鄱阳湖通江水道翘嘴鲌(Culter alburnus)的生物学参数估算

利用2012年3月-2013年2月在鄱阳湖通江水道进行的定置网渔获物调查的数据,运用软件FiSAT II对翘嘴鲌(Culter alburnus)的生长参数以及种群补充模式进行了估算。结果显示,鄱阳湖通江水道翘嘴鲌体长范围为93-645 mm;体长(L, mm)和体重(W, g)的关系式为W = 0.9×10-5L3.029 (R2=0.975, n = 317),von Bertalanffy生长方程的各参数：渐近体长L∞= 677.25 mm,生长系数K= 0.140,理论生长起点年龄t0 = -0.854。总死亡系数Z=1.514/a,自然死亡系数M=0.173/a,捕捞死亡系数F = 1.341/a。鄱阳湖通江水道翘嘴鲌开发率E=0.886,资源处于过度利用状态。种群补充模式表明,鄱阳湖通江水道翘嘴鲌种群补充期在4–8月。因此,建议适当延长鄱阳湖的禁渔期,以利于其资源的恢复与保护。     

鄱阳湖翘嘴鳜规模化育苗技术

永修县地处鄱阳湖畔，水产资源丰富。该县根据江西水产优势产业发展统一规划，从1999年起着力调整养殖品种结构，大力发展鳜鱼人工繁殖，目前年繁育已突破百万尾，现将相关操作技术总结如下。     

鄱阳湖翘嘴鳜规模化繁育及健康养殖技术综述

优选野生鄱阳湖翘嘴鳜成熟个体为亲本,强化培育至5月初开展人繁。♀:♂=1∶1~1.5,一次性注射混合激素,自然产卵,雌体剂量为LRH-A10~12ug HCG700~800 IU/kg。水温23~25℃时效应时间25~27h,催产率90~100%,受精率50~60%,孵化率85%以上,水温24~26℃需30~31h出膜。采用同步繁殖的团头鲂苗作开口饵料鱼,采取投喂充足的适口饵料鱼、严防低溶氧综合症和NH3-N中毒、遍洒福尔马林和硫酸铜防治原虫病等措施,育苗成活率由20%提高到60~70%。针对滨湖地区和自然水体野杂鱼丰富的特点,总结了池塘套养、自然水体混养和网箱养殖商品鳜模式,探讨了池塘主养及饵料鱼配套技术,建立了健康养殖操作规程。     

基于转录组测序对翘嘴鳜(Siniperca chuatsi) 2种肌球蛋白重链基因的克隆与分析

肌球蛋白重链(Myosin heavy chain,MYH)是骨骼肌粗肌丝的重要组成单位,其表达量高低影响肌纤维的组成和肌肉生长.为了解其在翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)早期生长过程中的作用,本研究从前期生长差异显著的2组(快长组和慢长组)翘嘴鳜幼鱼转录组差异表达Unigene中筛选出2个MYH基因,RACE (Rapid amplification of cDNA ends)克隆到其全长cDNA(MYH-7a,MYH-7b).MYH-7a全长为6071bp,开放阅读框为5820 bp;MYH-7b全长为5896 bp,开放阅读框为5745 bp.序列分析显示,2个MYH均有Loopl、Loop2环、ATP结合位点等关键结构域;进化树聚类分析显示,MYH-7a与MYH-7b均属于慢肌球蛋白.实时荧光定量PCR验证发现,其在快长组样本中表达量显著高于慢长组,与转录组测序结果一致;检测其在翘嘴鳜心肌、红白肌和皮肤等14种组织的表达水平,结果显示,MYH-7a主要在心肌中表达,而MYH-7b主要在红肌中表达;在胚胎发育不同阶段,二者随着胚胎发育的进行,表达量不断增加;在幼鱼早期生长过程(孵化出膜后15 dph、30 dph和60 dph)的翘嘴鳜白肌中,在15 dph和30 dph快长组的表达量显著高于慢长组,而到60 dph时快长组的表达量均显著低于慢长组.翘嘴鳜MYH-7a、MYH-7b在快长组与慢长组鱼中的差异表达提示它们在翘嘴鳜胚胎及其早期生长发育过程中发挥重要作用.     

