马铃薯可溶性淀粉合成酶SSⅢ基因克隆及生物信息学分析

用RT-PCR方法从马铃薯中克隆了可溶性淀粉合成酶SSⅢ基因的cDNA片段,序列分析表明该cDNA片段全长为3 967 bp,开放阅读框为3 693 bp,编码1 230个氨基酸.核酸序列同源性分析表明,该cDNA与已发表的马铃薯SSⅢ基因(X94400)具有99%同源性,氨基酸序列同源性达98%.应用生物信息学软件对SSⅢ基因分析表明:其编码的蛋白质具有多个磷酸化位点;蛋白质二级结构预测显示,有369个氨基酸可能形成α-螺旋结构,249个氨基酸可能形成β折叠,102个氨基酸可能形成β转角,510个氨基酸可能形成无规则卷曲;通过亚细胞定位可知,它是一种含有75个氨基酸的叶绿体转运肽蛋白.     

转PPase基因对马铃薯块茎休眠相关生理特性的影响

马铃薯块茎的休眠和发芽对于马铃薯栽培、贮藏保鲜和加工等具有十分重要的意义。本研究以25℃室温条件下贮藏90d后的转正义和反义无机焦磷酸酶(PPase)基因马铃薯Favorita的块茎为材料,对贮藏块茎的PPase活性和及Pi、可溶性糖、淀粉、蛋白质含量进行了测定,以探讨PPase基因对马铃薯相关休眠生理特性的影响。结果表明,与对照相比,转正义PPase基因的两个株系F-2-1和F-2-4块茎中的PPase活性、Pi含量和可溶性糖含量增加、淀粉含量和蛋白质含量降低,且与对照相比均达到极显著水平(只有F-2-4淀粉含量与对照相比无显著性变化);转反义PPase基因的两个株系F-1-1和F-1-2块茎中PPase活性、Pi含量和可溶性糖含量降低、淀粉含量增加,与对照相比均达到极显著性水平,而蛋白质含量与对照相比无显著性变化。     

转PPase基因对马铃薯无机焦磷酸酶活性和无机磷含量的影响

对转正义和反义无机焦磷酸酶(PPase)基因马铃薯PPase活性及其测定最适条件和无机磷(Pi)含量进行了研究,结果表明,PPase活性测定最适pH值是8.0,最适温度是42℃,二价阳离子以Mg2+最好.叶片中PPase活性和Pi含量较高,茎和生长期微型薯中PPase活性和Pi含量较低,贮存3个月的微型薯中PPase活性和Pi含量比生长期块茎更低.另外,与未转基因的对照相比,转正义PPase基因提高了转基因马铃薯中PPase活性和Pi含量,转反义PPase基因降低了转基因马铃薯中PPase活性和Pi含量.     

大肠杆菌Top10甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因克隆及生物信息学分析

根据细菌中存在的甘露醇-1-磷酸脱氢酶（mannitol-1-phosphate dehydrogenase,mtlD）的基因序列,采用PCR扩增的方法从大肠杆菌（Escherichia coli）Top10中克隆到了mt／D基因（Acession numeber：EU433565）。mtlD开放阅读框为1149bp,编码含有382个氨基酸残基,分子量为41．2kD的蛋白,预测等电点为5．37。mtlD含有38个碱性氨基酸,50个酸性氨基酸,158个疏水氨基酸及72个极性氨基酸。二级结构预测表明该蛋白含约60．47％的α-螺旋、4．71％的β-转角、10．73％的延伸链和20．48％的不规则卷曲。亲疏水性分析显示,mtlD是亲水性蛋白。亚细胞定位分析表明mtlD主要定位于细胞质中。序列分析表明大肠杆菌Top10 mtlD基因与大肠杆菌W3350、大肠杆菌DEC12a和盐生盐杆菌（Halobacterium salinarum）的mtlD基因同源性分别为99％、97％和93％。大肠杆菌Top10mtlD基因的克隆及生物信息学分析为今后对mtlD的进一步深入研究奠定了基础。     

