牦牛谷胱甘肽过氧化酶1基因(GPX1)的克隆及系统发育分析

本研究克隆了牦牛谷胱甘肽过氧化酶1GPX1基因的CDS区序列,分析了其核苷酸序列,并进行了系统发育分析.结果表明,牦牛GPX1基因CDS区全长618 bp,编码205个氨基酸;经与GenBank中其他物种GPX1基因CDS区比对,牦牛GPX1基因CDS区与普通牛和瘤牛完全一致,与水牛、绵羊和猪的序列一致性较高,与其他哺...     

水牛TRAIL基因克隆及生物信息学分析

【目的】对水牛肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)相关凋亡诱导配体(TNF-related apotosis-inducing ligand,TRAIL)基因CDS序列进行克隆及序列分析,并对其编码的蛋白进行生物信息学分析,为后期TRAIL蛋白调控水牛卵巢卵泡发育、颗粒细胞增殖及凋亡的研究奠定基础。【方法】利用RT-PCR方法克隆水牛TRAIL基因CDS序列,对所获序列进行核苷酸序列、氨基酸序列相似性比对,构建系统进化树,并通过生物信息学软件分析TRAIL基因编码蛋白的结构和功能。【结果】试验成功克隆水牛TRAIL基因CDS序列,长864 bp,编码287个氨基酸;水牛TRAIL基因与牦牛、普通牛、山羊、绵羊、野猪、马、人、黑猩猩和家鼠的核苷酸序列相似性分别为99.2%、99.3%、95.9%、96.3%、84.7%、84.8%、81.3%、81.3%和70.0%。系统进化树结果表明,水牛与牦牛、普通牛的亲缘关系最近,与家鼠亲缘关系最远。氨基酸序列比对结果表明,在不同物种间,其跨膜结构域和TNF结构域序列保守性较高。TRAIL蛋白属于亲水性蛋白,存在1个跨膜结构域,140―285位氨基酸处为TNF区,具有29个磷酸化位点,无信号肽和糖基化位点,主要定位于细胞质中。TRAIL蛋白二级结构主要以无规则卷曲为主,约占51.57%,其次为延伸链(24.39%)和α-螺旋(24.04%)。TRAIL蛋白三级结构与二级结构一致,且与模型蛋白人TRAIL蛋白的相似性为75.53%。【结论】本试验克隆得到水牛TRAIL基因CDS区序列,大小为864 bp,编码287个氨基酸,水牛与牦牛、普通牛亲缘关系最近,TRAIL蛋白跨膜结构域和TNF结构域在不同物种间序列保守性较高,这可能与其功能有关。     

GSTM3基因在牦牛和犏牛睾丸及附睾组织中的表达研究

谷胱甘肽S-转移酶Mu 3(GSTM3）是一种必需的抗氧化酶,其在精子中的存在与精子的耐冷性、质量和生育能力有关。为研究GSTM3的表达与雄性牦牛繁殖功能的关系,本研究对牦牛附睾GSTM3基因进行克隆、生物信息学分析,并应用实时荧光定量PCR分析GSTM3基因在牦牛和犏牛附睾以及睾丸组织中的表达情况。结果表明,牦牛GSTM3基因CDS区序列长度为678 bp,编码225个氨基酸;GSTM3基因编码蛋白为弱酸性且不具有跨膜结构,分子式为C1204H1857N319O340S19,分子量和等电点分别为26.85 ku和7.29;牦牛GSTM3核苷酸序列与普通牛和瘤牛有较高的种间同源性,分别为99.26%和98.53%;GSTM3基因在牦牛和犏牛附睾以及睾丸组织中均有不同程度的表达,牦牛附睾和睾丸的GSTM3表达量显著高于犏牛。     

