稳定转化家蚕BmN细胞表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子

为了建立稳定转化家蚕细胞持续表达外源基因的技术体系,构建了基于piggyBac转座子的带有人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因(hGM-CSF)和新霉素抗性基因(neo)表达元件的转基因载体pigA3GFP-IE-neo-FH-hGM-CSF-polyA-fib-L-intron1,以及带有hGM-CSF和吉欧霉素(zeocin)抗性基因的昆虫细胞转化载体pIZT-IE-hGM-CSF,分别转染家蚕卵巢BmN细胞,并以含相应抗生素G418或zeocin的培养液筛选,得到稳定的转化细胞系FH-hGM-CSF和IE-hGM-CSF。ELISA检测结果显示,hGM-CSF在FH-hGM-CSF和IE-hGM-CSF转化细胞系的表达水平分别为1.534 55 fg/个细胞和2.227 38 fg/个细胞。     

家蚕精子介导转基因技术体系的优化

为了构建高效的家蚕转基因技术,对采用piggyBac转座载体的家蚕精子介导转基因的主要技术参数进行优化,结果表明外源DNA的稀释剂和注射方式对导入效率影响较大,G0代未整合的外源DNA在5龄期前基本被降解破坏。推荐的家蚕精子介导基因转移技术方案为:处女蛾交尾囊注射6～8μL以0.1×TE稀释的2 g/Lpig-gyBac转座子载体DNA后正常交配产卵,根据G0代5龄期及蛾期PCR检测标记基因为阳性的蛾区自交,G1代阳性个体自交以获得纯合后代。     

piggyBac转座子介导的家蚕细胞转基因研究初探

为探讨稳定转化家蚕细胞表达外源基因的新方法,以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)极早期蛋白基因(ie-1)启动子元件驱动新霉素抗性基因(neor),并克隆至具有绿色荧光蛋白基因(gfp)标记的昆虫转座子载体piggyBac中,构建转基因载体pigA3-IE-Neo。以该载体转染家蚕BmN细胞,用终浓度800μg/mL的遗传霉素(geneticin,G418)筛选3个月,获得了稳定转化的细胞,呈现绿色荧光的细胞数达80%以上。通过PCR鉴定证实了细胞基因组DNA中neor基因和gfp基因的存在。     

利用转基因家蚕在蚕丝中表达重组人表皮生长因子

人表皮生长因子(human epidermal growth factor,hEGF)具有刺激细胞增殖的强大能力,是伤口愈合的关键因子.利用转基因技术,在家蚕后部丝腺利用丝素轻链基因(fibroin light chain,FibL)启动子驱动FibL-hEGF融合蛋白的表达.借助piggyBac转座子将FibL-hEGF融合基因导入到家蚕基因组,利用荧光检测总共获得8个转基因阳性卵圈,转基因阳性率为36.36％.PCR和反向PCR检测证明外源融合基因FibL-hEGF已被成功整合到家蚕基因组中,且随机插入到家蚕染色体的5个位点.Western blotting检测表明FibL-hEGF融合蛋白在家蚕后部丝腺中表达且成功分泌到蚕茧中,进一步证实了转基因家蚕的产生.本研究中利用piggyBac转座子介导的转基因技术成功获得了转基因家蚕并得到重组hEGF蚕丝,该蚕丝可用于制造伤口敷料.     

家蚕转座子表达载体pSVHK1.4的构建

研究利用PCR方法扩增黑腹果蝇 (D .melanogaster)hsp70启动子 ,然后插入到质粒pcDNA3上水母绿色荧光蛋白基因gfp的上游 ,与之顺向拼接构建成含hsp70和gfp的重组质粒pCGH。将家蚕K1 4转座子序列从pUK1 .4亚克隆到真核表达载体pSVL中PvuⅡ位点 ,获得中间载体pSK1 .4。最后将hsp70启动子和gfp报告基因的融合片段从pCGH中亚克隆到质粒pSK1 .4中K1 .4片段上的BglⅡ位点处 ,从而完成对转座子表达载体pSVHK1 .4的构建。     

胰岛素样生长因子Ⅰ的研究进展

胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）是胰岛素类激素家族中的成员之一,是一种在分子结构上与胰岛素类似的多肽蛋白物质.IGF-I在人体及动物体内具有极其重要并且丰富的生物学功能,如促生长、促分化、参与糖代谢、蛋白质代谢和脂肪代谢等,并对消化系统、泌乳及生殖有一定的影响.文章就IGF-I的来源,分子结构及生物学功能作一简单概述.     

