莱克多巴胺单克隆抗体间接竞争ELISA检测方法的建立

用混合酸酐法将莱克多巴胺(Rac)与匙孔蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)偶联,经紫外光谱扫描确定偶联成功,测得偶联物Rac-KLH浓度为3.6 mg/mL,Rac-BSA浓度为6.2 mg/mL。以偶联物Rac-KLH作为免疫原,免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/O-Ag-14进行融合。以Rac-BSA作为包被抗原,经间接ELISA筛选出阳性细胞株,再用有限稀释法进行多次亚克隆,获得稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株1D9、1F3、2C11、5C3、3A10、4A8、6B7、6D5、7C11、7D3。其中单克隆抗体5C3和3A10间接ELISA效价1∶500 000,对莱克多巴胺的半数阻断浓度(IC50)均为3.98 ng/mL,对盐酸克伦特罗和沙丁醇胺的IC50均大于2 000 ng/mL;对盐酸克伦特罗和沙丁醇胺的交叉反应率均小于0.2%。间接竞争ELISA检测莱克多巴胺在0.5～100 ng/mL范围内为线性分布,确定的最低检测限为0.5 ng/mL。     

蓝舌病病毒重组VP7蛋白单克隆抗体制备及竞争ELISA检测方法的建立

为了建立蓝舌病(BT)的血清学诊断方法,本研究利用原核表达的蓝舌病病毒(BTV)血清型12型VP7纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,制备2株单克隆抗体(MAb),分别命名为BTV-2D10和BTV-4H7。IFA试验表明,2株MAb均能与BTV 24个血清型发生特异性反应,而与茨城病病毒(IBAV)、中山病病毒(CV)、赤羽病病毒(AKAV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛轮状病毒(BRV)、牛肠道病毒(BEV)、牛呼肠孤病毒(RV)及口蹄疫病毒(FMDV)无交叉反应,表明2株MAb均为BTV群特异性抗体。采用重组表达的VP7蛋白作为包被抗原建立的竞争ELISA方法证明,BTV-4H7 MAb对不同血清型BTV阳性血清具有良好的阻断效果,而对AKAV、IBAV、BRV和FMDV阳性血清无阻断作用。本研究建立的竞争ELISA方法与IDEXX公司的试剂盒检测包括65份已知背景血清和322份采自广西省的山羊血清样品,检测结果符合率分别达100%和98%。该竞争ELISA方法的建立为BTV抗体的监测提供了安全、快速、准确的技术手段。     

水泡性口炎病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为建立方便快捷的水泡性口炎病毒(VSV)检测方法,本研究以抗VSV单克隆抗体(MAb)为捕获抗体,兔抗VSV多克隆抗体为检测抗体,建立VSV双抗体夹心ELISA检测方法。结果显示,该方法的最佳工作条件为:抗VSV MAb 1A2的包被浓度为3.09μg/mL,兔抗VSV多克隆抗体和酶标抗体的工作浓度分别为5.16μg/mL和1∶5 000,以OD450nm≥0.231作为阳性判定标准。该ELISA方法对猪水泡病病毒、猪水疱疹病毒及羊传染性脓疱病毒等均无交叉反应;敏感度可达3.125μg/mL(101TCID50);其重复性变异系数小于10%。采用建立的ELISA方法与RT-PCR方法同时检测187份临床样品,符合率达到97.9%,具有良好的相关性。本实验建立的VSV双抗体夹心ELISA检测方法具有特异性好、敏感性高、成本低及方便快捷等优点,可以用于VSV的快速检测。     

小鹅瘟病毒胶体金层析检测卡的研究

参照李茂祥等人的方法提纯小鹅瘟病毒（Goose plague virus,GPV）,免疫小鼠,按常规方法获得3株GPV单克隆抗体。用胶体金标记提纯的GPV单克隆抗体288并制备金标棉,马抗GPV多克隆抗体和羊抗鼠抗体喷涂NC膜,组装成胶体金检测卡。特异性试验结果表明,该检测卡只能检测出GPV,其他对照病毒检测结果均为阴性。将GPV做100倍稀释,仍可获得阳性结果。     

动物组织中磺胺二甲嘧啶残留检测ELISA试剂盒的研制

在建立竞争ELISA方法的基础上，首次研制出检测磺胺二甲嘧啶的单克隆抗体快速检测试剂盒，并对其检测限、精密度、检测范围以及鸡肌肉组织中的添加回收实验做了详细研究。本试剂盒的检测限为1．0ng／m1，检测范围为1．0-81．0ng／m1，批内变异系数＜8．9％，批间变异系数＜9．5％，在10、60和200ng／m1水平鸡肌肉组织中添加，回收率为64．5％-85．5％，变异系数为6．0％-18．6％。与同类相关德国产试剂盒相比较，阳性符合率为100％。     