牦牛CAPS基因克隆及生物信息学分析

钙磷蛋白(calcyphosine, CAPS)是一种钙结合蛋白,对维护生物体内钙磷平衡起着重要作用。本研究克隆了牦牛CAPS基因的CDS区序列,分析了其核苷酸序列,并进行了生物信息学分析。结果表明,牦牛CAPS基因CDS区全长570 bp,编码189个氨基酸;编码蛋白的分子式为C₉₀₅H₁₄₃₄N₂₆₆O₂₉₇S₈,分子量为21 049.43 Da,理论等电点为4.69,脂溶指数为75.29,不稳定指数为37.52,是疏水性稳定蛋白;系统进化分析表明,牦牛CAPS基因CDS区与普通牛和瘤牛的基本一致,与水牛、绵羊和猪的序列一致性较高。本研究为深入研究牦牛CAPS的生理功能提供了参考资料。     

大额牛HSL基因外显子Ⅰ部分片段的序列测定及分析

对大额牛HSL基因外显子Ⅰ部分序列进行PCR扩增、测序及氨基酸预测,并同其它牛种的资料进行了比对分析,构建了分子系统进化树。结果表明:大额牛其核苷酸序列与牦牛、普通牛、瘤牛、水牛间的同源性分别为99.6%、99.4%、99.2%、97.0%。相应的氨基酸序列大额牛与水牛的同源性为97.6%;与普通牛、瘤牛、牦牛的同源性均为99.4%,仅在第33位有1个氨基酸变异,即大额牛为异亮氨酸,而其它3个牛种均为缬氨酸,这是由该基因片段的第97位碱基发生转换(A←→G)造成的。从分子系统进化树看,瘤牛和普通牛先聚为一类,再依次与牦牛、大额牛、水牛相聚,这与传统的牛种分类结果一致。     

IFITM1基因克隆及其在不同生长阶段牦牛各组织中的表达分析

为鉴定牦牛IFITM1基因并分析其在不同生长阶段牦牛5种组织中的转录水平和蛋白表达量.本研究采用根据普通牛IFITM1基因设计的引物,PCR扩增牦牛IFITM1基因并利用生物信息学软件分析其序列,结果显示,获得牦牛546 bp的IFITM1基因cDNA序列,其中编码(CDS)区为375 bp,编码124个氨基酸残基.牦...     

水牛转录因子Sox2和Lin28克隆与表达研究

本研究克隆水牛特异性转录因子Sox2和Lin28,构建表达载体,为进一步研究2个基因在水牛干细胞多能性调控中的作用奠定基础。以胎牛生殖嵴总RNA为模版,采用RT-PCR扩增Sox2和Lin28的编码区序列(CDS),构建逆转录表达载体pMSCV-Sox2和pMSCV-Lin28,转入NIH3T3细胞,鉴定其表达情况。结果表明:水牛Sox2和Lin28的CDS全长分别为966 bp和618 bp,蛋白结构保守;Sox2、Lin28氨基酸序列与牛、猪、人和鼠相应氨基酸序列的相似性分别为96%、95%、94%、94%和98%、97%、89%和91%;pMSCV介导的Sox2和Lin28能在NIH3T3细胞中表达。     

类乌齐牦牛UCP3基因克隆与序列分析

利用RT-PCR方法成功克隆UCP3基因,对其核苷酸序列及氨基酸序列进行生物学在线分析。结果表明,类乌齐牦牛UCP3基因CDS区序列长为936bp,A、G、C和T平均含量分别为20.83%、28.63%、31.09%和19.44%;与普通牛UCP3基因CDS区序列一致性高达99%;共发现碱基突变位点6个,其中同义突变4个,反义突变2个。UCP3基因共编码311个氨基酸,分子质量为34.18ku,理论等电位点9.53;其主要分布在线粒体内膜上,为非分泌蛋白;具有α-螺旋、无规则卷曲、延伸链、β-转角等结构。由系统进化树可知,类乌齐牦牛与野牦牛最接近,与普通牛次之。     