致病疫霉木瓜蛋白酶亚家族基因C1A-PH-SCH1的克隆与表达分析

为进一步明确引起马铃薯晚疫病的致病因子,通过克隆马铃薯晚疫病致病疫霉菌分泌蛋白中的半胱氨酸蛋白酶家族基因,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌BL21中诱导表达。本试验采用TA克隆法,提取来自云南马铃薯产区的致病疫霉菌XH05-5-4的总RNA,反转录cDNA,PCR扩增后将该基因片段连接到载体,转化大肠杆菌BL21并诱导表达。克隆获得半胱氨酸蛋白酶家族基因全长为1176 bp,包含1个最大的开放阅读框1077 bp,编码387个氨基酸。推测蛋白相对分子量41.671 kD,理论等电点4.88;经IPTG诱导和SDS-PAGE检测,所构建的原核表达载体表达的蛋白与预期蛋白相符合。生物活性测定表明：马铃薯叶片出现坏死,类似于晚疫病症状。利用TA克隆技术从致病疫霉菌XH05-5-4中克隆得到了1个半胱氨酸蛋白酶家族基因（登录号：KP938956命名：C1A-PH-SCH1）,通过同源性比对发现C1A-PH-SCH1为木瓜蛋白酶亚家族基因,成功构建了原核表达载体,并使其在大肠杆菌中得到了表达,对生物活性测定结果显示出现了类似于晚疫病症状的水渍坏死斑症状,推测C1A-PH-SCH1参与马铃薯晚疫病的发病过程。     

荞麦BTI全长基因的克隆及表达分析

【研究目的】扩增荞麦胰蛋白酶抑制剂(Buckwheat trypsin inhibitor,BTI)基因,并对其表达特性和氨基酸同源性进行分析。【方法】根据荞麦胰蛋白酶抑制剂氨基酸的保守序列设计简并引物,采用RT-PCR和RACE技术,以荞麦cDNA为模板,扩增BTI基因并进行序列及其表达谱分析。【结果】克隆得到了BTI基因。它的cDNA全长为459bp,含有一个216bp的完整阅读框,编码72个氨基酸。同源性分析表明,其蛋白质序列与已报道的荞麦种子提取的BWI-1的氨基酸序列的同源性达96%,与笕属植物ATI、亚麻属植物Luti、马铃薯蛋白酶抑制剂PPI-I的氨基酸序列的同源性分别为65%、59%、48%。RT-PCR分析表明,BTI基因可在不同的组织中进行表达,但经伤害处理后的叶片中其表达量略高于生长各阶段。这可能与逆境情况(如外界损伤)下的应答等生理过程有关。【结论】荞麦BTI基因的获得,可为荞麦胰蛋白酶抑制剂的基础及应用研究奠定基础。     

甘薯二羟基黄酮醇还原酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

根据其它作物的二羟基黄酮醇还原酶（DFR）基因的保守序列设计引物,利用RT-PCR方法从甘薯块根中分离出花青素合成相关基因DFR基因,并定名为ibDFR。该基因全长1232bp,编码398aa。核甘酸序列分析表明,与牵牛相似系数达85%,与烟草的相似系数达到67%,与马铃薯的相似系数达75%。将ibDFR连接到pET30a（＋）载体中,检测ibDFR在大肠杆菌中的表达。实验结果表明ibDFR蛋白质分子量大小与推算一致,能在大肠杆菌中转录表达。     

