农杆菌介导大豆子叶节转化cry1Iem基因

利用农杆菌介导法,以东北地区种植的9个大豆基因型和国外品种Williams82的子叶节为外植体,将抗虫基因cry1Iem转入栽培大豆品种中。共转化外植体1 459个,获得84棵再生植株。采用除草剂叶片涂抹法、PCR及Bar蛋白试纸条检测法对得到大豆再生植株进行鉴定,转cry1Iem基因大豆T_0阳性植株为61株。对部分T_1转基因植株的遗传分析表明,外源基因能够稳定遗传到下一代。通过对部分T_1阳性转基因植株进行Southern blot分析,证明目的基因片段均已整合到受体大豆的基因组DNA中,单拷贝率为22%左右。对获得的部分T_2材料进行了室内抗大豆食心虫鉴定,有2份转基因材料抗性较对照显著提高。     

抗虫基因cry1Ab13在大豆中的遗传转化及抗虫性鉴定

cry1Ab13基因是抗虫基因,编码的杀虫晶体蛋白对鳞翅目害虫具有一定的毒杀作用,构建了植物表达载体pCambia3300-35S-cry1Ab13,通过花粉管通道法将该载体转入大豆品种吉农28中,经PCR扩增检测得到15株T_1代阳性植株。Southern blotting分析显示有5株出现杂交信号,并以单拷贝形式整合到大豆基因组中。荧光定量PCR测定结果表明:cry1Ab13基因在转化植株的叶、茎秆中均有表达,每株表达量各不相同,在叶片部位表达量相对较高,最高为6.7,最低为2.5;在茎部表达量最高为0.76,最低为0.31。对T_1代阳性植株籽粒,采用圆盘分隔法接入大豆食心虫幼虫,进行初步抗虫试验,结果显示转化植株抗虫效果明显,但后代稳定性还需进一步研究。     

大豆炸荚基因GmAGL8的转基因鉴定与功能初探

炸荚是大豆的一种自然特征属性,是影响大豆产量的重要因素之一。本研究以前期获得的转大豆炸荚相关基因GmAGL8的T_1代植株为材料,继续繁育获得T_2和T_3代;采用PCR和RT-q PCR检测方法对转基因植株进行基因遗传稳定性和表达情况分析;并以野生型中黄10号为对照,对大豆炸荚性状进行了鉴定分析。结果表明:转基因植株阳性率T_1代为87.5%,T_2和T_3代均达到100%,说明GmAGL8基因已基本能够在转基因后代中稳定遗传。RT-q PCR检测结果显示,转基因植株中GmAGL8基因的相对表达量都明显高于非转基因植株,且各转基因植株之间表达量具有差异性。对T_1、T_2和T_3代植株炸荚率进行了统计,不同世代转基因大豆的平均炸荚率为9.09%,而非转基因大豆炸荚率为83.3%,转基因与非转基因大豆之间炸荚率存在显著差异。综上所述,GmAGL8基因已基本实现在大豆转基因后代中稳定遗传并正常表达,表型鉴定结果初步证明了GmAGL8基因与大豆炸荚性状相关。     

抗虫基因Cry8-like在大豆中的遗传转化及抗虫性初步鉴定

利用无缝克隆技术把抗虫基因Cry8-like重组到pCAMBIA3301载体上,成功构建了含有抗草铵膦筛选标记的植物表达载体pCAMBIA3301-RSP-Cry8-like-nos。将该载体通过农杆菌介导法转入两个受体大豆品种吉农28和吉农42中,经PCR检测,吉农28和吉农42分别获得了17株和13株T_1阳性植株,36株和25株T_2阳性植株。T_2转基因植株Southern杂交结果显示,目的基因以单拷贝的形式整合到大豆基因组中。荧光定量PCR检测结果表明,Cry8-like在转基因植株幼根得到了表达,而非转化受体对照未检测到荧光信号。室内抗暗黑鳃金龟幼虫鉴定结果表明,转基因植株提高了抗暗黑鳃金龟幼虫的能力。     

农杆菌介导法将Bt(cryⅠA)基因导入大豆的研究

构建含有Bt(cry Ⅰ A)基因的植物表达载体pCAMBIA3300-Bt,以大豆子叶节为受体,通过农杆菌介导法将Bt基因导人大豆品种黑农37中,获得转基因植株.并进行人豆的再生和遗传转化系统优化的研究,以获得较高的转化率.结果表明:在6-BA浓度为1.7 mg·L-1时,丛生芽分化率最高,确定该品种大豆在从生芽分化阶段的草铵膦筛选浓度为3.5 mg·L-1获得转化质粒pCAMBIA3300-Bt的转基因植株,其中T1代PCR阳性植株19株.采用real-time PCR的方法对T1代抗性植株进行Bt基因的转录水平的分析,初步证明Bt基因已整合到受体大豆的基因组内.     

