鹅脂联素基因的克隆、序列分析及组织表达

根据GenBank发表的鸡和鸭等物种的脂联素基因序列的同源保守区域,设计了3对特异性引物,以鹅(Anser domeatica)血液基因组DNA为模板,经扩增、测序及拼接得到了部分DNA序列,全长1062bp,包含2个外显子和1个内含子(GenBank Accession No.EU370686)。该基因编码区长738bp,编码245个氨基酸,编码区核苷酸序列及所编码氨基酸序列与鸭的同源性最高,分别为94.85%和95.51%,与鸡的同源性次之,而与哺乳类的同源性较低。蛋白预测的分子量和等电点分别为26603.3D和5.19,与鸡、鸭、人及小鼠的脂联素蛋白相似。半定量PCR结果显示鹅脂联素基因在骨骼肌、脂肪、心脏和肌胃中高度表达,在小肠、腺胃、肾和肺中中度表达,而在肝脏、脾、卵巢和间脑中低度表达。     

西农萨能奶山羊脂联素受体1基因(AdipoR1)cDNA克隆、表达及功能分析

脂联素(adiponectin)具有改善胰岛素敏感性,调节脂肪酸代谢和参与细胞增殖和分化的功能。本研究参考Gen Bank中已收录的牛(Bos taurus)、小鼠(Mus musculus)和人(Homo sapiens)等物种脂联素受体1基因(adiponectin receptor 1,Adipo R1)序列的同源比对结果,设计和合成PCR扩增引物,采用反转录PCR和RACE技术,分离并克隆了西农萨能奶山羊(Capra hircus)Adipo R1的c DNA序列。结果显示,Adipo R1全长2 032 bp(Gen Bank登录号:HQ846828),包括开放阅读框(open reading frame,ORF)1 128 bp,3’非翻译区(untranslated regions,UTR)719 bp和5’UTR 185 bp,该基因编码375个氨基酸。通过氨基酸序列比对发现,山羊与牛、猪(Sus scrofa)、小鼠和人的Adipo R1相似性较高,均在95%以上。蛋白质结构分析表明,其蛋白质的分子量为42.44 k D,等电点为7.19,含7个跨膜结构域,并且整个序列中不含信号肽。组织表达分析显示,该基因在肺中的表达量最高,小肠次之,在心脏中表达量最低,而其余8个组织中Adipo R1m RNA水平变化则比较平缓;奶山羊乳腺组织中Adipo R1表达量分析表明,Adipo R1的表达量在干奶期和泌乳盛期乳腺组织差异显著(P<0.05)。用不同浓度胰岛素(insulin)和催乳素(prolactin)处理奶山羊乳腺上皮细胞,结果发现,用胰岛素处理乳腺上皮细胞后,Adipo R1的表达量下调,在胰岛素浓度为50 nmo/L时效果最明显(P<0.01);用催乳素处理乳腺上皮细胞后,Adipo R1的表达量上升,在浓度为100 mg/m L时作用最明显(P<0.05),表明该基因在奶山羊乳腺上皮细胞中具有一定的调控作用。本研究为进一步揭示Adipo R1基因在奶山羊乳腺组织中的功能提供基础资料。     

鹅生长激素基因的克隆和组织表达

根据鸡的生长激素基因(GH)序列设计引物对鹅总RNA进行RT-PCR反应，将扩增片段进行克隆和测序。结果获得了包括从ATG开头到TGA结尾的651bp的鹅GH基因编码区序列。鹅与鸡的GH基因的编码区高度保守，同源性达92％，演译成氨基酸后同源性达96％；与人和鼠GH基因编码区序列同源性分别为63．81％和74．31％，演绎成氨基酸后同源性分别为52．51％和72．81％。同时用RT-PCR和Northern-blot对鹅12种组织表达差异分析表明鹅GH基因只在垂体和下丘脑中表达。在心脏、肺、肝脏、小肠、胃、腿肌、脾、肾脏、脂肪和睾丸中都不表达。     