鄱阳湖刀鲚繁殖群体生物学参数及生长特性的初步分析

基于渔业资源调查数据,运用软件FiSATⅡ分析了鄱阳湖刀鲚繁殖群体的生物学参数及生长特性。分析结果表明,鄱阳湖刀鲚体长16.0~38.1cm;体长和体质量的关系式为m=0.002L3.139(r=0.949;P0.05;n=1014),von Bertalanffy生长方程的各参数为:渐近体长为40.95cm,生长系数为0.240,理论生长起点年龄t0=-0.568。鄱阳湖刀鲚的拐点体质量为67.94g,平均丰满度为0.29±0.04(0.14~0.49),总死亡系数为1.36a-1,自然死亡系数为0.52a-1,捕捞死亡系数为0.84a-1。鄱阳湖刀鲚开发率为0.61,处于资源过度利用状态。     

翘嘴鳜人工繁殖及苗种培育试验

2012年5月开展了翘嘴鳜人工繁殖和苗种培育试验,催产10组,催产率100%,获受精卵65万粒,受精率85%,出苗52万尾,孵化率80%,育成乌仔36万尾,夏花22万尾,成活率42.3%。     

水库网箱养殖翘嘴鳜的试验

网箱规格6×5×3 m,实行二级放养,投放规格为7~8 cm/尾的翘嘴鳜鱼种2.3万尾。经183 d养殖,期间并驯化其由摄食活鱼为摄食死鱼而降低养殖成本,平均规格0.478kg/尾,最大个体为1.0kg/尾。共生产商品鱼8800kg,平均成活率80%,平均饵料系数4.2;投入产出比为1:1.95,取得良好的经济效益。     

翘嘴鳜、斑鳜及F_4代杂交鳜繁殖性能比较研究

为全面了解第4代杂交鳜的繁殖性能,对杂交鳜及其杂交亲本翘嘴鳜、斑鳜等3个群体进行了自群繁殖,并对各群体繁殖相关性状进行了比较。结果显示,杂交鳜与翘嘴鳜间的催产率、受精率及孵化率无显著差异或差异较小,且均显著高于斑鳜(P0.05);杂交鳜的相对怀卵量居于翘嘴鳜与斑鳜之间水平;杂交鳜与斑鳜的卵粒质量无显著差异,均显著大于翘嘴鳜(P0.05);研究结果表明,经过多代选育,由种间远缘杂交而获得的杂交鳜的繁殖性能已从杂种退化中得到恢复,并已接近翘嘴鳜。     

pH对大眼鳜和翘嘴鳜蛋白酶活性的影响

研究了不同pH值对大眼鳜消化道不同部位蛋白酶活性的影响及在最适pH条件下与翘嘴鳜消化道蛋白酶活力的差异。结果表明,大眼鳜消化道不同部位蛋白酶的活性强弱顺序为:幽门盲囊>胃>前肠>后肠,其最适pH分别是:10.4、2.8、9.5、10.1。翘嘴鳜的胃和幽门盲囊蛋白酶活力明显高于大眼鳜(P<0.01),而肠的蛋白酶活力略低,差异不显著(P>0.05)。     

鳜IRAK4基因的克隆、组织表达及病毒感染后表达分析

为了研究鳜IRAK4生物学特性及其在抗病毒免疫应答中的作用,根据鳜转录组数据中筛选出的IRAK4 unigene序列设计引物,利用SMART-RACE技术克隆得到CDS全长为1389 bp的c DNA(命名为Sc IRAK),编码462个氨基酸,含有1个N端死亡结构域和1个保守的中央蛋白激酶结构域。采用荧光定量RT-PCR方法分析了Sc IRAK4在健康鳜各组织中的表达差异及病毒感染后在脾脏中的表达变化,结果显示,健康鳜中Sc IRAK4在肝脏中表达量最大,与其他组织差异显著,而在血液、脑和胃中表达量最低;传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)感染鳜后Sc IRAK4的表达量呈现下调趋势,24 h脾脏中的表达量达到最低,为对照组的45%;而鳜弹状病毒(siniperca chuatsi rhabdovirus,SCRV)感染鳜后Sc IRAK4的表达量呈现上调趋势,12 h脾脏中Sc IRAK4的表达量达到最高,为对照组的8.17倍,表明Sc IRAK4在抗ISKNV和SCRV的免疫应答中可能发挥不同的作用。本研究为进一步揭示Sc IRAK4的抗病毒免疫反应机制提供了依据。     

