷酸化的位点。IL-2蛋白可能在5~28位含有跨膜区。其蛋白二级、三级结构预测结果显示其属于亲水性蛋白,多为α-螺旋、β-转角和N端无规卷曲结构。该结果为IL-2的分子生物学探究奠定了基础。     

三黄鸡β-防御素基因片段的克隆与序列分析

根据GeneBank公布的鸡β-防御素序列设计一对特异性引物,运用RT-PCR技术从新郑三黄鸡肺脏组织中扩增其β-防御素基因并测序分析,结果表明,获得了195bp的cDNA目的片段,编码65个氨基酸;BLAST分析表明,该片段与GeneBank中已公布的鸡β-防御素Gal-9序列基因同源性达到98％。其与已公布的10个Gal-9序列进行同源性比较,并绘制系统发育进化树的结果显示,所测的防御素基因核苷酸同源性为91.8％～94.4％;进化树分析表明获得的目的基因与Gal-9基因处于同一进化分支。这为进一步研究Gal-9基因在地方品种鸡中的先天性免疫功能奠定了基础,也为研发具有广谱抗菌活性的新型肽类生物制品奠定了前期基础。     

小鼠睾丸Hsc70t基因的克隆与序列分析

摘要：为了获得小鼠睾丸Hsc70t基因的开放阅读框,根据GenBank中已发表的Hsc70t的基因序列设计了特异性引物（GenBank accession No:NM_013558）,提取睾丸中的总DNA,利用PCR方法扩增Hsc70t基因序列,连接到pMD18-T载体上,然后进行序列测定与序列分析。测序结果表明PCR扩增得到一条1926bp左右的基因片段。所测序列被GenBank 收录, 收录号为EU549780 ,与GenBank上公布的小鼠Hsc70t基因序列同源性达99.9%,与大鼠（Rattus norvegicus）、猕猴（Macaca mulatta）、黑猩猩（Pan troglodytes）、蟾蜍（Xenopus）、人类（Homo）和青鳉（Oryzias latipes）的相似性分别为94.4％、85.4％、84.9％、72.7％、71.9％、67.1％;进化树构建结果表明小鼠与大鼠距离最近。证实了Hsp70基因的高度保守性,并为Hsc70t的进一步研究和应用奠定了基础。     

猪圆环病毒Ⅱ型ZZ株ORF1基因的扩增测序与序列分析

合成一对猪Ⅱ型圆环病毒（PCV-2）ORF1基因特异性引物,对分离到的郑州分离株（ZZ株）猪圆环病毒PCV-2型的ORF1 基因进行了扩增,经测序后,将所测序列与已公布的35株PCV-2 ORF1序列进行同源性比较,并绘制系统发育进化树。结果显示,所测毒株间的ORF1基因核苷酸同源性为97.3～100％;进化树分析表明各分离毒株ORF1基因在进化上比较保守。同时对PCV-2 OFR1部分功能进行分析,发现该基因蛋白具有良好的抗原性     

风信子DFR基因全长cDNA的克隆及序列分析

以蓝色风信子完全露出蓝色的花蕾为材料,利用RT-PCR和RACE技术,获得风信子DFR基因的全长cDNA。该cDNA全长1252 bp ,开放阅读框为1098 bp ,编码366个氨基酸。 Blast搜索结果显示,风信子DFR基因核苷酸序列与其它植物已报道的DFR基因具有66 %～77 % 的相似性,氨基酸序列有62 %～73 %的相似性。聚类分析表明, 最先与风信子聚类合并的是鸢尾,其次与其它单子叶植物聚类,最后与双子叶植物聚类。     

马铃薯非特异性脂质转移蛋白基因StLTPa1的克隆和表达

非特异性脂质转移蛋白(nsLTP)是植物中大量存在的小分子脂类结合蛋白, 具有多种生物学功能, 如抗菌防御、信号传导、胞壁松弛、蛋白酶抑制等。通过接种青枯菌(Ralstonia solanacearum), 从马铃薯栽培品种中薯3号中获得一个新的非特异性脂质转移蛋白cDNA克隆StLTPa1, 序列分析表明该基因含636 bp核苷酸, 编码91个氨基酸, 属于I类非特异性脂质转移蛋白。基于氨基酸序列构建的系统发生树揭示, 该基因与其他茄科nsLTP具有高度保守的序列相似性, 核酸和氨基酸水平分别具75%~85%和60%~92%的同源性。对该基因在互作早期基因表达时空性分析表明, StLTPa1基因不仅受病菌的诱导, 在不同抗、感病的马铃薯基因型中差异表达, 而且受一定浓度外源非生物激发子如水杨酸、茉莉酸和脱落酸的诱导并产生一定时间的持续效应, 其诱导表达模式也表现出一定的差异。原位杂交结果显示StLTPa1主要在马铃薯茎、叶维管束系统的韧皮部细胞中表达。这些结果说明StLTPa1基因受病菌和非生物激发子诱导, 在植物防御反应中发挥作用。     