鸡胰岛素样生长因子-Ⅰ的研究进展

IGF-I是胰岛素样生长因子的重要成员,与胰岛素高度同源,空间结构也十分相似,这个系统的其它成员还包括IGF-I受体(IGFIR),IGF-II受体(IGFIIR)以及4种胰岛素生长因子结合蛋白(IGF-BP-1、-2、-3、-4)。IGF最早被称为硫化因子,后来     

胰岛素样生长因子-Ⅰ对动物生长发育的调节作用

胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)是一种与胰岛素原高度同源的生长调节激素,既有胰岛素样代谢作用,又是一种多功能的细胞增殖调控因子。IGF-Ⅰ依赖生长激素(GH),通过GH-IGF-Ⅰ轴对胚胎及出生后机体的生长发育起重要作用。     

黑斑蛙胰岛素样生长因子-2原核表达载体构建

胰岛素样生长因子-2(IGF-2)是介导生长激素发挥生物学功能的重要因子,在动物机体的生长发育中具有重要作用。为对黑斑蛙IGF-2基因进行原核表达,本研究针对转录组数据中的黑斑蛙IGF-2序列,设计引物扩增IGF-2的完整基因,获得了全长为944 bp、ORF长为651 bp的序列;随后在黑斑蛙IGF-2的ORF两端添加限制性内切酶位点后亚克隆到p ET-32a(+)质粒中,构建了黑斑蛙IGF-2的原核表达载体。为获得黑斑蛙IGF-2的表达产物并探究其生物学作用奠定了基础。     

猪胰岛素样生长因子Ⅰ基因表达与调控的研究进展

胰岛素样生长因子-Ⅰ(Ⅰ nsulin-like growth factor-Ⅰ,I GF-Ⅰ)是机体生长、发育和代谢的一个重要调控因子,同时也是生长激素(growth hormone,GH)启动生长活性的主要介导者.血液中的I GF-Ⅰ主要来源于肝脏,以内分泌的形式作用于其他组织;许多肝外组织也能合成I GF-Ⅰ,其主要以自分泌或旁分泌的形式发挥作用.多种因素调控其表达.本文就猪I GF-Ⅰ的表达与调控方面的最新研究进展进行一综述.     

核基质附着区(MAR)调控的人胰岛素样生长因子(hIGF-1)转基因兔的制备

用ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄⅢ双酶解含鸡α－珠蛋白基因５′端核基质附着区（ＭＡＲ）、小鼠金属硫蛋白基因启动子（ＭＴ－１）和人胰岛素样生长因子－１（ｈＩＧＦ－１）基因的ｐＭＴＳＭＣＡＧ质粒，０．６％琼脂糖凝胶电泳，玻璃乳回收纯化ＭＡＲ／ＭＴ／ｈＩＧＦ－１片段（３．９ｋｂ），用该片段制备转基因兔。利用水平显微注射系统注射１－细胞兔胚胎４６８枚，移植到３６只受体兔，有８只妊娠，共产下１９只活仔兔。采仔兔耳样提取基因组ＤＮＡ，应用ＰＣＲ技术分析其外源基因整合情况，获得８只阳性兔（显示出约６００ｂｐ外源ＤＮＡ条带）。再对８只阳性兔的ＰＣＲ产物进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，得到５只整合有ＭＡＲ／ＭＴ／ｈＩＧＦ－１外源基因的转基因兔，转基因整合率为２６．３％（５／１９）。用１只阳性转基因公兔（５０２号）繁殖了６窝，共获得４２只仔兔。采仔兔耳样提取基因组ＤＮＡ后，如上用ＰＣＲ分析和做Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，Ｆ１代中有５只整合有ＭＡＲ／ＭＴ／ｈＩＧＦ－１融合基因。     