发酵鳜鱼营养成分和安全性评价

为探索人工接种、混菌发酵鳜鱼 (Siniperca chuatsi) 技术,弥补传统发酵鳜鱼较为粗放、经验式的加工方式,提升产品品质,将菌种混合接种于鳜鱼进行发酵,通过单因素和响应面试验对发酵工艺条件 (发酵温度、发酵时间、菌种配比和发酵剂接种量) 进行优化,测定产品水分、pH、氨基态氮、总酸、硫代巴比妥酸的反应值 (TBARS) 和挥发性盐基氮 (TVB-N) 含量,并与传统自然发酵鳜鱼产品比较,探究接种发酵对发酵鳜鱼品质的影响。结果显示优化后的最佳鳜鱼发酵工艺为：按m[戊糖片球菌 (Pediococcus pentosaceus)]∶m[清酒乳杆菌 (Lactobacillus sakei)]∶m[肉葡萄球菌 (Staphylococcus carnosus)]=1∶1∶3混合,接种量为1.0%,发酵温度22 ℃,发酵时间为4 d。对比自然发酵鳜鱼,接种混菌发酵鳜鱼的水分质量分数和pH分别下降了2.04%和0.46%,在较短发酵时间内其氨基态氮质量分数与自然发酵鳜鱼相近,总酸质量分数增加了29.27%,TBARS和TVB-N质量分数分别下降了35.00%和53.10%。整体而言,接种混菌有助于改善发酵鳜鱼的品质和安全性,缩短发酵时间,控制发酵工艺。     

广东与江西翘嘴鳜养殖与天然种群的遗传多态性分析

对翘嘴鳜4个人工繁殖群体［江西南昌国家级翘嘴鳜原种场(1个群体)、广东南海人工繁殖群体(2个群体)、广东惠州人工繁殖群体(1个群体)］及2个天然群体(江西鄱阳湖养1个月;江西鄱阳湖养2~3 d)共60尾的线粒体控制区（D-loop）核苷酸序列进行扩增后测序和遗传多态性分析。采用特异性引物对翘嘴鳜基因组进行PCR扩增,得到翘嘴鳜线粒体DNA控制区基因的全序列(833 bp)。分析得到的D-loop区碱基序列中60个个体共检测到65个变异位点,其中43个是单一变异位点,22个为简约信息位点。60个个体共检测出22个单倍型。分析结果表明,江西两个天然群体基因交流充分,未出现遗传分化,但相对江西省翘嘴鳜原种,广东省翘嘴鳜养殖种群多态性偏低。因此,广东省从其他省鳜鱼原种场引进翘嘴鳜原种是非常有必要的,这对我国集约化主产区广东省的鳜鱼产业向高效、优质的方向持续健康发展具有重要意义。     

鳜胚胎细胞系的建立与应用

为更好地开展鳜基因功能研究和药物筛选工作,提高基因转染效率,本研究以鳜囊胚期胚胎为材料,采用含有20%胎牛血清的DMEM培养基进行培养,建立了生长稳定的鳜胚胎细胞系MFE。在此基础上,采用绿色荧光蛋白(GFP)作为标记物,在HEK293T细胞中体外包装逆转录病毒,再感染MFE细胞系。MTT法分析表明传代后细胞培养96 h内,细胞生长率变化也经历增殖、降低到达稳定期。而且MFE细胞能稳定表达GFP基因,感染效率为20%±5%,而脂质体转染效率为3%±2%。可见包装病毒感染细胞不仅能获得稳转细胞系,效率也远高于脂质体瞬时转染。荧光定量PCR分析表明,MFE细胞系能表达Irf1、Irf3和Irf7基因,Irf1基因表达量最高。MFE细胞系受到poly I:C刺激后,Irf1、Irf3和Irf7的表达量分别升高3.5,2.3和2.1倍。因此,MFE细胞通过病毒感染可以获得较高的转染效率,该细胞可作为鳜免疫相关基因功能研究的工具。     

鳜传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为了建立鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)疫苗抗原含量的ELISA检测方法,制备了3株抗ISKNV主衣壳蛋白(MCP)的单克隆抗体,鉴定了其生物学特性。将大肠杆菌表达的重组MCP纯化复性后,连续3次免疫BALB/c小鼠,然后将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,经过克隆、筛选,获得3株能稳定分泌抗ISKNV MCP蛋白的单克隆抗体阳性细胞株,分别命名为5F1、3D9和5B4,均为Ig G1亚型。间接ELISA实验表明,3株单抗可特异性识别ISKNV,与鳜弹状病毒、大鲵虹彩病毒等无交叉反应。将5F1株免疫小鼠后制备腹水,以重组MCP和ISKNV细胞培养物上清液为检测抗原,ELISA检测腹水效价分别为1∶51 200和1∶400。间接免疫荧光(IFA)和Western Blotting鉴定结果显示,5F1能够与ISKNV病毒发生特异性反应,并初步确定5F1单抗株制备的腹水用于IFA的使用浓度为1∶200、Western Blotting的使用浓度为1∶1000。结果证实,成功制备了抗ISKNV MCP的单克隆抗体,可特异性识别ISKNV病毒粒子和MCP蛋白,为建立ISKNV疫苗抗原含量检测方法奠定了基础。     