玉米赤霉烯酮单克隆抗体的制备及间接竞争ELISA检测方法的初步建立

为了研究玉米赤霉烯酮的间接竞争ELISA检测方法,试验采用牛血清白蛋白与玉米赤霉烯酮的耦联物(ZEN-BSA)做包被抗原,标准玉米赤霉烯酮(ZEN)做竞争抗原,以制备的可稳定分泌抗ZEN的单克隆抗体为基础,初步建立了ZEN间接竞争ELISA检测方法。结果表明:间接竞争ELISA检测方法线性范围为0.363 2～78.985 2μg/L,最低检测限为0.231 9μg/L;曲线回归方程为y=68.711-25.666x,其中R2=0.987 1,批内平均变异系数为3.10%,批间平均变异系数为6.26%,与相似毒素的交叉反应率均小于0.01%。说明建立的检测方法可以用于ZEN的检测。     

间接竞争性ELISA法快速诊断TGEV的研究

利用基因工程技术制备的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）N基因原核表达产物重组N蛋白作为抗原诊断试剂,抗重组N蛋白的单克隆抗体作为抗体诊断试剂建立了间接竞争性ELISA检测细胞培养物中的TGEV病原的方法,并确定了间接竞争性ELISA操作流程中的最佳反应条件。在间接竞争性ELISA中,最佳抗原包被量为0．25卢g／孔;竞争抗原与单克隆抗体作用的最适时间为1h,反应温度为37℃;选择1h作为酶标抗体作用的最佳时间;底物液最佳作用时间为10min;选择样品的抑制率50％为其临界值;所用封闭液0．5％的聚乙烯醇PBS溶液在4℃冰箱中可密封保存6个月,封闭时间为120min;特异性试验表明与猪轮状病毒、猪流行性腹泻病毒等肠道腹泻性病毒均无交叉反应。本试验建立的间接竞争性ELIsA诊断方法具有良好的敏感性和特异性,为TGEV的疫情监测、及时而准确的诊断奠定了基础。     

应用间接ELISA检测鸡痘病毒抗体方法的建立

应用鸡胚成纤维细胞(CEF)扩增鸡痘病毒(Fowlpox virus,FPV)并提纯后作为抗原建立了具有较高特异性和灵敏性的间接ELISA方法.通过方阵滴定法来确定抗原最佳包被浓度为2.7μg/孔,待检血清最佳稀释倍数为1:100,其阳性临界值为OD≥0.113.将400份FPV免疫实验鸡血清用本方法进行检测,其阳性检出率为81.25%(325/400).此外,将该方法与琼脂扩散试验进行比较检测血清样品,结果显示本方法的灵敏度比琼脂扩散试验灵敏400～800倍,而且还有特异性强,操作简便、快速等优点.     

氟喹诺酮类药物多残留间接竞争ELISA检测方法的建立

为建立同时检测多种氟喹诺酮药物的免疫学分析方法,本研究以碳二亚胺(EDC)二步法合成环丙沙星人工抗原,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,建立氟喹诺酮类药物多残留检测方法.标准曲线在PBS中的线性检测范围为0.2 ng/mL～376 ng/mL,半数抑制浓度(IC50)为8 ng/mL,检测限(LOD)为0.1 ng/mL;抗体对恩诺沙星、诺氟沙星和培氟沙星均能特异性识别,IC50值分别为7.3 ng/mL、10.6 ng/mL、和13.2 ng/mL;标准品稀释液中NaOH和甲醇的最高容忍度分别为10％和30％;牛奶基质中添加5 ng/mL、20 ng/mL和50 ng/mL的标准品,环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星和培氟沙星的回收率分别为93％～108％、96％～110％、92.5％～104％和93％～102％.     