利用双T-DNA载体系统培育无选择标记转基因大豆

利用PCR和Southern杂交检测了161株转△^6-脂肪酸脱氢酶基因（D6D）的T1代植株,初步筛选出只含有功能基因（D6D）而不含有筛选标记基因（bar）的转基因大豆植株9株,为获得富含γ-亚麻酸但不含选择标记基因的转基因大豆奠定了基础,并为转基因大豆的安全性种植提供了保障。同时对无标记基因的转基因植株进行了叶片涂抹除草剂验证,探讨了叶片涂抹除草剂结合目的基因PCR检测筛选无选择标记转基因植株的可行性。     

利用花粉管通道法将抗虫基因(cry V)转入大豆的研究

利用花粉管通道法,在大豆的盛花期将外源抗虫基因(cry V)转入到大豆中,转化成活率达43.88%,成荚率达33.6%.将收获的的种子种植在大豆所温室中,通过卡那霉素筛选、PCR鉴定,Southern-blot检测和RT-PCR检测,共检测出5株阳性植株,确定外源抗虫基因(cry V)已转入到大豆中,转化率达1.8‰.     

大豆高代抗虫转基因后代分子检测与抗蚜虫鉴定分析

采用PCR扩增对大豆抗虫转基因高代株系目的基因进行检测,并通过生物鉴定的方法检测转基因后代抗虫性.结果表明:在共转化的3个目标基因中,含有单基因植株共409株,双基因179株,三基因36株,占所检测植株总数的百分比分别为37.8%、17.0%和3.4%;含有单个pta基因的植株数量最多,为239株,占检测植株总数的22...     

根癌农杆菌介导大豆转Bt-cryIA抗虫基因

通过根癌农杆菌介导法,以子叶节为外植体将抗虫基因cryIA转入东农50大豆品种中,对获得的T₀、T₁和T₂代植株采用PCR、RT-PCR及Southern杂交法进行分子检测,并对转基因大豆进行食心虫室内抗性鉴定。经PCR鉴定,T₀植株有4株为阳性植株,T₁有3株为阳性植株,T₂有9株为阳性植株。对3株T₁ 阳性植株进行RT-PCR检测,均扩增得到1 800bp目标片段, Southern杂交分析显示,有2株出现杂交信号,分别为单拷贝和双拷贝。室内抗虫鉴定表明转基因植株食心虫抗性明显优于对照品种,在蛋白质及脂肪酸含量等品质性状上,与对照没有显著差异。证明cryIA基因已整合到受体大豆基因组中,该基因在大豆T₁转基因植株中能够正常转录,抗虫基因cryIA的导入可以提高东农50对大豆食心虫的抗性,其后代的遗传稳定性还有待于进一步的研究。       

RNA干扰高油GmPEPc基因转入大豆研究

通过构建GmPEPc基因的植物RNAi双元表达载体,并通过农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法将控制油脂和蛋白合成途径的相关基因GmPEPc转入受体品种沈农9号中,通过抑制大豆内源GmPEPc基因的表达,增加油脂积累,从而获得高油的转基因大豆新品种。在大豆组织培养过程中,共切取大豆外植体407块,获得T0代转化苗35株,转化率8.9%。通过对转基因后代中目的基因的整合及表达情况进行分子鉴定。获得23株T_1代转基因后代,其中高抗草丁膦除草剂(喷施浓度300 mg·mL~(-1))14株,通过PCR检测结果表明其中12株为PCR阳性;PCR和Southern杂交检测表明,GmPEPc基因已经成功插入到转基因大豆植株基因组DNA中。对T_1代测定结果显示,转基因大豆籽粒的平均含油量比对照高9.51%,平均蛋白质含量下降5.44%。这些研究结果为筛选高油脂含量的转基因大豆新株系提供了依据,为下一步高油新品种的选育提供了种质基础。     

八氢番茄红素合成酶基因(PSY)对大豆的遗传转化

以三个大豆品种的无菌苗子叶节为受体,以PSY为目的基因,应用根癌农杆菌介导法对大豆进行了遗传转化,经子叶节丛生芽诱导、茎伸长培养、生根培养和潮霉素选择培养,获得了完整的抗性再生苗,经PCR和PCR-Southern分析鉴定,初步证明外源基因PSY已整合到大豆的基因组中,并对影响遗传转化的因子进行了研究.     

