昆虫死亡素thanatin与斑点叉尾鮰β-防御素在毕赤酵母中的表达及其抑菌效果评价

旨在利用毕赤酵母表达系统表达出具有良好抑菌效果的重组抗菌肽。选定昆虫死亡素thanatin基因和斑点叉尾鮰β-防御素基因(命名为defbl),按毕赤酵母偏好性密码子优化后，将用T2A剪切肽连接的共表达基因(命名为TD)及各单基因分别构建至pMD19-T载体上，经EcoRⅠ、SalⅠ双酶切后亚克隆至表达载体pPICZɑA上，经SacⅠ线性化后电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，通过Zeocin抗性及PCR筛选出阳性菌株，利用1%甲醇进行诱导表达，72 h后收集培养基上清液，冻干浓缩并纯化后，进行Western blot检测及体外抑菌试验、溶血性试验。结果显示，成功构建重组毕赤酵母工程菌株GS115-pPICZαA-thanatin、GS115-pPICZαA-defbl和GS115-pPICZαA-TD,通过甲醇诱导成功获得重组蛋白，纯化后Western blot检测结果显示，thanatin组和defbl组分别在2.3 kDa和7.8 kDa处出现特异性条带，TD组同时出现上述2条带，蛋白大小均与预期相符；3个重组蛋白浓度分别为600、300和700μg/mL;体外抑菌试验及溶血性...     

土耳其斯坦东毕吸虫磷酸丙糖异构酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

利用RT-PCR技术从土耳其斯坦东毕吸虫（Orientobilharzia turkestanicum）成虫总RNA中扩增磷酸丙糖异构酶基因（TPI），鉴定后将目的片段与毕赤酵母表达载体pPIC9k连接，构建重组表达质粒pPIC9k-TPI，并将其电击转化到毕赤酵母GS115中，重组菌株经甲醇诱导后表达的TPI蛋白，经SDS-PAGE、Western-blotting检测，并利用葡聚糖凝胶层析柱纯化。结果显示，成功地克隆了土耳其斯坦东毕吸虫TPI；重组毕赤酵母表达了分子质量为43ku的TPI蛋白；葡聚糖凝胶层析过滤得到单一的TPI蛋白。     

禽腺病毒血清4型和8b型串联截短Fiber2-Fiber蛋白在毕赤酵母中的优化表达

【目的】在毕赤酵母中构建禽腺病毒(FAdV)血清4型和8b型串联截短Fiber2-Fiber蛋白表达系统,并探索适宜的表达条件。【方法】以前期构建的重组质粒pCold-Fiber2-Fiber为模板,用PCR法扩增Fiber2-Fiber片段,连接pPICZαA载体。经双酶切和测序鉴定后的阳性重组质粒pPICZαA-Fiber2-Fiber电转化毕赤酵母GS115。经MD平板和不同浓度Zeocin抗性筛选后进行PCR扩增和测序鉴定得到阳性菌株;用甲醇诱导表达阳性菌株,72 h后收集蛋白上清进行SDS-PAGE和液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)鉴定。采用单因素变量法对不同pH(5.0、6.0、7.0和8.0)、甲醇浓度(0.5%、1.0%、1.5%和2.0%)、时间(24、48、72和96 h)进行表达条件优化,用SDS-PAGE鉴定,并用间接ELISA和Western blotting验证重组蛋白的反应原性。【结果】成功构建了重组质粒pPICZαA-Fiber2-Fiber,对表达72 h后的上清进行SDS-PAGE发现1条约70 ku的特异条带,经LC-MS/MS鉴定为目的蛋白。...     