猫白介素-18基因的克隆、序列分析及其表达

用猫白介素18(interleukin,IL-18)基因特异性引物对刀豆蛋白(ConA)刺激后猫外周血单核细胞(PBMCf)总RNA进行了RT-PCR扩增,并将扩增产物纯化后克隆入pMD18-T中进行核苷酸序列测定。结果该基因全长579bp,编码192个氨基酸(GenBank登录号:DQ100372)。在推导的猫IL-18氨基酸序列中,无信号肽序列和潜在的N-联糖基化位点,但存在4个Cys残基。与不同物种IL-18相比,猫IL-18与犬、羊、牛和猪IL-18核苷酸序列有较高的同源性,分别为89.8%、88.6%、88.4%和88.1%,但与小鼠和鸡IL-18有明显的种属差异。将目的基因片段进一步亚克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET28a中构建了重组质粒pETIL-18,转化大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG诱导。结果重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到分子量为27.5kD的重组目的蛋白。经凝胶薄层扫描,目的蛋白表达量可占菌体蛋白的13.6%。     

香鱼抗凝血酶基因(AT)cDNA的克隆、序列分析及组织表达特征

抗凝血酶(antithrombin,AT)主要抑制凝血酶(thrombin)及其它凝血因子的活性,并具有重要的抗炎活性。本实验从香鱼(Plecoglossus altivelis)肝组织cDNA文库中成功获得了香鱼AT基因的cDNA全序列(EMBL登录号:FN429980)。测序结果表明,香鱼AT基因cDNA全长1487个核苷酸,包含1个大的开放阅读框(ORF),推测编码1个由453个氨基酸组成的蛋白,N端23个氨基酸为信号肽序列。成熟AT具有与哺乳动物AT相似的特征结构,包括:羧基末端附近的丝氨酸蛋白酶活性中心、6个保守的Cys残基形成的3个二硫键结构和4个N-糖基化位点。氨基酸序列分析表明,香鱼AT与大西洋鲑(Salmo salar)AT氨基酸序列同源性最高,为81%。系统进化树分析表明,物种AT的进化关系与目前接受的物种分类关系基本一致,香鱼AT位于鱼类AT簇中,与大西洋鲑、红鳍东方豚(Takifugu rubripes)和斑马鱼(Danio rerio)AT进化相关性最高。AT mRNA在健康香鱼的肝组织中表达量最大,在脾、肾和脑中表达量较低。实时荧光定量PCR结果表明,在鳗利斯顿氏菌(Listone...     

小白鼠乳铁蛋白基因cDNA克隆及序列分析

乳铁蛋白(LF)是哺乳动物母乳中含量丰富的一种天然铁结合蛋白，广泛分布于具有分泌功能的组织及其分泌物中。许多研究表明，LF可以抵御细菌病毒的侵染并调节机体免疫功能，成为母畜乳腺和仔畜胃肠道的一种防御屏障；能够促进肠道细胞对铁离子的吸收和利用；另外还有关于LF可以抗氧化和促进肠道有益菌群生长的报道。     

