变铅青链霉菌66多效性突变子的遗传分析

ＺＸ１和ＺＸ７是变铅青链霉菌ＪＴ４６经ＮＴＧ诱变所产生的多效性突变菌株。进一步的研究证明，它们表达黑色素基因能力的降低与异常修饰这两种不同的遗传表型是不同基因作用的结果。将天蓝色链霉菌中控制产孢的关键基因ｗｈｉＧ引入ＺＸ１并不能恢复或互补ＺＸ１产孢差的性状。ＺＸ１的ＤＮＡ经脉冲电泳也不补降解。脉冲电泳和基因文库杂交的结果均证明ＺＸ１发生大片段缺失。     

链霉菌高拷贝质粒pIJ101DNA的研究 Ⅲ.在变铅青链霉菌中的启动子活性

链霉菌高拷贝质粒pIJ101上的两个片段(1.18kb和0.54kb)在大肠杆菌中具有明显的启动子活性。把这两个片段克隆到链霉菌启动子探针载体pIJ424和pIJ425(修饰了克隆位点)上,转化到变铅青链霉菌中,然后用梯度平板测定转化子对卡那霉素的抗性水平发现:在变铅青链霉菌中,1.18kb的片段在两个方向都有启动子活性,而0.54kb的片段则明显没有。     

变青链霉菌DNA的研究——Ⅰ.电泳过程中的特异性降解

变青链霉菌基因组DNA和质粒DNA在某些特定批号的电泳缓冲液中电泳时,双链DNA遭到很强的降解。变青链霉菌基因组DNA受到有限切割而产生的DNA片段的平均大小为6kb左右。天兰色链霉菌A3(2)和好几种其它链霉菌菌株的DNA,以及大肠杆菌的DNA在同样条件下并不受这种切割的影响。已经证明,这种特异性对变青链霉菌DNA的切割不是由于缓冲液中污染了微生物,进而产生核酸酶所致,而是由于某些批号的EDTA商品中污染了Fe~(2+)所致。变青链霉菌中DNA制备物“较差”的许多报道可能都是上述原因所致。     

变铅青链霉菌高效异源表达宿主SBT5的构建

以变铅青链霉菌TK24为出发菌株,依次敲除钙依赖抗生素(CDA)、放线紫红素(ACT)和十一烷基灵菌红素(RED)这3个内源抗生素的生物合成基因簇,同时在钙依赖抗生素基因簇原位整合了来自棒状链霉菌的全局性调控基因afsRScla,构建得到变铅青链霉菌菌株SBT5。将来自天蓝色链霉菌的放线紫红素生物合成基因簇导入SBT5中,接合子产生大量蓝色的放线紫红素,而出发菌株TK24只产微量蓝色抗生素;SBT5接合子的ACT产量也显著高于导入了额外act基因簇拷贝的出发菌株接合子。SBT5菌株次级代谢背景清晰,不产色素类抗生素和抗细菌抗生素,可作为高效宿主用于次级代谢产物基因簇的异源表达和筛选。     

大肠杆菌乙酰-CoA羧化酶基因异源表达对变铅青链霉菌次级代谢的影响

克隆组装了大肠杆菌的乙酰-CoA羧化酶基因acc,以研究其异源表达对变铅青链霉菌中2种“沉默”抗生素放线紫红素和十一烷基灵菌红素合成的影响。大肠杆菌ACC由4个基因编码,通过PCR扩增4个基因,并通过重叠延伸PCR加上ermE启动子,构建得到4个重组基因;再将重组基因依次组装得到异源表达质粒pHLZ11,接合转移到变铅青链霉菌中进行异源表达。结果显示：含有异源表达质粒的变铅青链霉菌接合转移子能合成放线紫红素而十一烷基灵菌红素产量提高。表明大肠杆菌acc基因异源表达能够激活变铅青链霉菌沉默抗生素的合成,并提高已有抗生素产量。     