中国南方黄牛生长激素基因遗传分化的研究

对雷琼瘤牛18个个体生长激素(GH)基因外显子序列654bp进行分析,发现3个变异位点,定义了5种单倍型;引用巴州牦牛2个个体GH基因同源区序列并结合GenBank中牛属普通牛、其他瘤牛和牦牛3个种群与水牛1个远缘种GH基因外显子序列,分别采用邻接(NJ)法和最大简约(MP)法构建分子系统发育树,得到基本一致的拓扑结构。结果显示,GH基因的分化早于雷琼瘤牛、其他瘤牛、普通牛、牦牛和水牛的分化,瘤牛物种内存在多型现象,GH基因外显子区有着较高的突变率。     

牦牛SLC25A31基因的CDS序列及其表达蛋白生物信息学分析

为了研究牦牛ANT4在脑组织中的表达情况,试验通过RT-PCR技术克隆牦牛SLC25A31基因的cDNA序列,并利用DNAMAN、MAGA4、SWISS-MODEL、ExPASy等生物信息学软件系统对其进行分析。结果表明:扩增出的牦牛SLC25A31基因的编码区长972 bp,编码323个氨基酸;与普通牛、鼠和人相应基因核苷酸序列进行比对,序列一致性分别为99.28%、84.88%和89.81%;其编码蛋白分子质量为35.695 ku,含多个修饰位点。说明SLC25A31基因的CDS序列及其表达蛋白的结构在高原牦牛与普通牛间并无明显差异,保守性极强;并且通常在睾丸中表达的ANT4在高原牦牛脑组织中也能表达。     

类乌齐牦牛SIRT3基因克隆与生物信息学及差异表达分析

本实验旨在丰富牦牛 SIRT3基因的基础研究,通过对西藏类乌齐牦牛 SIRT3基因克隆、生物信息学分析及差异表达分析,进一步探讨 SIRT3基因的生理功能及分子机制。结果表明:类乌齐牦牛 SIRT3基因CDS区长 1 002 bp,编码 333个氨基酸,与普通牛 SIRT3基因 CDS区比对存在碱基突变,编码氨基酸发生错义和同义突变,同义突变发生在碱基第 49、279、342、384 位,错义突变发生在碱基第 149 和 620 位,其编码蛋白属亲水性蛋白,有多个跨膜区域和磷酸化位点,无信号肽片段,主要位于线粒体,二级结构以无规卷曲和α-螺旋为主;SIRT3基因编码蛋白在催化活性、核苷酸结合及辅因子结合等过程发挥主要功能,主要参与生物体代谢过程;类乌齐牦牛 SIRT3基因序列与普通牛一致性较高,亲缘关系最近;QPCR分析显示,SIRT3基因在牦牛肝脏中的表达水平极显著高于其他组织(P<0.01)。     

牦牛SMPX基因CDS区克隆及组织表达分析

本研究旨在克隆牦牛X染色体相关小肌肉蛋白(small muscle protein X-link,SMPX)基因的CDS区序列,分析该序列所编码蛋白的结构与功能,并检测SMPX基因在牦牛不同组织中的表达情况。运用RT-PCR技术扩增并克隆SMPX基因CDS区序列,分析其氨基酸序列相似性并构建系统进化树;通过在线软件对其理化性质、二级结构和三级结构进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR方法检测SMPX基因在牦牛右心室、臀大肌、肺脏和大脑4个组织中的表达情况。结果表明,牦牛SMPX基因CDS区全长515 bp,开放阅读框(ORF)长261 bp,编码86个氨基酸。牦牛SMPX氨基酸序列与野牦牛、水牛、家犬、人、白尾鹿德克萨斯亚种、绵羊、黑猩猩、藏羚羊、野猪的相似性分别为100%、97.7%、96.5%、96.5%、95.3%、95.3%、96.5%、94.2%和91.9%,说明其在不同物种间具有较高的保守性。生物信息学分析发现,SMPX蛋白是一种不稳定的亲水性蛋白,二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主,为膜内蛋白,无信号肽和跨膜蛋白;SMPX氨基酸序列共有4个磷酸化位点。亚细胞定位结果表明,SMPX蛋白的分布于细胞核(52.2%)、线粒体(43.5%)和细胞质(4.3%)。实时荧光定量PCR检测结果显示,SMPX基因在牦牛右心室中表达量最高,显著高于其他组织(P<0.05)。本试验结果为深入研究SMPX基因在牦牛中的生理功能和调控机制提供了参考数据。     