马铃薯块茎休眠解除过程中NOX酶活性变化及其蛋白质结构分析

本研究测定了马铃薯块茎休眠解除过程中NADPH氧化酶(NADPH oxidase,NOX)的酶活性,用q RT-PCR方法检测了马铃薯St NOXs基因在块茎休眠解除过程中的相对表达量,并利用生物信息学方法分析了St NOX3基因编码蛋白质的可能结构和功能。情况表明:马铃薯块茎休眠解除过程中NOX酶活性呈升-降-升-降的动态变化过程;q RT-PCR情况显示St NOX3基因的相对表达量与NOX酶活性呈相同的变化趋势;生物信息学分析表明该基因编码940个氨基酸,蛋白质相对分子量为106 004.79,等电点为8.76。研究情况为进一步阐明St NOX基因家族在马铃薯块茎休眠解除过程中的作用奠定了基础。     

苹果MdSGR2基因克隆及植物超表达载体构建

STAYGREEN(SGR)基因在植物叶绿素降解代谢过程中起重要作用。为探究苹果SGR2基因的生物学功能，利用RT-PCR技术从澳洲青苹成熟果皮中克隆得到MdSGR2基因，利用生物信息学分析软件对其编码蛋白进行了同源性、理化性质、蛋白结构、启动子顺式作用元件等预测和分析，并构建其植物超表达载体。结果表明，MdSGR2基因完整开放阅读框(ORF)cDNA序列为840 bp,编码279个氨基酸，该蛋白属于Staygreen超家族。理化性质分析表明，该蛋白分子质量为31.27 ku,等电点pI为8.52,属不稳定亲水蛋白。同源性分析表明，MdSGR2蛋白与秋子梨SGR同源性最高，达84.12%。蛋白质结构分析表明，该蛋白二级结构和三级结构主要由α-螺旋、无规则卷曲构成，二者比例分别为40.50%,44.44%。启动子分析表明，该基因启动子区域包含低温顺式作用元件、光响应元件和脱落酸、水杨酸、茉莉酸甲酯响应元件等诱导型顺式作用元件，说明MdSGR2基因可能受环境和激素等多种因素的调控。同时研究成功构建了MdSGR2基因植物超表达载体pCAMBIA2301-MdSGR2。     

基于侯选基因标记的四倍体马铃薯休眠QTL关联分析

休眠期是马铃薯(SolanumtuberosumL.)重要的块茎性状之一,寻找调控马铃薯块茎休眠的关键基因,揭示其分子机制以选育具有适宜休眠期长度的马铃薯品种,对于解决当前马铃薯产业中过长或过短休眠期带来的经济损失和食品安全隐患等问题十分关键。前期研究在二倍体马铃薯连锁群体中定位了6个加性休眠QTL,本研究拟在四倍体马铃薯育种材料中验证这些休眠QTL。基于休眠QTL连锁的候选基因标记,采用混合线性模型(MLM),模型中考虑群体结构和亲缘关系(Q+K),在四倍体马铃薯自然群体St-hzau中对马铃薯块茎休眠期进行了关联分析。5号染色体上休眠QTL DorB5.3连锁的候选基因标记S199_300和GWD (根据葡聚糖水双激酶α-glucan water dikinase基因设计)与马铃薯块茎休眠期具有显著的关联(P0.05),分别解释了休眠期表型变异的7.8%和3.2%,分别能增加休眠期7.1 d和4.5 d,即在二倍体马铃薯连锁群体中定位的稳定主效休眠QTL DorB5.3在四倍体马铃薯关联群体St-hzau中也表现显著, DorB5.3的稳定性在关联分析结果中得到了验证,表明候选基因标记策略在马铃薯块茎休眠QTL关联分析中是一种有效的策略。本研究所验证的主效休眠QTL DorB5.3及相应连锁标记可以直接用于马铃薯休眠育种。据此可以推测GWD可能在控制还原糖含量和块茎休眠2个方面均发挥作用,马铃薯块茎休眠机制与还原糖含量变化机制可能存在着部分交叉。     

