自由基吸收类抗氧化剂对延边黄牛体细胞克隆重构胚发育的影响

为提高延边黄牛体细胞克隆重构胚发育率,研究了在体外培养液中单独添加不同浓度的自由基吸收类抗氧化剂维生素E(VE)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和亚硒酸钠(SS)对克隆重构胚发育率的影响。试验中选择成熟培养20～22h的卵母细胞,脱颗粒细胞后选择排出第一极体的卵母细胞进行去核与注核操作,然后将融合、激活后的重构胚在添加不同种类不同浓度抗氧化剂的体外培养液中进行培养。结果表明,在卵裂率上,VE的100μmol.L-1组显著高于其他3组(84.58%vs 57.64%、70.87%、67.64%);50和200μmol.L-1组之间无差异,但都显著高于0μmol.L-1组(70.87%、67.64%vs 57.64%)。EGCG的7.5和15μmol.L-1组显著高于加0μmol.L-1组(79.47%、81.67%vs 69.47%)且其他2组间差异不显著。SS的添加,5ng.mL-1组与0和10ng.mL-1组有显著差异(80.44%vs 70.27%、67.16%);与2.5ng.mL-1组差异不显著(80.44%vs 73.92%),且其他2组间差异不显著;在囊胚发育率上,VE的100μmol.L-1组要显著高于其他3组(26.36%vs 13.04%、18.08%、17.26%)。EGCG的15μmol.L-1组显著高于0和30μmol.L-1组(24.86%vs 8.99%、12.10%),和7.5μmol.L-1组无差异。SS的5与0组和10ng.mL-1组有显著差异(23.31%vs 10.32%、12.65%);2.5ng.mL-1组与0和10ng.mL-1l组有显著差异(19.97%vs 10.32%、12.65%)且其他2组间差异不显著。体外培养液中分别单独添加浓度为100μmol.L-1、15μmol.L-1和5ng.mL-1的维生素E,EGCG和亚硒酸钠都能够显著提高延边黄体细胞克隆牛重构胚的发育率。     

融合液浓度梯度融合法提高延边黄牛体细胞克隆效率

延边黄牛耳皮肤成纤维细胞作供核细胞,采用0.28mol/L蔗糖、甘露醇融合液。比较融合液浓度梯度融合法与普通融合法对延边黄牛体细胞克隆效率的影响。实验1,探讨0.28mol/L蔗糖融合液对体细胞克隆胚胎融合率及重组胚体外发育的影响。结果表明:融合液浓度梯度融合法的融合率(92.98%vs88.55%)、卵裂率(91.07%vs80.96%)、囊胚发育率(40.06%vs30.19%)均显著高于普通融合法。实验2,探讨0.28mol/L甘露醇融合液对体细胞克隆胚胎融合率及重组胚体外发育的影响。结果表明:融合液浓度梯度融合法的融合率(91.22%vs84.89%)、卵裂率(88.02%vs80.42%)、囊胚发育率(39.51%vs29.19%)均显著高于普通融合法。结果表明无论蔗糖还是甘露醇融合液,融合液浓度梯度融合法均能有效提高延边黄牛体细胞克隆效率。     

融合液浓度梯度融合法不同融合条件对延边黄牛体细胞克隆效率的影响

采用延边黄牛耳皮肤成纤维细胞作供核细胞,0.28 mol/L蔗糖融合液,融合液浓度梯度融合法对重组卵母细胞进行融合操作,探讨不同融合电场强度、脉冲次数、脉冲时程对延边黄牛体细胞克隆胚胎融合率及重组胚体外发育率的影响。结果表明,适宜延边黄牛体细胞克隆、融合液浓度梯度融合法的融合电场强度为1200 v/cm;融合脉冲次数为2次;融合脉冲时程为40μs。     