草鱼过氧化氢酶全长cDNA的克隆、序列同源分析与组织表达

过氧化氢酶（catalase,CAT）是生物体内抗氧化防御系统的关键酶之一,在清除过氧化氢而避免机体产生氧化应激的过程中起重要作用。本研究从草鱼（Ctenopharyngodon idellus）肝胰脏中克隆了CAT完整编码序列（complete coding sequence,CDS）。该CAT序列（GenBank登陆号：FJ560431）全长2263bp,包括完全开放阅读框（ORF）1575bp、5＇非编码区（UTR）118bp和3＇UTR570bp。其ORF编码525个氨基酸残基,理论分子量为59.59kD,等电点为7.02。在草鱼CAT cDNA的终止密码子附近,其3＇UTR具有长且完整的AC重复序列,与斑马鱼、鲢鱼及啮齿类动物CAT的3＇UTR AC重复序列相似。序列比较表明,草鱼CAT的核苷酸及推测氨基酸序列与其它多种物种的一致性均较高,其一致性分别为93.4%～43.0%和98.1%～63.3%。同时,草鱼CAT cDNA的推测氨基酸序列具有与其它动物高度保守的特征性基序,包括亚铁血红素结合信号序列＂RLFSYPDTH＂、酶活性中心序列＂FDRERIPERVVHAKGA＂及3个催化位点残基His74、Asn147和Tyr357。此外,草鱼CAT还具有保守的亚铁血红素结合口袋与NADPH结合位点。根据草鱼CAT基因的上述特征,推测其属于CAT基因家族中的单功能或典型CAT基因亚群。采用实时荧光定量PCR（Q-PCR）检测草鱼CAT的组织表达特征。结果显示,草鱼CATmRNA在所检测的11种组织器官中均有表达,其中在肝中表达水平量较高,在红肌、白肌和脂肪中表达量较低。本研究结果将有助于进一步探讨鱼类CAT基因的结构与功能,并为研究其抗氧化分子机理奠定基础。     

绵羊PGRMC1蛋白的cDNA克隆、序列分析及组织表达

孕激素受体膜组分1 (progesterone receptor membrane component 1,PGRMC1)是膜相关孕激素受体蛋白家族成员之一,参与哺乳动物颗粒细胞和黄体细胞孕酮的抗凋亡过程,在促进卵母细胞成熟和维持卵巢机能方面具有重要作用.本研究通过RT-PCR对绵羊(Ovisaires)PGRMC1基因进行了克隆和组织表达谱分析,并利用实时荧光定量PCR对该基因在繁殖特性上存在明显差异的两个绵羊品种——多浪羊(常年发情)与中国美利奴羊(季节性繁殖)发情期和乏情期性腺轴组织的表达情况进行了检测.结果获得了绵羊PGRMC1基因部分cDNA序列(GenBank登录号:KM114208),其中编码区(Coding sequence,CDS)全长585 bp,编码194个氨基酸.其编码蛋白中包含一个Cyt-b5保守结构域.该基因在所检测绵羊各组织中广泛表达,其中以卵巢、子宫、肝脏、肾脏和下丘脑组织表达丰度较高.实时荧光定量PCR结果显示,同一绵羊品种发情期子宫、卵巢和松果体PGRMC1 mRNA水平均高于乏情期;不同绵羊品种间性腺轴组织基因表达水平存在一定差异,无论是发情期还是乏情期,多浪羊子宫、卵巢和松果体中PGRMC1 mRNA水平均高于同期的中国美利奴羊.本研究结果表明,PGRM C1在维持绵羊子宫与卵巢机能、调节激素分泌和发情行为等方面可能发挥重要作用.为进一步了解PGRMC1的生物学功能提供一定的理论依据.     