马铃薯块茎膨大特性及其与单薯鲜重之间的相关性

为定量分析马铃薯块茎膨大特性及其与单薯鲜重之间的相关性,于2018-2019年马铃薯生长季开展不同种植管理模式的田间试验,通过分析马铃薯单薯鲜重和块茎膨大速率等随结薯天数的变化规律,以及块茎膨大参数与单薯鲜重之间的内在关系,明确了马铃薯块茎膨大特性及其与单薯鲜重的相关性。结果表明：各处理马铃薯单薯鲜重随结薯天数呈“S”型曲线变化趋势,在结薯35d后,水肥一体化（TI）处理的单薯鲜重显著高于常规水肥（TC）处理;各处理马铃薯块茎膨大速率随结薯天数呈“单峰”曲线的变化趋势,块茎膨大速率达到最大值成熟期时,TI处理的块茎膨大速率高于TC处理,但差异不显著;马铃薯块茎膨大主要参数均与最终单薯鲜重呈正相关,但均未达到显著相关水平,快增期膨大速率R₂和缓增期膨大速率R₃均与平均膨大速率R间达到极显著正相关,说明TI处理可以保障水肥的精准供应,特别是在马铃薯生长后期可以有效防止植株早衰,提高块茎膨大快增期和缓增期膨大速率,促进马铃薯块茎膨大和干物质积累,而TC处理在马铃薯生长后期容易出现肥料供应不足的情况,抑制了马铃薯块茎膨大。此外,马铃薯块茎平均膨大速率和最大膨大速率主要受块茎快增期和缓增期膨大速率的影响。     

杀菌剂对甘薯致病菌Hypocrea sp. SP-4和Rhizopus stolonifer SP-1生长影响研究

为了研究杀菌剂对甘薯致病菌Hypocrea sp. SP-4和Rhizopus stolonifer SP-1生长的抑制效果,本文从腐烂的甘薯块根中分离到的匍枝根霉SP-1（Rhizopus stolonifer SP-1）和Hypocrea sp. SP-4的孢子接种在含有不同杀菌剂浓度的PDA培养基上,在13℃和28℃条件下培养。同时也将2种孢子接种在甘薯块根上,进行培养观察。结果表明：2株真菌低温条件下,在不含杀菌剂的培养皿上的生长速度明显比28℃条件下要缓慢些;甲基托布津和多菌灵对Hypocrea sp. SP-4和R.stolonifer SP-1生长抑制的稀释度分别为1000倍和500倍。在28℃条件下,2种杀菌剂对Hypocrea sp. SP-4都有良好的抑制效果,但对R.stolonifer SP-1抑制率,甲基托布津只有21%,多菌灵则有58%。在用杀菌剂抑制甘薯块根侵染的过程中还发现,甘薯块根在没有创伤的情况下,2株真菌在低温条件下不会引起腐烂,说明它们是通过伤口侵染甘薯块根的。综合几个指标可以得出：适度低温和避免甘薯块根出现伤口能够减少甘薯块根被真菌侵染。     

马铃薯块茎形状CAPS标记的开发与验证

马铃薯块茎形状(薯形)是选育马铃薯品种尤其是加工品种最重要的性状之一。前人研究表明薯形是由位于第10染色体的单基因Ro控制的,并且圆形对长形为显性。本研究以二倍体马铃薯长薯形基因型10618-01和圆薯形基因型320-02及其213个F₁代薯形分离群体为材料,基于马铃薯基因组相关序列信息结合分离群体分组分析法开发标记,获得了一个CAPS标记1137-CAPSVI。利用该标记对53份不同薯形的四倍体马铃薯高代品系进行验证,结果表明该标记的选择准确率达83.02%,进一步的Pearson双侧相关分析显示其相关性达极显著水平,且该标记对圆薯形材料的选择准确率更高,达91.42%。该CAPS标记的获得对于四倍体马铃薯分子标记辅助育种,加速马铃薯品种尤其是加工专用型品种的选育具有重要意义。     