柞蚕溶菌酶真核表达系统的构建及重组蛋白纯化分析

利用甲醇营养型毕赤酵母对柞蚕溶菌酶进行高效重组表达。首先根据毕赤酵母密码子偏爱性对柞蚕溶菌酶成熟肽基因进行密码子优化,将优化后的基因序列ApLyz克隆至毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA中,构建重组表达载体pPICZαA-ApLyz。重组载体经电转化整合入毕赤酵母菌株GS115基因组中,并利用高质量浓度Zeocin(500μg/mL)抗性平板筛选得到高拷贝转化子。摇瓶发酵显示,甲醇诱导72 h后,高拷贝菌株发酵液中溶菌酶活性为450 U/mL(313 U/mg总蛋白),酶活约为单拷贝菌株的3.1倍。纯化后的重组柞蚕溶菌酶分子质量约14 kDa,酶活为3 870 U/mL,比酶活为20 262 U/mg。酶学性质分析显示,重组柞蚕溶菌酶的最适反应温度为40℃,最适反应pH为4.5,具有较好的热稳定性。     

鹅源副黏病毒融合蛋白在毕赤酵母细胞中的表达

应用特异性引物,从鹅源副黏病毒NA-1株中扩增出F蛋白基因,PCR产物纯化后克隆入pGEM-T载体,得到重组质粒pT-F。用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切pT-F,回收目的基因F片段,并将其定向克隆到pPICZαA中,构建重组质粒pPICZαA-F。用PmeⅠ酶切pPICZαA-F使其线性化,电击转化至感受态毕赤酵母GS115菌中。PCR法鉴定阳性重组子,10 mL/L甲醇诱导表达后,进行SDS-PAGE及Westernblot分析。结果表明,在酵母菌培养基上清中检测到相对分子质量为63 ku的重组蛋白,该重组蛋白可与NA-1株鹅源副黏病毒多克隆抗体发生特异性血清学反应。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒R98弱毒株的分离鉴定与ORFs3～7基因特性研究

应用特异性引物从猪血凝性脑脊髓炎病毒（HEV）中扩增出S1蛋白基因,PCR产物纯化后克隆入pGEM-T载体中,得到重组质粒pTS1。用EcoRI和Not I双酶切pTS1,回收目的基因S1片段将其定向克隆到pPICZαA中,构建重组质粒pPICZαAS1。用BstXI酶切pPICZαAS1使其线性化,并电转至感受态毕赤酵母细胞GS115。PCR法鉴定阳性重组子,用1%甲醇诱导表达后,进行SDS-PAGE及Western blot分析。结果显示,在酵母菌培养基上清中检测到相对分子质量为73000的重组蛋白,且该重组蛋白可与HEV多克隆抗体发生特异性血清学反应,表明HEV的S1蛋白片段在毕赤酵母中获得成功表达。     

猪血凝性脑脊髓炎病毒S1蛋白基因在毕赤酵母中的表达

应用特异性引物从猪血凝性脑脊髓炎病毒（HEV）中扩增出S1蛋白基因,PCR产物纯化后克隆入pGEM-T载体中,得到重组质粒pTS1。用Ec0R I和Not I双酶切pTS1,回收目的基因S1片段将其定向克隆到pPICZαA中,构建重组质粒pPICZαASI。用BstX I酶切pPICZαAS1使其线性化,并电转至感受态毕赤酵母细胞GS115。PCR法鉴定阳性重组子,用1％甲醇诱导表达后,进行SDS-PAGE及Western blot分析。结果显示,在酵母菌培养基上清中检测到相对分子质量为73000的重组蛋白,且该重组蛋白可与HEV多克隆抗体发生特异性血清学反应,表明HEV的S1蛋白片段在毕赤酵母中获得成功表达。     

印第安纳型水泡性口炎病毒核衣壳蛋白基因在毕赤酵母表达系统中的表达

将含有IN型VSV核衣壳蛋白基因的重组质粒pET-32a/N用EcoRI和NotI进行双酶切,目的基因克隆到表达载体pPICZαA,构建重组质粒pPICZαA/N。用SacI酶切线性化,并以电转化方法转化受体酵母菌GS115,PCR证实目的基因整合到重组酵母菌染色体中,经鉴定所获得的重组酵母菌株为Muts表型。用甲醇对重组酵母进行诱导表达,经SDS-PAGE和Westernblot鉴定,核衣壳蛋白基因在毕赤酵母中获得表达,目的蛋白分子量大小为约75kDa,表达量约占菌体总量的20%,并能够被VSV阳性血清所识别,可用于VSV的血清学检测。     