牦牛SMPX基因CDS区克隆及组织表达分析

本研究旨在克隆牦牛X染色体相关小肌肉蛋白(small muscle protein X-link,SMPX)基因的CDS区序列,分析该序列所编码蛋白的结构与功能,并检测SMPX基因在牦牛不同组织中的表达情况。运用RT-PCR技术扩增并克隆SMPX基因CDS区序列,分析其氨基酸序列相似性并构建系统进化树;通过在线软件对其理化性质、二级结构和三级结构进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR方法检测SMPX基因在牦牛右心室、臀大肌、肺脏和大脑4个组织中的表达情况。结果表明,牦牛SMPX基因CDS区全长515 bp,开放阅读框(ORF)长261 bp,编码86个氨基酸。牦牛SMPX氨基酸序列与野牦牛、水牛、家犬、人、白尾鹿德克萨斯亚种、绵羊、黑猩猩、藏羚羊、野猪的相似性分别为100%、97.7%、96.5%、96.5%、95.3%、95.3%、96.5%、94.2%和91.9%,说明其在不同物种间具有较高的保守性。生物信息学分析发现,SMPX蛋白是一种不稳定的亲水性蛋白,二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主,为膜内蛋白,无信号肽和跨膜蛋白;SMPX氨基酸序列共有4个磷酸化位点。亚细胞定位结果表明,SMPX蛋白的分布于细胞核(52.2%)、线粒体(43.5%)和细胞质(4.3%)。实时荧光定量PCR检测结果显示,SMPX基因在牦牛右心室中表达量最高,显著高于其他组织(P0.05)。本试验结果为深入研究SMPX基因在牦牛中的生理功能和调控机制提供了参考数据。     

槟榔江水牛OXCT1基因的分子特征及组织表达谱分析

本研究对槟榔江水牛3-酮酸辅酶A转移酶1(3-oxoacid CoA-transferase 1,OXCT1)基因的完整CDS区进行了PCR扩增,并对其功能生物信息学和多组织差异表达进行了分析。以普通牛OXCT1基因序列(GenBank登录号:XM_006076397)为参考序列,采用Primer Premier 5.0软件设计引物序列,以提取的槟榔江水牛基因组DNA为模板,PCR扩增获得槟榔江水牛OXCT1基因mRNA序列,扩增产物经测序后利用ORF Finder软件进行开放阅读框识别,获得水牛OXCT1基因CDS区全序列,并对其进行生物信息学分析。结果显示,槟榔江水牛OXCT1基因CDS序列全长1 563 bp,编码520个氨基酸,蛋白分子式为C_(2509)H_(4041)N_(687)O_(746)S_(23),分子质量为56.50 ku,理论等电点(pI)为8.69,不稳定系数为27.49,平均疏水性(GRAVY)为-0.097,该蛋白属弱亲水性蛋白。OXCT1蛋白无信号肽和跨膜结构,属于线粒体膜蛋白;包含pcaJ_scoB_fam和AtoD 2个保守结构域,且具有5个功能活性位点。槟榔江水牛与普通牛、藏羚羊等5个物种的OXCT1氨基酸序列同源性≥97%。对槟榔江水牛13个组织进行表达谱分析表明,在泌乳期,OXCT1基因在乳腺中表达量最高,在肾脏、垂体、脂肪、大脑、皮肤和肌肉中不表达;在非泌乳期,OXCT1基因在除脂肪以外的其他12个组织中都有表达。OXCT1基因在槟榔江水牛泌乳期乳腺组织中表达量最高,推测其可能参与了水牛的乳脂合成调控事件。本研究结果可为深入了解乳脂合成代谢及其调控机制提供依据。     