家蚕多聚泛素基因的电子克隆、序列分析及表达谱预测

具选择性蛋白质降解功能的泛素在昆虫生长发育过程中起着重要的调控作用。本研究采用电子克隆的方法钓取家蚕基因组中多聚泛素基因序列,命名为Bm-polyUB（GenBank登录号：AADK01019318）,并进行序列分析和电子表达谱预测。序列分析表明,该编码区长3426bp,编码1141个氨基酸残基的15聚体,预测分子量和等电点分别为127.97kD和7.33,二级结构中α-螺旋、延伸带、β-转角和无规则卷曲各占17.09%、32.78%、14.37%和35.76%,亚细胞定位于细胞质、细胞核和线粒体各占43.5%、34.8%和21.7%,无前导肽、信号肽和跨膜区;多重序列比对显示,15个泛素单体基因序列间同源性和遗传距离分别介于89.0%～100.0%和0.000～0.120,其中Bm-UB3与Bm-UB10、Bm-UB5与Bm-UB7及Bm-UB10与Bm-UB14的序列相同;遗传多样性分析可见,共检出33个多态性位点,共生成12个单倍型,单倍型多样性（Hd=0.962）、平均核苷酸差异数（K=7.495）、核苷酸多样性（Pi=0.03287）、密码子有效值（ENC=41.623〈61）、偏爱指标（CBI=0.496〉0）和χ2检验计算（χ2=0.713）显示泛素单体间遗传多样性较丰富且呈现较强的密码子偏爱性;电子表达谱预测结果表明Bm-polyUB基因在家蚕中高表达的组织和发育阶段所占比例显著高于低表达。本文的研究结果可为进一步开展该基因进化机制、表达特性和生理功能等方面的实验研究提供基础资料。     

鹅肌球蛋白重链1基因MyHC1全长cDNA克隆、序列及胚胎期表达特征分析

肌球蛋白是组成肌原纤维粗丝的主要成分,在肌肉生长发育和运动收缩过程起重要作用。本研究采用反转录PCR和快速扩增cDNA末端(rapid amplification cDNA ends,RACE)方法,从太湖鹅(Anser anser)肌肉中克隆到肌球蛋白重链1基因(myosin heavy chain 1,MyHC1)的全长cDNA,并运用生物信息学的方法对其进行分析,实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR)检测MyHC1基因在鹅胚胎期的表达情况。研究结果表明,鹅MyHC1基因(Gen Bank登录号:KM675469)cDNA全长6028 bp,包含5 823 bp的开放性阅读框,57 bp的5’端非编码区和148 bp的3’端非编码区,共编码1 940个氨基酸。经预测,鹅MyHC1基因编码的蛋白质由31 478个原子组成,分子式为C9746H15817N2753O3096S66,相对分子质量为223 kD,等电点为5.62,平均亲水性为-0.786,属于不稳定亲水蛋白。在线预测鹅和鸡(Gallus gallus)的MyHC1蛋白质三维结构呈高度相似,由多螺旋和折叠片聚集成球状头部,并带有长纤维状α-螺旋尾部。鹅MyHC1的编码区(coding sequence,CDS)序列与鸡的同源性最高,为92.86%,与哺乳类同源性多数在84%左右,与两栖类同源性相对较低。鹅与鸡氨基酸同源性最高,为96.45%,与哺乳类的同源性多数在90%左右,与非洲爪蛙(Xenopus laevis)同源性较低,为78.13%。系统进化树分析表明,哺乳动物形成一个大分支,两栖类自成一支,鹅和红原鸡聚成一支,分子进化地位的关系最近,验证了鹅和鸡属于近缘物种。qRT-PCR检测到MyHC1基因在胚胎期第7天开始表达,以后表达量逐渐升高,在15d表达量达到高峰后下降,25d之后逐渐趋于平稳,表明,MyHC1基因在鹅胚胎期mRNA水平的表达量呈先上升再下降的趋势。本研究首次获得了鹅MyHC1的全长cDNA序列、分子的结构特点和表达特征,显示该基因在鹅肌肉生长发育过程起重要作用,为该基因的功能及鹅肉质性状研究提供了基础资料。     

番茄中一个LSm1蛋白同源基因LeLSm1的克隆及表达分析

从番茄品种超级大明星中克隆LSm1蛋白同源基因LeLSm1。LeLSm1基因全长cDNA共有1 038个核苷酸,包含一个387个核苷酸的编码区,以及318个核苷酸的5′非编码区和333个核苷酸的3′非编码区,编码一个含128个氨基酸的蛋白质,分子质量为14.5 ku,等电点为4.94。LeLSm1编码的氨基酸序列包含LSm1蛋白的保守功能域,与截形苜蓿、拟南芥和水稻等植物的类似LSm蛋白具有高度的同源性,在氨基酸水平上的一致性依次为82.8%、82.0%和72.1%。用PCR方法克隆了LeLSm1基因,其全长转录区共4 751 bp,其中包含5个外显子和4个内含子。Southern杂交结果显示,LeLSm1是单拷贝基因。半定量RT-PCR分析表明,LeLSm1在番茄五叶期和结果期的根、茎、叶以及花和果实中均有表达,且表达量无明显差异,是一个组成型表达基因。     