一种简便大豆原位转基因方法研究

以萌发大豆幼苗顶芽为外植体,经纵切及农杆菌侵染后种植到大田中,转化植株用除草剂进行表型鉴定,存活植株进行PCR验证,并分析目的基因EPSPS在T2代转基因植株中的遗传情况;总计获得草铵膦涂抹表型鉴定阳性T0植株75株,草甘膦喷雾鉴定阳性T1植株65个,PCR测序阳性T1植株6个,PCR测序检测转化效率为0.14%;获得T2代PCR阳性植株52个,初步证明目的基因EPSPS能在子代中遗传;该方法能有效解决基因型依赖及再生植株困难等问题,缩短转化周期,为根癌农杆菌阶段的大豆遗传转化体系的优化与改良提供了参考。     

利用RNA干扰技术提高大豆脂肪含量

利用冻融法将大豆11S球蛋白GY1基因RNA干扰表达载体转入农杆菌EH105中,以大豆"吉农28"为受体,通过农杆菌介导的大豆子叶节转化法导入大豆,获得T1代转基因苗12株,并对得到的转基因植株进行分子生物学鉴定。PCR和Southern杂交检测表明,RNAi植物表达载体p3301-Gy1已成功插入到转基因大豆植株的基因组DNA中;RT-PCR和SDS-PAGE检测结果表明RNA干扰在转录后水平发挥了作用,11S球蛋白表达含量降低;利用BUCHI N-500型近红外谷物分析仪对转化的大豆蛋白质和脂肪含量进行检测,结果转化植株的籽粒蛋白质含量(36.07%)平均降低1.43个百分点,脂肪含量(21.28%)平均提高0.76个百分点。因此,利用RNA干扰技术提高大豆脂肪含量是可行的。     

大豆花粉管通道法转化lkt50基因

采用花粉管通道法,将外源基因lkt50向大豆品种东农48和品系东农96-02导入.通过卡那霉素筛选,从所获得的种子苗中初选转化植株,进一步进行PCR、Southern blot及RT-PCR分子生物学检测.结果表明:在14株卡那霉素抗性材料中利用nptII基因的特异性引物有7株PCR阳性,利用lkt50基因特异性引物有2株PCR阳性,并且2株Southern blot及RT-PCR检测均呈现阳性,因此认为花粉管通道法可以用于大豆的转基因研究和应用.     

基于不定芽原位诱导的大豆转基因方法

建立了一种新型农杆菌介导的大豆转基因方法(专利公开号:102181479A),以萌发大豆为外植体,最大限度地保持了大豆植株的完整性,在非无菌环境下进行转化,利用草丁膦筛选阳性植株。该方法不需要组织培养,脱离了传统组培的限制。对16个大豆基因型进行转化,经PCR、RT-PCR、qPCR和GUS染色鉴定转基因株系,平均转化率为23%。获得当代转基因植株接近实生苗,收获种子仅需3～4个月。该方法将有利于促进大豆基因功能研究和规模化转化。     

农杆菌介导法将Bt基因转入大豆的研究

以6个品种大豆体细胞胚为受体,以Bt基因为目的基因,应用根癌农杆茵介导法对大豆进行了遗传转化,经体细胞胚萌发、生根及壮苗培养和卡那霉素选择培养,获得了完整的抗性再生苗,经PCR、PCR-Southern和点杂交分析鉴定,初步证明外源基因Bt已整合到大豆的基因组中。     

基因枪对大豆进行PSY基因的转化研究

以3个大豆品种的体细胞胚为受体,以PSY为目的基因,应用基因枪法对大豆进行了遗传转化,实验结果表明:不同大豆基因型的体细胞胚对抗性选择标记(Hyg)的敏感性存在极显著差异;高渗处理的培养基加入0.4mol/L甘露醇有利于PSY基因的导入;对已获得10株抗性再生苗,经PCR和PCR-Southern分析鉴定,有4株为阳性,初步证明外源基因PSY已整合到大豆的基因组中.     

用基因枪法将Bt基因转入大豆的研究

以大豆品种合丰25的体细胞胚为受体,以Bt基因为目的基因,应用基因枪法进行了遗传转化,经体细胞胚萌发、生根及壮苗培养和卡那霉素选择培养,获得了完整的抗性再生苗,经PCR、PCR-Southern和点杂交分析鉴定,初步证明外源基因Bt已整合到大豆的基因组中.     

利用农杆菌介导合子胚转化法将Bar基因转入玉米自交系的研究

基于农杆菌介导的合子胚转化方法是一种具有自主知识产权的转基因新方法。利用该方法转化玉米合子胚,可直接获得转化种子。以东北春玉米区玉米自交系8902、Pa91、丹340作为转化受体,通过合子转化法进行抗草丁膦除草剂基因Bar的转基因研究。在获得的3 560份材料中,通过对T_1代种子苗叶面喷施草丁膦除草剂Basta,共获得153株抗性植株,抗性频率为4.3%。PCR鉴定阳性植株为102株,转化频率为2.87%。对PCR检测出的阳性植株进行自交获得T_2代,对材料继续进行抗性筛选,对抗除草剂表型的分离比率进行抗性遗传分析。