中国牛亚科家畜GH基因编码区序列的遗传变异研究

采用PCR产物直接双向测序法,分段扩增普通牛、瘤牛、牦牛、大额牛和亚洲水牛共5个牛种的GH基因,并拼接成编码区全序列,分析中国牛亚科家畜不同牛种GH基因编码区序列变异及其分子进化特征。结果表明,牛GH基因编码区序列全长654bp,种间核苷酸突变率在0．1％～1．84％。5个牛种编码区序列定义了10种单倍型,瘤牛的单倍型多样性最高,大额牛和水牛均无单倍型多样性。GH基因编码区序列的密码子使用存在偏倚性,共发现了25个偏好性密码子。核苷酸的替代以转换为主,转换明显高于颠换,转换／颠换比为3．0。非同义突变位点远远少于同义突变位点,同义与非同义替代发生的速率比都小于或等于1,表明GH基因编码区序列不受达尔文正选择的影响。以GH基因单倍型序列为基础的分子进化树表明,水牛与普通牛、瘤牛、牦牛、大额牛间分化很明显;普通牛、瘤牛、牦牛、大额牛间序列分化并不明显,并且它们共同拥有一条相同的祖先核苷酸序列。说明中国牛亚科家畜GH基因编码区序列的变异相当贫乏,并且由于功能的约束表现得相当保守,进化速率相当缓慢。     

槟榔江水牛OXCT1基因的分子特征及组织表达谱分析

本研究对槟榔江水牛3-酮酸辅酶A转移酶1（3-oxoacid CoA-transferase 1,OXCT1）基因的完整CDS区进行了PCR扩增,并对其功能生物信息学和多组织差异表达进行了分析。以普通牛OXCT1基因序列（GenBank登录号：XM_006076397）为参考序列,采用Primer Premier 5.0软件设计引物序列,以提取的槟榔江水牛基因组DNA为模板,PCR扩增获得槟榔江水牛OXCT1基因mRNA序列,扩增产物经测序后利用ORF Finder软件进行开放阅读框识别,获得水牛OXCT1基因CDS区全序列,并对其进行生物信息学分析。结果显示,槟榔江水牛OXCT1基因CDS序列全长1 563 bp,编码520个氨基酸,蛋白分子式为C₂₅₀₉H₄₀₄₁N₆₈₇O₇₄₆S₂₃,分子质量为56.50 ku,理论等电点（pI）为8.69,不稳定系数为27.49,平均疏水性（GRAVY）为-0.097,该蛋白属弱亲水性蛋白。OXCT1蛋白无信号肽和跨膜结构,属于线粒体膜蛋白;包含pcaJ_scoB_fam和AtoD 2个保守结构域,且具有5个功能活性位点。槟榔江水牛与普通牛、藏羚羊等5个物种的OXCT1氨基酸序列同源性≥ 97%。对槟榔江水牛13个组织进行表达谱分析表明,在泌乳期,OXCT1基因在乳腺中表达量最高,在肾脏、垂体、脂肪、大脑、皮肤和肌肉中不表达;在非泌乳期,OXCT1基因在除脂肪以外的其他12个组织中都有表达。OXCT1基因在槟榔江水牛泌乳期乳腺组织中表达量最高,推测其可能参与了水牛的乳脂合成调控事件。本研究结果可为深入了解乳脂合成代谢及其调控机制提供依据。     