猪胰岛素样生长因子-Ⅰ基因的结构与功能

胰岛素样生长因子-Ⅰ(Insulin-likegrowthfactor-Ⅰ,IGF-Ⅰ)是机体生长、发育和代谢的一个重要调控因子,同时也是生长激素(growthhormone,GH)启动生长活性的主要介导者。成熟的IGF-Ⅰ是由70个氨基酸残基组成的碱性单链多肽,因与胰岛素同源而得名。猪IGF-Ⅰ基因组DNA全长大于80kb,至少由6个外显子(exon1￣6)和5个内含子(intron1￣5)构成。虽然IGF-Ⅰ是一个单拷贝基因,但是,由于选择性拼接、不同的polyA位点以及潜在的多个启动子(promotors)的使用,使它以一种复杂的方式转录和处理而产生了多个成熟的mRNA拼接变异体,结构极为复杂。就猪IGF-Ⅰ基因的结构和功能等方面的最新研究进展进行综述。     

核基质附着区（MAR）调控的胰岛素样生长因子（hIGF—1）转基因兔…

用ＥｏｏＲＩ＋ＨｉｎｄⅢ双酶解含鸡α－珠蛋白基因５′端核基质附着区（ＭＡＲ）、小鼠金属硫蛋白基因启动子（ＭＴ－１）和人胰岛素样生长因子１－（ｈＩＧＦ－１）基因的ｐＭＴＳＭＣＡＧ质粒，０．６％琼脂糖凝胶电泳，玻璃乳回收纯化ＭＡＲ／ＭＴ／ｈＩＧＦ－１片段（３．９ｋｂ），用该片段制备转基因兔。利用水平显微注射系统注射１－细胞兔胚胎４６８枚，移植到３６中受体兔，获得８只阳性兔（显示出约６００ｂｐ外源ＤＮＡ     

鹅胰岛素样生长因子-Ⅰ基因的克隆及其mRNA在组织中的表达量变化

利用半定量反转录聚合酶链反应（RT—PCR）克隆了黑龙江籽鹅IGF-Ⅰ基因，并检测了生长期间该基因mRNA在各组织中的表达量变化。结果表明，鹅IGF-Ⅰ基因与鸡、鸭IGF-Ⅰ基因的同源性分别为97．6％、99．3％；鹅肝组织中IGF-ⅠmRNA的表达水平在30日龄和60日龄较高，而30日龄的表达量极显著高于22、28日龄鹅胚和1日龄籽鹅，显著高于10日龄雏鹅；30日龄雏鹅IGF-ⅠmRNA在肝、卵巢、胸肌、肺、脾、腿肌、垂体、肌胃、肾、心等组织中都有表达，其中肝、卵巢、胸肌、肺的表达量较高。     

胰岛素样生长因子-Ⅰ的生物学功能及在畜牧业中的应用前景

<正>下丘脑-GH-IGF-I轴是一个重要的体内分泌代谢轴,对生长发育的调控贯穿动物的整个生命过程。自Sallmon和Daughaday首次发现并报道这一与生长激素密切相关的因子以来,人们对胰岛素样生长因     

胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)促生长作用的研究进展

胰岛素样生长因子-Ⅰ(insulin-like growth factorⅠ,IGF-Ⅰ)是生长激素促生长作用的主要介导因子。通过对IGF-Ⅰ的阐述,揭示了其在动物的生长发育过程中发挥的重要作用。     