不经显微操作进行体细胞克隆

本文描述了一种手工平分无透明带卵母细胞的改进核移植方法 ,Hoechst染色挑选胞质体 ,以培养的原代颗粒细胞为体细胞与 2个胞质体进行2次细胞融合。检测微滴、穴中穴 ( WOW)和微管( GO) 3个系统培养的无透明带胚胎 ,胚泡率分别为 0 % ,1 8%和 36% ,方法简单、快速、经济 ,有可能取代现有的体细胞核移植技术而大量应用。影响反刍动物体细胞核移植广泛应用的主要技术障碍是 :1体外法效率低 ;2妊娠和产犊率低 ,出生后死亡及异常发育率高 ;3体外法所需实验室设备费用高 ,技术难度大。显微操作被认为是该工作中不可缺少的。此外 ,工具制作设备…     

甘氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响

为了提高延边黄牛体细胞克隆重组胚的发育率,研究了在体外培养液中添加不同浓度的甘氨酸对重组胚发育的影响。分别在体外培养液中添加0、7、14、21mmol/L的甘氨酸,结果表明,在体外培养液中添加甘氨酸能够显著提高延边黄牛体细胞克隆重组胚的发育率,且以7mmol/L浓度的甘氨酸囊胚的发育率最高。     

延边黄牛体细胞克隆早期胚胎部分超微结构的研究

为了解延边黄牛体细胞克隆早期胚胎的超微结构特征,以延边黄牛体细胞克隆早期胚胎为研究对象,应用透射电子显微镜对延边黄牛体细胞克隆早期胚胎发育各时期的线粒体和细胞核等超微结构进行了观察。结果表明,延边黄牛体细胞克隆早期胚胎随着胎龄的增长,帽状线粒体逐渐减少,成熟线粒体增多;核仁由絮状到致密,最后呈网状化。     

显微操作针的制作

显微操作技术如今已广泛应用于胚胎生物工程,如体细胞核移植、显微受精、胚胎性别鉴定和胚胎分割等。完成这些工作,首先必须有符合要求的显微操作针,由国外购买成品针用于显微操作人员培训其成本太高。本实验室主要从事牛、羊的体细胞克隆工作,所以由国外购买了拉针仪、煅针仪和磨针仪。经过一年的学习摸索,显微操作针的制作已很熟练,而国内做显微操作针的相关资料还很少,现将实验中摸索出来的一些方法和技巧总结出来与同行共享。1做针用材料实验室购买的是NIKON和LEICA公司的显微操作系统,因此使用的是与其相匹配的外径为1mm,壁厚0.1mm…     

延边黄牛卵母细胞与体细胞克隆胚胎内脂滴变化规律的研究

用苏丹Ⅳ和苏丹黑B 2种染色方法,对体外培养的延边黄牛各发育阶段卵母细胞和体细胞克隆胚胎内脂滴变化进行研究,并对2种染色方法进行了比较。结果表明,随着细胞发育阶段的不同,脂滴的含量也随之变化,从未经成熟培养的卵母细胞到8细胞期胚胎内脂滴不断增多,脂滴直径不断增大;而从8细胞期到囊胚期胚胎内脂滴不断减少,脂滴直径也不断减小。也显示苏丹IV染色效果较好,可作为测定活体细胞中脂滴的检测方法。     

卵母细胞和供核细胞对体细胞克隆的影响

克隆胚胎发育率太低和后代缺陷率高是克隆不能广泛应用于畜牧生产和生物医药的最大障碍.影响克隆效率的因素很多,过去20多年主要集中于改进和完善核移植程序方面.     

生物抗氧化剂对原料奶体细胞数的影响

原料奶中体细胞是间接反应奶牛乳房是否健康的一个有力数据。同时过高的体细胞也将直接影响到原料奶的质量和价格。因此,本试验选择年龄、胎次、产奶量、泌乳天数相近的中国荷斯坦奶牛80头,探讨日粮添加34g生物抗氧化剂对原料奶中体细胞的影响。结果表明,生物抗氧化剂对奶牛产奶量及乳成分无显著影响。但与对照组相比,试验组原料奶中体细胞数呈显著低于对照组（P〈0.05）。因此,本研究表明,生物抗氧化剂能够有效降低原料奶中体细胞数,提高原料奶质量。     