青霉菌对桃树铅胁迫的缓解效应

为了解青霉菌对植物吸收重金属元素铅的影响,把从土壤里分离到的具有铅富集能力的青霉菌(Penicillium Inordinate Arenicolasp.)接种到铅污染不同程度的土壤里,采用盆栽的方法观察这个菌株对毛桃(Prunuspersica L.Batsch)和大久保桃(Prunuspersica L.Batschcv.Okubao)铅胁迫的缓解效应。结果表明:(1)在接种青霉菌的土壤里生长的毛桃和大久保桃的根、茎、叶中铅累积量均比未接种青霉菌的低,茎叶中铅的分配率比未接种青霉菌的低;(2)接种青霉菌相对增加桃苗株高、叶绿素含量、硝酸还原酶及超氧化物歧化酶活性,降低叶片的细胞膜透性;随着土壤中铅胁迫强度的增加,接种青霉菌对增加桃树株高及改善叶片生理特性的效应递减;(3)两个桃树品种的上述生理性状受铅胁迫的影响及青霉菌的缓解效应存在品种间差异。     

将透明颤菌血红蛋白基因(vgb)转移到链霉菌染色体整合载体的构建

链霉菌抗生素的生物合成对培养环境中氧的供应相当敏感,为了改善这一溶氧问题,本研究通过将透明颤菌血红蛋白基因(vgb)克隆到含ФC31int,attP基因的诱导型表达载体pU8600上,构建了可接合转移到链霉菌的整合型表达vgb基因的质粒pHZ1276。pHZ1276通过接合转移导入变铅青链霉菌(Streptomyces lividans),所得重组子经Southern杂交验证后,进行诱导表达,菌体经破碎后所得蛋白粗提物经Western杂交和CO结合试验表明vgb基因在该菌中表达出了有活性的VHb蛋白。     

拮抗链霉菌AFLP分析技术体系的研究

[目的]探索基于AFLP的拮抗链霉菌DNA模板制备方法及其扩增体系,为AFLP技术在链霉菌乃至放线菌资源分析中的应用提供依据。[方法]以改进的CTAB法提取DNA,利用Pst I／Mse I型AFLP试剂盒及其反应体系进行扩增,采用5％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析扩增结果。[结果]提取了10个拮抗链霉菌菌株的基因组DNA,0.8％琼脂糖凝胶电泳检测显示其主带清晰,片段大小为37.64-40.86Kb,无降解现象,亦无RNA残留;其OD260/OD280为1.625-1.833;Pst I／Mse I双酶切产物琼脂糖电泳呈弥散荧光长带,说明酶解充分;筛选出的3对引物对DNA模板的扩增谱带清晰,多态性丰富。[结论]该研究建立的DNA模板制备方法及其扩增反应体系可用于链霉菌的AFLP分析。     

西安市北郊污灌区土壤中抗铅链霉菌的多样性分析

从西安市北郊污灌区采集土样,用添加K2Cr2O75 μg·mL-1和青霉素2 μg·mL-1的高氏1号、HV和SC固体培养基分离到120株具有链霉菌特征的放线菌.采用浓度梯度法,用含Pb2+培养基对分离菌株进行筛选,得到50株抗铅链霉菌.在抗铅能力实验结果的基础上,选取14株抗性较强链霉菌代表菌株进行形态培养特征、生理生化和16S rDNA基因序列相似性等分析.结果表明,14株代表菌株可归为6个不同的颜色类群,其表型特征与生理生化性质和链霉菌相符合,在系统发育树上处于8个不同的进化分支.菌株HQ0031与已知链霉菌相似性差异较大,可能为链霉菌属内1个潜在新种.研究表明西安市北郊污灌区土壤中抗铅链霉菌具有丰富的多样性,可为重金属污染环境的生物修复提供有益的微生物资源.     

羽毛降解杆状链霉菌S-28遗传转化系统的建立与优化

【目的】建立羽毛降解杆状链霉菌(Streptomyces bacillaris)S-28的遗传转化系统,并对其进行优化,为该菌株的遗传改造奠定基础。【方法】以大肠杆菌-链霉菌穿梭整合型质粒pSET152为出发质粒,大肠杆菌(Escherichia coli)S17-1/pSET152为供体,羽毛降解杆状链霉菌S-28孢子为受体进行接合转移试验,并对影响接合效率的培养基种类、MgCl_2浓度、热激温度、预萌发时间、供受体比例和接合转移时间等要素进行优化。【结果】确定筛选羽毛降解杆状链霉菌S-28菌株接合转化子的抗生素为安普霉素≥10μg/mL或卡那霉素≥20μg/mL;成功将pSET152转入到杆状链霉菌S-28中。优化的S-28菌株接合转移条件为:以MS为接合转移最适培养基,MgCl_2浓度为10mmol/L,孢子萌发条件为40℃热激10min且不进行预萌发处理,供受体比例为10∶1,接合转移时间18~20h,此条件下接合转化效率最高达到10-4。【结论】建立并优化了羽毛降解杆状链霉菌S-28的遗传转化系统,接合转化效率最高可达到10~(-4)。     