反义PPO基因对马铃薯块茎褐化的影响

对刚收获和贮藏5个月后的12个转基因马铃薯品系及对照块茎进行褐化指标的生理检测,发现2个检测时期的各褐化指标在供试品系间差异均达到显著或极显著水平。综合2个检测时期并与对照相比,PPO活性降幅为26.01%~48.65%;酚物质含量降低22.83%~54.81%;褐化强度除GD-9-qc-1低于对照40.45%~46.78%外,其余品系高于对照或与对照无差别。切割块茎发现,大部分转基因品系较对照褐化出现晚,褐化程度低,褐化指数低于对照88.0%~98.86%。PPO的化学定位显示,低褐化转基因品系的多酚氧化酶集中于维管束环,含量明显少于对照,其中GD-9-qc-1仅有少量多酚氧化酶显现出来,推测是由于反义PPO基因抑制块茎POT32基因表达的结果。进一步的方差、相关分析表明,除对多酚氧化酶含量抑制外,反义PPO基因还降低酚物质含量以减轻块茎损伤褐化。     

玉米Zmcen基因的克隆、表达与生物信息学分析

为研究玉米Zmcen基因的特征及生物学功能,并对其编码蛋白结构与功能进行分析。以玉米c DNA为模板,将其构建到带有GST表达标签的原核表达载体p GEX-6p-1中,构建的重组载体p GEX-6p-ZmCen转化至大肠杆菌BL21(DE3),通过0.3 mmol/L IPTG在27℃下诱导表达20 h,获得了可溶性的GST融合蛋白。采用GST亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,经12%SDS-PAGE电泳和GST标签抗体Western Blotting检测,鉴定为含有GST-Tag的融合蛋白,纯化的蛋白经Pre Scission Protease(PPase)过夜酶切切除GST标签,得到较纯的ZmCen蛋白;同时利用生物信息学的方法,解析ZmCen蛋白质的结构特征。结果表明,该基因定位于玉米第7#染色体上,全长基因含有6个外显子和7个内含子,519 bp的开放阅读框,编码172个氨基酸,分子量约为19.78 k Da,等电点为4.78。采用maize GDB数据库对玉米整个生命周期的表达水平进行分析表明,细胞分裂旺盛的部位,Zmcen基因的表达量较高。对16种植物进行系统发育树分析显示,Zmcen基因与水稻、小麦、拟南芥等的centrin基因同源性高达80.21%,该结果为探索Zmcen蛋白的未知生物学功能提供了线索。     

转基因纯合四倍体马铃薯多酚氧化酶活性及同工酶谱的变异

选择14个已插入反义PPO基因的纯合四倍体马铃薯“GD-9-qc”系列,进行叶片、微型薯PPO活性检测和同工酶分析,结果表明,不同品系间的叶片、微型薯PPO活性存在极显著差异,其中2个品系的叶片及8个品系的微型薯PPO活性明显低于对照;供试转基因品系间的叶片PPO同工酶谱带的颜色深浅表现差异,所示结果与PPO活性检测基本一致;     

3种化学物质诱导马铃薯块茎抗早疫病的初步研究

利用苯酚、对氨基苯甲酸和苯甲酸等3种芳香族类化合物作为激发子,对马铃薯块茎抗早疫病的效果进行了探讨,同时分析了诱导处理后马铃薯块茎中与抗病性相关的酶活性的变化。结果表明,供试的3种化合物均在较低浓度下具有较强的诱导抗病作用,苯酚、苯甲酸和对氨基苯甲酸分别在1,0.01和5 mmol/L时诱导的保护率最高,分别达到43.21%,40.72%和28.75%,均与对照差异极显著。经上述浓度的3种化合物诱导处理后的马铃薯块茎中,过氧化物酶(POD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性均有大幅度上升,明显高于对照,表明这些芳香族类化合物可能通过增加马铃薯体内POD和PAL的活性来发挥其诱导抗病作用。