表皮生长因子和胰岛素样生长因子-Ⅰ对断奶仔猪免疫功能的影响

选取21日龄断奶长白仔猪37头,按表皮生长因子(EG F)、胰岛素样生长因子-Ⅰ(IG F-Ⅰ)、基础日粮、自然哺乳随机分为4组,每组3重复,每个重复3头。EG F和IG F-Ⅰ的剂量为17.86μg/d,研究其对早期断奶仔猪免疫功能的影响。结果表明:EG F组和IG F-Ⅰ组脾淋巴细胞转化率均极显著(P<0.01)高于基础日粮组,空肠后段肠黏膜SIgA含量极显著(P<0.01)高于基础日粮组而且EG F组脾淋巴细胞转化率高于IG F-Ⅰ组。EG F组小肠各段黏膜上皮间淋巴细胞数极显著(P<0.01)高于基础日粮组;IG F-Ⅰ组空肠和回肠黏膜上皮间淋巴细胞数极显著(P<0.01)高于基础日粮组;EG F组回肠黏膜上皮间杯状细胞数极显著(P<0.01)高于基础日粮组;IG F-Ⅰ组回肠黏膜上皮间杯状细胞数极显著(P<0.01)低于自然哺乳组。表皮生长因子和胰岛素样生长因子-Ⅰ能提高早期断奶仔猪的免疫功能。     

鹅类胰岛素样生长因子-Ⅰ基因的克隆与序列分析

类胰岛素样生长因子-Ⅰ是调控动物生长、发育、繁殖、免疫以及癌症、衰老等的重要调节因子。研究根据公开发表的鸡、鸭、鹅等IGF-Ⅰ基因序列设计5对引物,用PCR方法从鹅基因组DNA中分别扩增出IGF-Ⅰ基因的5′调控区部分序列及外显子1、内含子1和外显子4序列。扩增产物在电泳后的琼脂糖凝胶上分别为预期的309、203、549、4413bp和1442bp特异性条带。将扩增产物或扩增产物克隆入pMD19-T载体进行序列测定,比对后发现与鸡、鸭的同源性均大于80%,与鼠、人的同源性也在68%以上。其中内含子1和外显子4的序列已上传至GenBank,基因登录号分别为EU111743和EU072031。     

基于piggyBac转座子转hGM-CSF基因家蚕的研究

将由家蚕核型多角体病毒IE-1基因启动子控制下的hGM-CSF基因克隆到p igA3GFP载体中,构建了家蚕转基因载体p igA3GFP[IE-GMCSF],利用压力渗透法和精子介导法将其与辅助质粒helper p igA3一起导入家蚕蚕卵,获得产生绿色荧光的家蚕,次代产生荧光蚕的比例分别为0.17%,0.15%。将次代荧光蚕与正常蚕交配后代(G1)的荧光蚕个体再相互杂交,连续进行多代选育,获得了稳定遗传的转hGM-CSF基因家蚕品系。     

饲粮NFC/NDF对奶山羊瘤胃上皮细胞胰岛素样生长因子Ⅰ及其受体的基因表达的影响

本试验旨在探讨饲粮不同非纤维性碳水化合物和中性洗涤纤维比(NFC/NDF)条件下,诱导奶山羊发生亚急性瘤胃酸中毒(SARA)过程中瘤胃上皮细胞胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)及胰岛素样生长因子Ⅰ受体(IGF-ⅠR)的基因表达量的变化。选用12只泌乳期关中奶山羊为试验动物,试验分4期进行,每期15 d,依次饲喂NFC/NDF分别为1.02(Ⅰ期)、1.24(Ⅱ期)、1.63(Ⅲ期)、2.58(Ⅳ期)的4种饲粮,以逐渐增加饲粮精料的方式诱导奶山羊发生SARA,并采用实时定量PCR(qRT-PCR)法对瘤胃上皮细胞中IGF-Ⅰ及IGF-ⅠR的基因表达量的变化进行相对定量分析。结果表明:随着饲粮NFC/NDF的升高,IGF-Ⅰ及IGF-ⅠR的基因表达量均出现不同程度的增加,Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期IGF-Ⅰ的基因表达量分别是Ⅰ期的1.70、2.71和9.61倍,IGF-ⅠR的基因表达量分别是Ⅰ期的1.88、3.09和10.19倍。饲粮NFC/NDF为2.58(即SARA期)时,与Ⅰ期相比,IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR的基因表达量均出现极显著增加(P<0.01)。结果提示,以提高饲粮NFC/NDF的方法逐渐诱导SARA,IGF-Ⅰ及IGF-ⅠR的基因表达量显著提高,SARA发生后,它们的表达量有大幅增加。