赛庚啶ELISA检测试剂盒的研制及其性能评价

基于直接竞争法原理酶联免疫技术研制了一种测定动物尿液中赛庚啶(CHP)残留量的检测试剂盒,并对试剂盒的检测限、特异性和稳定性等参数进行确定。通过在CHP分子上引入活性羧基,在EDC作用下分别偶联到KLH、BSA上形成CHP-KLH和CHP-BSA抗原,CHP-KLH抗原免疫BALB/C小鼠制得抗CHP单克隆抗体,经辣根过氧化物酶HRP标记抗CHP抗体,采用CHPBSA抗原包被酶标板,最终成功构建动物尿样中CHP残留量的竞争酶联免疫法检测体系,并进行性能测试评价。结果表明,吸光度百分比值与CHP质量浓度的对数在0.1~1.6μg/L呈线性关系,相关系数R~2为0.986,半数抑制浓度(IC_(50))为0.316μg/L,检测限为0.158μg/L,回收率在80%~110%,变异系数为2.0%~10.0%。方法具备良好的特异性,可用于动物尿样、血清及组织中CHP残留的快速检测。     

单抗间接Dot-ELISA检测禽脑脊髓炎病毒抗原的研究

利用制备的禽脑脊髓炎病毒 (AEV)单抗建立了检测AEV抗原的间接Dot ELISA方法 ,对AEV最低检出量为 1 6 0 8μg/mL。人工感染 1日龄SPF鸡 ,取发病鸡 (6～1 3日龄 )相应病料 ,各病料样本阳性检出率分别为 :脑 1 0 0 % ,胰 96 % ,十二指肠 98% ,腺胃 98%。对 40份临床自然发病鸡病料检测 ,阳性检出率为 92 %。对 1 0份AEV病原分离阳性样品 ,检测阳性率为 1 0 0 % ,而SPF鸡对照均为阴性     

鸡肉中硝基咪唑类药物残留ELISA检测试剂盒的研制

分别利用戊二酸酐法和碳化二亚胺法合成半抗原和免疫抗原免疫动物,制备特异性强的单克隆抗体.在筛选硝基咪唑类单克隆抗体的基础上,建立ELISA检测方法,并研制出对鸡肉中硝基咪唑类药物残留检测试剂盒.试剂盒最低检测限为0.04μg/kg,样本添加回收率为69.4%～107.5%,批内变异系数为7.8%～14.6%,批间变异系数为10.90%～16.5%.该方法的建立为硝基咪唑类药物残留的检测提供了便捷、准确的分析检测手段.     

直接ELISA检测沙门氏菌方法的建立及其应用研究

从已获得的４株沙门氏菌属特异杂交瘤单克隆抗体中，筛选出ＣＢ８和Ｄｅ７两株单抗相合成酶标检测试剂，并建立了检测沙门氏菌的直接ＥＬＩＳＡ方法，它能检出沙门氏菌属９９％的菌株，而不与其他肠道杆菌反应（包括大肠杆菌，阴沟杆菌，产气杆菌，志贺氏菌，枸椽酸杆菌，克雷伯氏菌，变形杆菌和沙雷氏菌）。应用本方法检测粪样，鱼粉，奶样，其敏感性和特异性分别高达１００％和９７．６％，仅出现２．４％的假阳性率，该法不受各要     

Preparation of Monoclonal Antibody and Establishment of Indirect Competitive ELISA of Estradiol

In order to establish a sensitive,specific and rapid method for the detection of estradiol (E₂) residues, an indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (icELISA) based on monoclonal antibody (MAb) for E₂ was developed. BALB/c mice were immunized by E₂-BSA and cell fusion technology was employed to screen hybridoma cell lines. One hybridoma cell line (3H3) was isolated, which produced monoclonal antibody that could binding E₂. Under the optimized conditions, the icELISA based on 3H3 for E₂ showed a half maximum inhibition concentration (IC₅₀) values of 1.636 ng/mL and detection ranges of 0.202 to 13.281 ng/mL with cross-reactivities for estriol and ethinyloestradiol of 0.31% and 0.25%, respectively, and negligible cross-reactivities with other E₂ analogs including estrone, estradiol valerate, estradiol benzoate, quinestrol, diethylstilbestrol and nonylphenol. The results demonstrated that the developed method could meet the requirements of high sensitivity detection of E₂ residue in food samples.     