鸡β-防御素-3在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性测定

采用RT-PCR方法从鸡外周血淋巴细胞中扩增鸡β-防御素-3成熟肽基因,将其克隆到酵母表达载体pPICZα-A的分泌信号肽基因下游.线性化后的重组质粒电击转化毕赤酵母宿主菌GS115,经抗生素Zeocin筛选和PCR鉴定后,得到重组酵母菌.阳性转化菌经甲醇诱导后,SDS-PAGE和western blot鉴定结果表明,在毕赤酵母中得到分泌性表达产物,分子量约为8.9 ku,活性检测表明其具有显著的抑菌活性.     

牛脂联素基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

应用RT-PCR方法扩增牛脂联素(Bovine adiponectin,BovADPN)基因,连接到载体pMD18-T中;测序并利用BLAST工具对比证明该基因序列正确,经EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切,回收目的基因片段,并将其定向克隆到pPICZαA载体中,构建重组质粒pPICZαA-BovADPN.用Sac Ⅰ酶切使其线性化,以化学方法(LiCl)转化入感受态毕赤酵母细胞GS115;重组子经高质量浓度Zeocin(1 000 mg/L)筛选、MDH/MMH平板筛选、PCR鉴定后,用1%甲醇诱导表达,SDS-PAGE及Western-blot分析.结果表明,所获得的酵母重组子能够分泌表达出相对分子质量为40 000的重组蛋白.     

猪带绦虫TS018基因真核表达载体的构建及其表达

采用PCR从重组克隆载体pGEM—TSO18中扩增出猪带绦虫六钩蚴TSO18基因，与毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9k相连接，构建重组表达载体pPIC9k—TSO18，转化大肠埃希氏菌JM109，经测序证实，基因序列完全正确。制备重组质粒pPIC9k—TSO18，用SalⅠ线性化，并电转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，使重组表达载体与酵母染色体发生同源整合。采用G418抗性梯度法筛选得到高拷贝重组菌株，以甲醇进行诱导表达，SDS—PAGE和Western-blotting分析结果表明，诱导表达的培养上清中表达出具有反应活性的16ku重组蛋白，目的蛋白约占培养上清液中蛋白总量的80％以上，诱导72h目的蛋白表达量为0．5mg／mL。     

NA-1株鹅源副黏病毒表面结构蛋白HN的真核表达

应用特异性引物,从鹅源副黏病毒NA-1株中扩增出HN蛋白基因,PCR产物纯化后克隆入pGEM-T载体,得到重组质粒pTHN。用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切pTHN,回收目的基因HN片段并将其定向克隆到pPICZαA中,构建重组质粒pPICZαAHN。用SacⅠ酶切pPICZαAHN使其线性化,并电击转化至感受态毕赤酵母细胞GS115。PCR法鉴定阳性重组子,用1%甲醇诱导表达后,进行SDS-PAGE及Western-blot分析。结果在酵母菌培养基上清中检测到相对分子质量为63000的重组蛋白,且该重组蛋白可与NA-1株病毒多克隆抗体发生特异性血清学反应,表明NA-1的HN蛋白片段在Pichiapastoris中获得成功表达。     