水牛SERPINE2基因的克隆、生物信息学及组织表达分析

本试验对水牛SERPINE2基因进行生物信息学分析，探索其在水牛不同组织器官中的表达规律，旨在为研究SERPINE2在水牛生殖过程中的具体调控机制提供理论支持。利用PCR技术克隆水牛SERPINE2基因CDS区的全长序列，在线生物信息学分析程序对SERPINE2进行分析，实时荧光定量PCR技术检测SERPINE2 mRNA在水牛不同组织的表达水平。结果表明：SERPINE2基因CDS区长度为1 191 bp，编码397个氨基酸，通过分析相似性结果，发现水牛和牛、绵羊、山羊的相似性为99.6%；系统进化树结果显示，遗传距离最近的是水牛和牛，绵羊次之。在组成SERPINE2蛋白的氨基酸中，缬氨酸含量较高，占氨基酸总数的9.6%。SERPINE2蛋白是一种不稳定的亲水蛋白，SERPINE2有一个信号肽，没有跨膜结构域。SERPINE2蛋白的二级结构中，α-螺旋结构的占比最高，为41.56%。多个器官检测出SERPINE2 mRNA的表达，其中在卵巢的表达量显著高于其他器官，说明SERPINE2基因可能与卵巢生长发育有重大联系。     

广灵大尾羊HSD17B12基因克隆、生物信息学分析及表达规律的研究

本研究旨在克隆广灵大尾羊HSD17B12基因CDS，预测HSD17B12蛋白及其基因启动子区的结构和功能特性，探究HSD17B12基因在前体脂肪细胞分化过程中的表达。采用PCR法克隆HSD17B12基因CDS全长序列；生物信息学软件分析HSD17B12蛋白的理化性质、结构、功能位点和结构域，并进行亚细胞定位、序列相似性分析及其基因核心启动子区和转录因子潜在结合位点的预测；采用实时荧光定量PCR检测HSD17B12基因以及部分转录因子在前体脂肪细胞分化过程中的相对表达量。结果显示，广灵大尾羊HSD17B12基因CDS全长939bp，编码312个氨基酸；HSD17B12蛋白主要定位于内质网，有3个跨膜结构域和33个磷酸位点，二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成，其氨基酸序列与山羊相似性最高；HSD17B12基因有5个潜在的核心启动子区，存在SP1、ATF2和CREB1等10个转录因子的结合位点；在前体脂肪细胞分化过程中，SP1、ATF2和HSD17B12基因的mRNA表达均呈上升趋势，说明ATF2和SP1可能正向调控HSD17B12基因的表达，促进脂质沉积。本研究为进一步揭示HSD17B...     

牦牛生长分化因子-9基因cDNA克隆及序列分析

根据GenBank中普通牛生长分化因子9(GDF-9)基因序列(AF 307092)设计1对引物,以麦洼牦牛卵母细胞总RNA为模板,通过RT-PCR技术对牦牛GDF-9基因cDNA进行克隆测序和序列分析.结果表明:所克隆的1399 bp片段为预期的牦牛GDF-9基因cDNA序列,包含由2个外显子组成的全编码区和3′-下游部分序列.牦牛GDF-9基因编码区核苷酸序列长度为1362 bp,编码453个氨基酸,与GenBank中报道的普通牛、水牛、绵羊、山羊相应序列一致,而与人和黑猩猩存在差异.和普通牛相比,牦牛GDF-9基因编码区存在1处碱基转换(C→T),导致相应的氨基酸由丙氨酸(A)转换为缬氨酸(V).牦牛与普通牛、水牛、绵羊、山羊、人和黑猩猩的核苷酸同源性分别为99.9%、98.4%、97.0%、96.8%、85.6%和85.1%;氨基酸同源性分别为99.8%、97.1%、95.1%、95.4%、79.4%和79.5%.利用NJ法和MP法以该基因编码区核苷酸序列构建的物种间分子系统进化树结果基本一致,即牦牛与普通牛先聚为一类,再与水牛聚为一类,而后与绵羊和山羊聚为一类,最后与人和黑猩猩聚为一类.该聚类结果与物种间遗传距离大小一致,也与各物种在动物学上的分类相吻合,表明GDF-9基因编码区适用于构建物种间系统进化树.