鳜脑神经元的原代培养与鉴定

目前鱼类神经细胞模型极少,物种间的差异性使鳜在细胞水平上的研究具有极大的局限性,为建立一种简单易行的鳜脑神经元细胞模型进一步研究鳜神经系统,本实验取3月龄鳜,联合胶原酶消化法和机械吹打法分离出鳜脑细胞,用含20%FBS的L15培养液制成细胞悬液接种在细胞培养瓶内,于28°C无CO₂培养箱中培养,3 d后更换培养基,待细胞贴壁长满瓶底后进行传代培养;采用Neu-N和β-tubulin免疫荧光细胞化学技术鉴定鳜脑细胞神经元纯度。结果显示,鳜脑细胞分离培养2 d后贴壁状态较好,随着时间延长,贴壁细胞增多,细胞突起相互连接,培养5 d后神经元胞体丰满,细胞数量明显增多,突起相互间形成了明显的神经网络。经Neu-N和β-tubulin免疫荧光细胞化学技术鉴定鳜脑神经元细胞纯度可达95%以上。研究表明,该鳜脑细胞的分离培养方法简单易行,且可获得高纯度的鳜脑神经元细胞。     

鳜T细胞表面受体CD4分子的克隆与表达分析

克隆了鳜T细胞表面受体CD4分子的cDNA序列并对其在组织/器官的表达进行了分析。鳜CD4分子的cDNA序列全长为2 356 bp,编码469个氨基酸。该CD4分子由4个免疫球蛋白样结构域(V1C1V2C2)构成的胞外区、一个跨膜区和一个包含保守的CXC基序的胞内区组成。系统进化分析表明,鳜CD4分子与同属于鲈形目的鲈CD4分子聚为一支,与鲈的相似性最高(57%),与鲤的相似性较低(34%)。序列比对分析显示,CD4分子胞外区存在多个保守性位点,如:C1结构域中的WTC基序、V2和C2结构域中的N糖基化位点等。同鸟类和哺乳类不同的是,鳜CD4分子在V1结构域中缺少由半胱氨酸(Cys)残基对形成的二硫键,而在V2结构域中存在一个额外的二硫键,这可能会改变CD4分子的空间构象,进而影响到CD4与MHC Ⅱ的结合以及后续的抗原诱导的T细胞活化等。荧光定量PCR分析表明,CD4 mRNA在鳜的胸腺中表达量最高,在脾脏中表达量最低。脂多糖腹腔注射8 h后,CD4 mRNA在鳜的胸腺、脾脏和头肾中都呈显著的上调表达(P<0.05)。     

基于CPB细胞扩增体系的鳜弹状病毒增殖条件的优化

为获知鳜弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus,SCRV)QY株在体外培养细胞中最适增殖条件,以鳜脑细胞系(Chinese perch brain cell line,CPB)为增殖体系,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)技术所测病毒拷贝数为判断指标,比较同步接毒和异步接毒2种接种方式以及病毒接种量、血清浓度等培养条件对病毒增殖的影响,确定SCRV-QY株在CPB细胞中的最适增殖条件。结果显示,单位体积病毒增殖量方面,异步接毒法优于同步接毒法,以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为10将病毒接种长满单层的CPB细胞中,28°C吸附1.5 h,用含2%胎牛血清的L15培养液于28°C培养时,病毒增殖量最高,为5.59×10~(10)拷贝/mL;而从单位成本所获病毒量考虑,同步接毒法筛选出的4种增殖条件单位成本所获的病毒产量优于异步接毒法,其中当MOI=0.03、胎牛血清终浓度为6%时,同步接种对数生长中期的CPB细胞,28°C恒温培养70 h后收获病毒液,单位成本所获病毒量最高,为4.88×10~(13)个拷贝/元。综上所述,本研究以病毒增殖量和培养基成本作为考量,优化SCRV-QY株的增殖条件,可为SCRV疫苗低成本、规模化生产提供理论依据。