惠阳胡须鸡IFN-α基因的克隆表达和重组蛋白的抗病毒活性圆二色性分析

IFN-α是一种具有很强抗病毒活性的细胞因子.从惠阳胡须鸡肝脏克隆了IFN-α基因,为新的亚型.将IFN-α成熟肽与毕赤酵母pPICZαA连接,经酶切鉴定、PCR鉴定和测序后确定目的基因无突变并且插入方向正确,将重组质粒转化到GS115中,阳性转化子经甲醇诱导表达,获得了高效分泌表达,重组IFN-α分子量约为35 kD,表达量达到了0.307 mg/ml,在CEF/VSV细胞系上的抗病毒活性为3.2×106 U/mg.圆二色实验结果表明IFN-α重组蛋白中含有53.2% α螺旋、3.1% β折叠、10.6%转角和33.1%无规谱卷曲,属于全α型蛋白.结果表明,采用毕赤酵母分泌表达了有活性的鸡IFN-α,并首次证实鸡IFN-α属于全α型蛋白.     

重组猪干扰素α6在毕赤酵母中表达及其活性研究

为获得稳定表达重组猪α6干扰素的毕赤酵母。人工合成Po IFN-α6基因片段,连接至pPICZαA质粒,构建PoIFN-α6毕赤酵母表达质粒pPICZαA-PoIFNα6;经Sac I酶线性化后转化至毕赤酵母X33感受态细胞,筛选阳性克隆;优化毕赤酵母表达条件,并对表达产物进行了体外抗病毒活性测定。结果表明,成功构建了表达重组猪α6干扰素的毕赤酵母,以1%甲醇诱导72 h后,菌体上清SDS-PAGE可见20 kDa左右目的条带,Western blot检测为阳性;表达的重组猪干扰素α活性在PRRSV/Marc-145、VSV/MDBK、PRV/Vero、PEDV/Vero、PPV/PK-15、PCV2/PK-15和TGEV/PK-15系统中均具有良好的抗病毒活性。说明PoIFN-α6在细胞上清中表达成功,并且在不同宿主细胞中均有抗病毒活性。     

β-1,3-1,4葡聚糖酶基因双拷贝工程菌株的构建与发酵研究

本试验旨在研究β-1,3-1,4葡聚糖酶双拷贝基因毕赤酵母工程菌株的构建及发酵。首先,通过对质粒pGAP-glu-opt进行PCR扩增获得密码子优化的β-1,3-1,4葡聚糖酶基因glu-opt,用EcoR I和Not I双酶切后与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,获得重组质粒p9K-glu-opt。该重组质粒经Sac I线性化后转化毕赤酵母GS115菌株,利用不含组氨酸的MDS平板和摇瓶培养,筛选重组菌株,命名为GS115/9K-glu-opt。制备GS115/9K-glu-opt感受态细胞,再用线性化的重组质粒pPIC-glu-opt二次转化,在含有抗生素Zeocin的YPDS平板上筛选glu-opt基因双拷贝重组菌株GS115/2xglu-opt。双拷贝重组菌在10 L发酵罐中进行高密度发酵培养及甲醇诱导表达,β-1,3-1,4葡聚糖酶最高酶活达到21 600 U/mL,约为单拷贝工程菌株X33/pPIC-glu-opt发酵活力的1.44倍;蛋白表达量达8.4 g/L,约为X33/pPIC-glu-opt的1.68倍。     

鸡IL-18酵母表达载体的构建及表达条件的优化

应用PCR技术从含有罗曼鸡白介素18全长基因质粒pMD18-T-ChIL-18中扩增出鸡IL-18成熟肽基因,亚克隆于毕赤酵母表达载体pPICZαA上,构建了重组质粒pPICZαA-ChIL-18。经酶切、PCR和测序鉴定正确后,电转化入毕赤酵母菌X-33,筛选多拷贝单克隆进行诱导表达,并进一步分析了培养液pH值、诱导剂浓度、诱导时间和诱导温度对重组菌表达水平的影响,从而获得最优化的表达条件。结果表明,重组毕赤酵母菌能够表达鸡IL-18,且在培养液pH6.0,甲醇诱导浓度1.5%,诱导温度26℃的条件下诱导96 h,目的蛋白的表达量最高,可占菌体总蛋白的60.2%。本文为鸡IL-18的规模化发酵生产奠定了基础。     