链霉菌高拷贝质粒pIJ101 DNA的研究 Ⅳ.BclI-E片段上启动子的定位

将链霉菌高拷贝质粒pIJ101上具有明显启动子活性的BclI—E片段(1.18kb)用MboI酶切后克隆到链霉菌启动子探针载体pIJ425中所做的试验证明,当把这个片段的末端去掉以后,中间的两个次级片段(0.63kb和0.68kb)比完整的BclI—E片段具有更强的(4～6倍)激活指标基因neo表达的能力.Southern印迹杂交试验证明这两个片段均来自于pIJ101的BclI—E片段.这项试验不仅大大缩小了BclI—E片段上的启动子活性区域,而且说明BclI—E片段末端有转录终止子的存在.     

链霉菌的分子育种研究进展

大多数抗生素均是由链霉菌产生的,但随着抗生素的高剂量大面积使用,抗生素的使用寿命也随之缩短,从而使得快速选育高产量、产新抗生素的链霉菌显得尤其重要。随着基因工程技术和分子生物学手段的不断发展以及对微生物次生代谢机制的进一步了解,链霉菌的选育已由原来随机诱变筛选进入到分子育种。综述了链霉菌在提高抗生素产量和产生新抗生素方面的分子育种进展。     

阿维链霉菌BAC文库的构建及分析

为进一步阐明阿维菌素的生物合成路径和调控途径,提高阿维菌素的产量,采用BamHⅠ限制性内切酶酶解阿维链霉菌基因组DNA的方法,构建了阿维链霉菌的细菌人工染色体(BAC)文库。该文库共包含2 304个克隆,平均插入片段为101kb,空载率约9%,覆盖了该菌基因组的25.9倍。该文库的成功构建可以为其他微生物尤其是基因组具有磷硫酰化修饰的微生物的文库构建提供参考。     

链霉菌高拷贝质粒pIJ101DNA的研究 I．在大肠杆菌中的启动子活性

用大肠杆菌座子与Tn5个去除了自身启动子区域的卡那霉素抗性基因（neo)作为指标标记来探测广寄主、高拷贝的链霉菌质粒pIJ101上DNA的启动子活性所做的基因融合试验揭示，pIJ101上至少有两个可大大肠杆菌中行使启动子功能的DNA片段。基因融合后所产生的杂合质粒能够赋予大肠杆菌ED8767较高的卡那霉素抗性。对含质粒菌株在液体培养基中的生长动力学分析揭示，这种菌株在从无药物向有药物的生物环境中过渡时，生长并不受到暂时的抑制。说明这种启动子活性不是pIJ101DNA上DNA的突变所引起。用大肠杆菌的启动子探针载体pKK232-8所做的体外亚克隆试验更进一步证实了这项观察，并把两个启动子功能区分别缩小到0．54kb和1．18kb的范围内。这项试验成功地组建了质粒pIJ101亚克隆库，便于对这个重要的链霉菌质粒进行精细的分子生物学研究。     

重寄生链霉菌F46与链霉菌SC1融合子的筛选

运用原生质体融合技术将重寄生链霉菌F46与生防链霉菌SC1融合,获得40株融合子.依据形态特征、皿内拮抗试验对获得的融合子进行初筛,发酵液抑菌活性测定,筛选出2株抑制效果明显的融合子FSf-11和FSf-13.皿内拮抗试验结果表明,2个融合子对灰葡萄孢(B.cinerea)有明显的抑制作用,抑制率比亲本SC1分别提高了27.99%和20.56%,镜检发现灰葡萄孢的基内菌丝畸形,经FSf-13处理后还出现原生质凝聚现象.融合子的发酵滤液对胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)抑制效果显著,抑菌圈直径超过了20 mm;融合子FSf-11的发酵滤液对尖镰孢萎蔫专化型(F.oxysporum f.sp.vasinfectum)和大丽轮枝菌(V.dahliae)的孢子萌发抑制作用最强,其孢子萌发率低于10%;融合子FSf-13对2种靶标菌的孢子萌发抑制率也超过了50%.