雌二醇单克隆抗体制备及间接竞争ELISA检测方法的建立

为建立敏感、特异、快速的雌二醇（estradiol,E₂）残留免疫检测方法,本研究利用雌二醇人工抗原（E₂-BSA）免疫BALB/c小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术制备特异性雌二醇单克隆抗体,利用高效价、高特异性单克隆抗体建立间接竞争ELISA（icELISA）方法。结果显示,试验成功筛选获得一株稳定分泌抗雌二醇抗体的杂交瘤细胞株（3H3）,抗体效价可达1∶320 000,利用3H3腹水抗体优化间接竞争icELISA反应条件,检测抗体的敏感度,IC₅₀为1.636 ng/mL,IC₂₀~IC₈₀线性范围为0.202~13.281 ng/mL。雌二醇腹水抗体与雌三醇、乙炔雌二醇的交叉反应率分别达0.31%和0.25%,而与雌酮、戊酸雌二醇、苯甲酸雌二醇、炔雌醚、己烯雌酚、壬基酚的交叉反应率均<0.1%。结果表明,利用本研究制备的单克隆抗体建立雌二醇间接竞争ELISA检测方法,可满足食品中雌二醇残留高灵敏度的检测要求。     

猪瘟病毒胶体金免疫层析检测方法的建立及应用

为建立一种猪瘟病毒的快速检测方法，采用柠檬酸三钠还原氯金酸制备胶体金，选择15nm胶体金标记兔抗猪瘟病毒抗体，对胶体金标记抗体采用低温超速离心法进行纯化，组装免疫层析试纸条。用试纸条对猪瘟可疑病料进行检测，同时用直接荧光抗体试验和RT—PCR做平行试验。结果显示，用试纸条检测猪瘟病毒，10min左右即可显示结果，试纸条、直接猪瘟荧光抗体试验和RT—PCR的阳性检出率依次为36．36％（4／11）、45．45％（5／11）和72．72％（8／11）。表明，用胶体金免疫层析试纸条检测猪瘟病毒操作简便，需时短，可以用于猪瘟的流行病学调查。     

基于单克隆抗体的O型口蹄疫病毒抗体固相竞争ELISA检测方法的建立

为建立评价O型口蹄疫病毒(FMDV)疫苗免疫水平的方法,本研究以单克隆抗体(MAb)3D9为捕获抗体,以HRP标记的MAb 8E8作为检测MAb,经过条件优化建立了基于MAb的检测O型FMDV抗体的固相竞争ELISA(SPCE)方法。对该方法进行了特异性、敏感性、重复性试验。结果显示,MAb 3D9的最佳稀释度为1:25 000,灭活O型FMDV抗原的最佳稀释浓度为1:3,HRP标记的MAb 8E8的最佳稀释度为15 000,当血清1:32稀释时,检测的临界值确定为45%。该方法分别检测A型FMDV抗体阳性参考血清以及牛冠状病毒、牛轮状病毒以及猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒的标准阳性血清,检测结果均为阴性,未出现交叉反应。经检测,当阳性标准血清的抗体稀释度在1:512时,该方法仍具有较好的敏感性;批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,表明其重复性较好。并将该方法与液相阻断ELISA(LPBE)方法和病毒中和试验(VNT)的相关性进行了比较,结果显示该方法与LPBE和VNT的相关性分别为0.896和0.923。本研究为国内评价O型FMDV疫苗免疫水平建立了一种新的方法。     

磺胺二甲嘧啶单克隆抗体的研制

本研究将磺胺二甲嘧啶与人血清白蛋白、卵清白蛋白联接 ,分别作为免疫原、包被原 ,建立 EL ISA筛选方法 ,并利用杂交瘤技术 ,制备了分泌抗磺胺二甲嘧啶单克隆抗体的细胞株。经鉴定的单克隆抗体的蛋白亚型为 Ig G1 ;染色体数为 88～94条 ;分子量为 170 .2 KDa;亲和常数为 2 .5× 10 1 0 M- 1 ;与其他 6种磺胺药 (SDM、SDEP、SMM、SMZ、SD、SQ)无交叉反应     

氨苄青霉素单抗鉴定与酶联免疫检测方法的初步研究

利用碳化二亚胺(EDC)法将氨苄青霉素(AMP)与匙孔嘁血蓝蛋白(m cKLH)偶联制备免疫原免疫Balb/c小鼠,应用杂交瘤技术将免疫鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,建立分泌氨苄青霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞染色体数目为97~104条,3D12株亚型为IgG2 a,用其制备的腹水ELISA效价达到2×106。亲和常数为3×10-10mol/L,抗体相对分子质量为1.54×105,与其他抗生素的交叉反应率小于0.01%。采用间接竞争ELISA方法建立检测AMP的标准曲线,在0.5~100 ng/mL范围内呈线形相关,回归方程为Y=0.056 9X+0.130 8,相关指数R2=0.994 8,以10%抑制率对应的浓度计算,该方法对AMP的检测限为0.3 ng/mL,对市售消毒纯牛奶模拟样品最低检测限为0.4 ng/mL。