猪水泡病病毒RT-PCR检测方法的建立

根据基因库中的猪水泡病病毒（SVDV）高度保守的VP1基因的序列,设计了与SVDV互补的2对特异性引物,通过对影响PCR扩增因素的筛选,成功地扩增出251bp和366bp特异性条带,将其克隆入pMD18-T载体中,并进行序列测定,与已发表的SVDV基因比较发现,核苷酸的同源性为100%,证实为SVDV的VP1段基因。通过检测FMDV、VSV、BHK21细胞等,对照的扩增结果均为阴性,验证其特异。对SVDV RNA进行10倍系列稀释后检测,结果SVDV RNA在10-4稀释度时仍能检测到阳性,说明具有较好的敏感性。此项试验能稳定、高效、快速地检测出猪水泡病病毒。     

花生野生近缘种生物素羧基载体蛋白基因的克隆与结构分析

根据栽培花生鲁花14生物素羧基载体蛋白基因accB1和accB2 cDNA序列设计基因特异引物,克隆了花生野生近缘种Arachis duranensis、A.rigonii、A.batizocoi和A.hoehnei的accB1和accB2 cDNA 序列.序列分析表明,accB1和accB2在栽培花生和野生近缘种中高度保守,氨基酸序列一致性分别高于98.6%和97.5%. A基因组A.duranensis、A.rigonii和B 基因组A.batizocoi、A.hoehnei 的accB1和accB2的氨基酸序列存在差异,但与基因组来源无关.花生野生近缘种A.duranensis、A.rigonii、A.batizocoi和A.hoehnei accB2基因组序列分析表明,栽培花生和野生近缘种的accB2的基因结构相同. A基因组的A.duranensis与B 基因组的A.batizocoi和A.hoehnei的accB2 基因组DNA核苷酸序列一致性分别为98.9%,98.8%,而A 基因组的A.rigonii与A.duranensis、A.batizocoi和A.hoehnei 的序列一致性分别为93.5%,93.6%,93.4%.研究表明,生物素羧基载体蛋白基因在栽培花生及野生近缘种中非常保守.     

猪圆环病毒1型ORF2基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒1型(PCV1)ORF2基因序列,设计一对引物,应用PCR方法从PK-15细胞和疑似患断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的仔猪组织病料中分别扩增出PCV1ORF2全基因(702bp)。将此基因片段克隆入pMD18-T载体,筛选获得重组质粒pMD-PCV1-ORF2并对其测序,结果表明:所克隆的PK-15来源和组织病料来源的ORF2基因的同源性为99.4%,二者与Genbank上发表的PCV1ORF2基因的同源性介于97.3%～99.9%,与PCV2-ORF2基因同源性介于67.9%～68.4%,二者编码的蛋白在几个功能区域比较保守;抗原表位预测表明PCV1ORF2编码的蛋白具有良好的免疫原性。     

甘蓝自交不亲和信号传导中SRK底物ARC1蛋白编码序列的克隆与分析

以甘蓝自交不亲和系20010197的植株为材料，提取幼苗中的gDNA及花蕾期的柱头、子房、花瓣、叶片、根的mRNA，并对mRNA进行反转录合成cDNA，然后以gDNA与cDNA为模板扩增ARC1蛋白编码序列。结果表明只在gDNA与花期柱头mRNA的反转录cDNA中扩增出产物，而在其他组织中无任何产物。这可能说明甘蓝ARC1蛋白编码序列是在柱头特异性表     

虹鳟Hepcidin cDNA的克隆及序列分析

为了从虹鳟肝脏中扩增出Hepcidinc全长DNA序列,预测出氨基酸序列,并进行序列分析。通过RT-PCR和RACEPCR的方法,从虹鳟肝脏中克隆获得了Hepcidin全长cDNA序列,利用在线工具和软件包分析。结果表明:虹鳟Hepcidin全长cDNA序列(GenBank登录号HQ711993)为883bp,5’端非翻译区211bp,3’端非翻译区为405bp,以及一段267bp的编码序列,编码88个氨基酸,由信号肽(24个氨基酸)、原肽(39个氨基酸)和成熟肽(25个氨基酸)组成,成熟肽C端含有Hepcidin类抗菌肽的8个半胱氨酸保守性结构,可形成4个分子内二硫键。与已报道的鲑形目大西洋鲑Hepcidin氨基酸序列的一致性为93%,与其他鱼类Hepcidin氨基酸序列的一致性为44%~88%,是Hepcidin家族的新成员。     

聚合酶链式反应扩增甘蔗钙调蛋白基因及其序列分析

从甘蔗茎顶端分生组织提取点ＲＮＡ,反转录合成ｃＤＮＡ第一条链,以此为模板,参考大麦钙调蛋白基因序列设计并合成５端和３端引物,ＰＣＲ扩增甘蔗钙调蛋白基因,与克隆载体ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（＋）重组,转化Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１得到得组克隆。ＤＮＡ序列分析结果表明：甘蔗钙调蛋白基因同４５０个核甘酸组成,编码１４８个氨基酸;在核甘酸序列上与迄今知道的几种植物的钙调蛋白基因有很高的同源性,同源率在８０％以上,编码