人胰腺激肽释放酶cDNA的克隆、序列分析和原核表达

摘要: 为了研制人激肽释放酶（KLK1）特异单克隆抗体和进行重组酶的鉴定及纯化，根据已发表的人KLK1序列设计引物，用PCR扩增法从人胰腺单链cDNA库中特异地扩增出KLK1 cDNA。将其克隆入pGEM-T载体中,对5个重组质粒进行了序列测定，其中1个cDNA克隆的核苷酸序列与已发表的人肾/胰/唾液腺KLK1 cDNAs序列完全相同或有3个核苷酸差异。将去除信号肽序列的KLK1 cDNA以正确阅读框插入表达载体pGEX-4T-3,构建成重组质粒pGEX-KLK1。此重组质粒转化的E.coli 经IPTG诱导后表达分子量为48 kDGST-KLK1融合蛋白，表达产物主要以不溶性包涵体形式存在，可溶性部分能被Glutathione Sepharose 4B特异吸附，两者都能被GST特异单克隆抗体识别。用SDS-PAGE分离纯化的融合蛋白免疫小鼠，获得的抗血清的ELISA效价为1∶1600。结果表明，克隆的人KLK1 cDNA及其表达产物是正确的，可以用于人KLK1单克隆抗体的制备。     

猪MYL4基因的克隆及其在猪胚胎骨骼肌中的差异表达分析

克隆了猪MYL4基因的cDNA序列,并利用生物信息学方法进行验证。所得cDNA序列全长1105bp,包含一个完整的开放阅读框,编码197个氨基酸。序列分析表明,该基因与已报道的狗、人、黑猩猩和恒河猴等物种的MYL4基因高度同源,氨基酸序列同源性分别为98.4%、95.9%、95.4%和95.4%。该基因编码的蛋白具有EFH和FRQ1保守功能域。荧光定量分析该基因在猪胚胎骨骼肌（妊娠33 、65 和90 天）中的表达规律,发现MYL4基因在通城猪和长白猪中呈波浪式表达模式,在妊娠第33 天时中外猪品种间无显著差异,但在65 和90 天时长白猪中显著高于通城猪。     

杂种和纯种猪之间脂肪组织差异表达基因的分离、克隆和序列分析

实验选取中国地方品种梅山猪和外国品种大白猪进行正反向杂交产生杂种梅大和大梅猪，用mRNA差异显示技术，分析了亲本和杂种猪背部皮下脂肪组织间基因差异表达。结果发现，在10条5＇端随机引物和10条3＇端锚定引物共100对引物组合的差异显示扩增下，共获得l500多条可重复的扩增条带，选取其中能够重复出现的40条差异表达带（在4组样本中不能同时出现的条带）进行重扩增、克隆并测序。通过GenBank／BLAST比对发现，其中有4条EST分别与GenBank序列同源性较高，其余36条属于新的EST，将这36条EST提交GenBank获得注册号，并选取其中的3条进行半定量RT-PCR验证并检测其相对表达，其中2条表现不同程度的差异，l条没有明显差异。为提高DDRT-PCR真阳性，实验中的4种组合各屠宰6头以建立RNA池，采取低高严谨结合的退火温度进行差异显示扩增以及只回收在2次PCR扩增均能重复出现的条带。结果表明，所获得的36条新的EST在亲子代之间的差异表达方式不尽相同，这些差异表达的基因可能与脂肪组织杂种优势的形成有关。     