重组人溶菌酶在毕赤酵母中的诱导表达及活性研究

为了构建一种胞内表达人溶菌酶(hLZ)的毕赤酵母工程菌,此研究以人工合成人溶菌酶基因序列,通过酶切位点插入毕赤酵母表达载体pPICZαA,获得pPICZαA-hLZ。线性化该表达载体,电转化并筛选阳性克隆,甲醇诱导重组蛋白表达后,进行纯化和活性分析。结果表明,通过亲和层析树脂(Ni-IDA)从培养液上清纯化目标蛋白,SDS-PAGE表明目标蛋白为14.7 kDa左右,Western-blot结果表明目标蛋白即为带有6个His标签的重组人溶菌酶,BCA法测定表明纯化后的蛋白浓度为0.121 mg/mL;溶壁微球菌抑菌试验表明该重组人溶菌酶具有部分生物活性。此研究成功地获得了胞内表达且具有部分生物活性的人溶菌酶毕赤酵母工程菌,为重组人溶菌酶作为饲料添加剂开发应用奠定了一定的基础。     

重组犬α6干扰素的酵母表达及其抗病毒活性评价

试验旨在构建犬α6干扰素毕赤酵母表达系统,并对其进行优化和筛选,以期获得高活性的重组犬α6干扰素(CaIFN-α6)。根据CaIFN-α6基因序列,按毕赤酵母菌密码子偏好性对CaIFN-α6全基因序列进行优化与合成,用XhoⅠ和NotⅠ双酶切将其连接至载体pPICZαA中,构建pPICZαA-CaIFN-α6重组表达质粒,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。提取质粒pPICZαA-CaIFN-α6并线性化,电转入酵母感受态细胞X33中制备重组菌。采用甲醇进行诱导表达,收集上清,超滤浓缩,最终获得纯化的重组CaIFN-α6。利用BCA法测得纯化后的CaIFN-α6蛋白浓度为1.5 mg/mL,Western blotting分析表明CaIFN-α6蛋白具有良好的反应原性,SDS-PAGE显示其纯度约在95%以上,MDCK/VSV法检测其效价为2.37×10~7 IU/mL,比活性为1.58×10~7 IU/mg。结果表明犬α6干扰素在毕赤酵母pPICZαA表达载体系统中成功表达,且具有较高的生物活性,为后期的犬病毒病的临床预防与治疗提供了良好的支撑。     

重组山羊FSH基因在毕赤酵母中的高效表达

为探讨快速高效表达山羊FSH（促卵泡素）基因的方法,将获得的FSHα,β亚基基因克隆到毕赤酵母快速表达载体pPICZαA中,然后将构建的载体线性化处理后,电击转化至毕赤酵母GS115中,经Zeocin抗生素筛选后获得阳性菌落,经甲醇诱导表达后进行SDS-PAGE和Western–blot分析。结果表明：pPICZαA载...     

鸡抗病毒Mx蛋白基因在毕赤酵母GS115中的表达

为了利用酵母表达技术制备鸡抗病毒Mx蛋白,试验采用基因工程技术,将编码鸡抗病毒Mx蛋白基因亚克隆至含有分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体中,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-Mx;用电转化法将线性化的pPIC9K-Mx转化至毕赤酵母菌株GS115中,G418梯度筛选转化菌;再经MM与MD平板对比生长试验筛选,PCR鉴定目的片段,筛选出高拷贝重组子,该高拷贝菌株分别经0.5%、1%甲醇诱导,表达产物再经SDS-PAGE检测。结果表明:成功构建了鸡抗病毒Mx蛋白基因的毕赤酵母表达载体,经G418抗性筛选得到高拷贝菌株;在甲醇含量维持在1%时,鸡抗病毒Mx蛋白在毕赤酵母GS115中获得良好表达,表达产物大小约为75ku;表达蛋白约占表达上清液的39.2%。