鲁西黄牛体细胞克隆保种技术的研究

以体外培养的鲁西黄牛耳皮肤成纤维细胞作核供体，研究利用体细胞克隆技术保存我国地方黄牛优良品种的技术方法。通过组织块培养法建立的鲁西黄牛（1♂，4♀）成纤维细胞系，作为核移植供体细胞，利用屠宰场母牛卵巢卵母细胞经体外培养成熟后作为核受体进行核移植，试验结果表明：重构胚的融合率为62．5％（242／387），分裂率为63．6％（154／242），体外培养第7天囊胚发育率为42．9％（66／154）。体外培养第7天的囊胚的内细胞团细胞（ICM）与滋养层细胞数平均为37和47，ICM占44．2％。体外发育到7d的囊胚新鲜胚胎的移植妊娠率（新鲜胚胎）移植受体10头，60d妊娠率为20％（2／10）。     

受体母猪排卵状况对体细胞克隆胚胎移植效率的影响

为了确定猪体细胞克隆胚胎的受体母猪最佳发情阶段,本研究比较了供受体同期化方案对猪体细胞克隆胚胎输卵管内移植后30 d受胎率和妊娠足月率的影响。将体外培养2 d的猪体细胞克隆胚胎,移植到发情第1~2天的受体母猪。根据受体母猪卵泡发育与排卵状况将受体猪群分为2个类别:卵泡发育处于即将排卵或正在排卵阶段(组一);卵泡发育处于排卵前阶段或完全排卵阶段(组二)。结果发现:(1)组一6头受体母猪胚胎移植后30d受胎率为100%;而组二10头受体母猪受胎率为40%,二者差异显著(P0.05)。(2)组一6头受体母猪全部产仔,妊娠足月率为100%;组二10头受胎母猪2头产仔,妊娠足月率为20%,二者差异极显著(P0.01)。以上结果表明:体外培养2 d的猪体细胞克隆胚胎发育阶段与即将排卵或正在排卵的受体母猪的子宫环境同期性最好,得到了理想的胚胎移植效率。     

一例体细胞克隆黄牛肺脏的组织结构观察

作者应用石蜡切片及HE染色技术对体细胞克隆黄牛的肺脏及其细胞类型和形态进行了详细的观察。结果表明,光镜下,该体细胞克隆黄牛肺脏的组织结构与自然繁殖的黄牛肺脏的组织结构基本一致,包括支气管、细支气管、终末细支气管、呼吸性细支气管、肺泡管、肺泡囊及肺泡等结构,但体细胞克隆黄牛的细支气管管壁内的皱壁消失,其黏膜以单层立方上皮为主;肺泡处于半充容状态,肺泡腔狭小,肺泡膈较厚,其中含有较多胶原纤维和弹性纤维。肺泡壁的细胞结构不清,肺泡腔内有内容物,可能是发生病变引起。     

供体细胞对哺乳动物体细胞核移植的影响

哺乳动物体细胞核移植技术(克隆)在农业、生物技术、医药生产和濒危动物保护等方面具有很大的潜力和应用价值,已成为目前发育生物学研究的重要方法.文章依据近年来国内外在动物克隆技术方面的资料,分析了供体细胞类型、供体细胞动物年龄、供体细胞所处细胞周期、体外传代次数以及供体动物性别等因素对克隆动物效率的影响及可能原因.     

影响水牛体细胞克隆胚胎移植的因素

从不同发情方式、不同胚胎类型、不同胚龄以及不同季节来探讨影响水牛体细胞克隆胚胎移植的效率。结果显示,自然发情与同期发情方法对水牛体细胞克隆胚胎的移植受胎率有显著影响。鲜胚和冻胚移植后受胎率没有显著差异,其受胎率分别是9.79%、14.5%。在移植中,不论是鲜胚还是冻胚,6日龄胚胎移植受胎率最高。而且不同日龄(5、6、7、8～10d)克隆胚胎移植受胎率差异不显著(鲜胚P=0.260 7,冻胚P=0。065 2)。克隆胚胎在秋季移植时受胎率最高,受胎率是16.06%,比其他季节高,且差异显著(P<00.05).其次是春季,但夏季和冬季克隆胚胎移植后受胎率差异不显著(P>0.05)。结果表明,水牛体细胞克隆胚胎在胚胎移植中是可行的,但效率比较低。     