橘色双冠丽鱼TYR基因的克隆及其发育时序和组织表达分析

酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)是动物体内黑色素合成信号通路中起关键性作用的限速酶,黑色素生成的速度和种类取决于TYR基因的表达量和活性水平.为了解色素相关基因与体色变化的关系,采用cDNA末端快速克隆技术(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术获得橘色双冠丽鱼(Amphilophus citrinellus) TYR基因cDNA全序列,并利用qRT-PCR分析了橘色双冠丽鱼体色变化不同时期和不同组织中TYR基因的表达差异.实验获得cDNA全长序列2 683 bp,其中阅读框1 620bp,编码540个氨基酸,5'UTR区246 bp,3'UTR区817 bp.氨基酸序列和系统发育分析表明,相比与脊椎动物间的保守性,TYR蛋白序列在鱼类间的保守性更高.qRT-PCR结果表明,TYR基因在胚胎各期均有表达,受精期表达量最低,血液循环期开始急速上升;在“黑色-灰色-亮黄色”三个典型体色褪黑过程中,各组织TYR基因表达量均在黑色期呈现最高值,显著高于灰色和亮黄色期,灰色到亮黄色时期鳞片和尾鳍的TYR基因表达量逐渐降低,但差异不显著(P＞0.05),而皮肤组织的TYR基因表达量在三个体色褪黑期均显著降低(P＜0.05);亮黄色时期,TYR基因在心、肾、脑、鳔、性腺、尾鳍和眼等组织均有表达,其中眼部表达量最高,其次是鳔和尾鳍,皮肤和性腺表达量最低.橘色双冠丽鱼TYR基因在三个典型体色褪黑期表达逐渐降低,可能与红色素细胞和黄色素细胞逐渐增多以及黑色素细胞数量和分布比例发生变化相关.本研究通过了解体色变异的分子基础,为鱼类体色遗传和体色改良研究积累资料.     

氯粘康酸环异构酶基因克隆及序列研究

研究从土壤中分离出1株降解2,4-二氯酚能力较强的假单胞菌菌株“GT241-1”,并从中克隆出参与降解2,4-二氯酚的氯粘康酸环异构酶基因(dcpC),该基因编码的氯粘康酸环异构酶可将2,4-二氯-顺,顺-粘康酸转化为反式-2-氯-双烯内酯。采用的基因克隆策略是用Southern杂交对其邻近基因进行定位后构建基因组文库,再用斑点杂交从基因文库中筛选目的转化子。经序列测定得知dcpC基因编码区1110bp,且核苷酸和推测的编码氨基酸序列分析表明dcpC属氯粘康酸环异构酶基因家族,并与该基因家族的其他基因有一定差异。     

口蹄疫病毒3AB基因的克隆与原核表达

根据口蹄疫流行毒株设计一对包含3AB部分基因编码区的特异性引物,扩增出3AB基因550 bp的特异带,并将纯化的扩增产物克隆到pM D 18-T载体上。再用设计的酶切位点将3AB基因分别连接到两种原核表达载体上,构建了重组质粒pETCK S-3AB及pET 28a-3AB,转入BL 21菌中进行原核表达。SDS-PAGE电泳表明,3AB基因在两种表达系统中均高效表达。对表达的蛋白通过包涵体及切胶纯化的方法进行纯化,获得了高纯度的3AB蛋白。     

猪Fas基因的克隆及序列分析

从PK-15细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出猪F as基因,将其克隆到PM D 18-T载体上,进行序列分析。结果表明,克隆的猪F as基因序列与G enB ank上登录的猪F as基因同源性为100%,与人、牛、羊的F as基因核苷酸及推导的氨基酸序列同源性分别为73.4%、79.2%、76.4%和56.2%、67.0%、64.6%。F as蛋白胞内区的死亡域,其氨基酸序列在猪、人、牛和羊的F as基因中呈现较高的同源性。