延边黄牛体细胞核移植的研究进展

牛体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)是一套极其复杂的技术体系,它包括卵母细胞的成熟、供核细胞的准备、卵母细胞的显微操作、细胞融合、卵母细胞激活和胚胎培养。因此,许多因素影响着核移植胚胎发育。虽然陆续有克隆牛出生的报道,但是克隆效率依然低下。本综述对延边黄牛体细胞核移植体系的6个方面进行简单综述,以期为探究延边黄牛体细胞克隆的最优化条件、建立最优化的培养体系、提高克隆效率提供参考。     

谷氨酰胺对延边黄牛卵母细胞成熟及重组胚发育的影响

为了提高卵母细胞的成熟率及重组胚胎的发育率,在体外成熟液中添加了不同浓度的谷氨酰胺,研究谷氨酰胺对延边黄牛卵母细胞成熟的影响,并观察它对重组胚胎后续发育的影响,从中筛选出最佳的体外培养条件。结果表明,1.0 mmol/L的谷氨酰胺能够显著提高卵母细胞的成熟率,同时也能提高囊胚发育率。说明谷氨酰胺能够提高延边黄牛卵母细胞的体外成熟率,并能促进囊胚发育。     

抽提物处理供体细胞对克隆胚胎发育的影响

本研究采用爪蟾卵母细胞抽提物处理和牛胎儿成纤维细胞(JBCFF),并以发生重编程的细胞为核供体进行体细胞核移植,研究其对克隆效率的影响.分别超排3只爪蟾,收集卵母细胞后提取其抽提物,用BCA蛋白浓度测定试剂盒确定其蛋白含量,SDS-PAGE分析其中所含蛋白的种类.应用细胞膜透化剂Digitonin对建立的JBCFF进行通透处理和PI染色,筛选最适浓度;并用获得的抽提物处理牛体细胞,获得重编程细胞.以发生重编程的体细胞为供体进行核移植,同时比较离子霉素+6-DMAP和A23187+6-DMAP两种组合激活后克隆胚的体外发育能力.结果,3个爪蟾卵母细胞抽提物样品的蛋白浓度分别为56.2255、64.6570和71.2158 μg/mL,其中所含蛋白种类一致,主要集中在40~55、70~100 ku之间.经过连续的筛选,透化剂Digitonin对JBCFF通透处理的最适浓度为7 μg/mL,PI染色显示透化效率为55.44%.爪蟾卵母细胞抽提物与体细胞共孵育后继续培养6~7 d,细胞聚集形成"克隆簇".分别以"克隆簇"细胞和未处理细胞为核供体,制备的重构胚在融合率(92.83%和96.04%)、卵裂率(89.64%和89.78%)和囊胚率(24.06%和23.12%)均无显著差异(P>0.05);离子霉素+6-DMAP和A23187+6-DMAP两种激活方式对克隆胚胎的分裂率(92.16%和92.28%)和囊胚率(23.21%和24.18%)均无显著影响(P>0.05).爪蟾卵母细胞抽提物诱导和牛体细胞发生重编程,并恢复到较低的分化状态,但没有显著促进克隆胚胎的体外发育,可见缺少对胚胎发育起重要作用的重编程过程,还需要继续深入研究.     

动物体细胞克隆机理的几个关键问题

动物体细胞克隆技术是目前生物技术领域研究的热点之一,其科学意义和应用价值重大,本文对动物体细胞克隆的理论基础进行了探讨,阐述了再程序化过程中Ca2+、MPF、DNA的甲基化重要作用,以及核质互作的机理。     

聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和牛血清白蛋白对牛卵母细胞成熟及体细胞克隆胚胎发育的影响

为了比较不同浓度的聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、牛血清白蛋白(BSA)对牛卵母细胞体外成熟率、重组胚卵裂率和发育率的影响,试验采用抽吸法回收卵母细胞,用不同的无血清成熟液进行卵母细胞的体外成熟培养,然后对成熟卵母细胞进行核移植、融合、激活以及胚胎的体外培养.结果表明,适合延边黄牛卵母细胞成熟及体细胞克隆胚胎发育的PVA、PVP和BSA的最佳浓度分别是1.0 mg/mL,0.3%和0.4%.