柑桔黄龙病菌外膜蛋白的原核表达与纯化

为获得大量高纯度的柑桔黄龙病菌Omp 外膜重组蛋白、应用PCR 方法从染病柑桔模板中扩增出黄龙 病菌omp 基因的3 个片段、将其克隆到pMDl9-T 载体、再亚克隆到pET32a 原核表达载体、构建pET32a-omp 原核表 达重组质粒、然后转化大肠杆菌BL21（DE3）、经IPTG 诱导并用SDS-PAGE 电泳检测带组氨酸标签的Omp 融合蛋白 表达后、用镍柱分离纯化该融合蛋白。结果表明院柑桔黄龙病菌omp 基因序列的两个片段在37益经1 mmol/L IPTG 诱导后、在大肠杆菌得到了高效表达;镍柱纯化蛋白得到预期大小（约55 ku）的融合蛋白。     

斑马鱼p53基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

利用原核表达系统克隆表达斑马鱼p53基因。RT-PCR法从斑马鱼胚胎中扩增获得p53基因编码区,并将其克隆至原核表达载体pET28a上,构建重组质粒pET28a/z-p53,将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)受体菌,IPTG诱导表达,表达产物经镍柱纯化、尿素透析复性,SDS-PAGE电泳分析,结果表明,p53基因在大肠杆菌中成功表达,表达的p53融合蛋白分子量大约为53kD,透析复性后获得了高纯度可溶性的p53蛋白。     

鹅坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅲ的原核表达及抗原性分析

[目的]获得鹅坦布苏病毒(GTMUV)E蛋白结构域Ⅲ的原核表达重组蛋白并明确其免疫原性,为进一步研究其生物学功能及研制亚单位疫苗奠定基础.[方法]根据GenBank中GTMUVJS804株E蛋白结构域Ⅲ的同源基因序列设计1对引物,在其两端加入Flag标签序列和酶切位点,采用PCR扩增GTMUV的E蛋白结构域Ⅲ基因(EⅢ),然后与pET32a原核表达载体连接构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21 (DE3)后用IPTG诱导融合蛋白表达,并以Westernblotting鉴定其免疫原性.[结果]PCR扩增获得携带Flag标签序列的EⅢ基因片段约430 bp,将其插入pET32a载体可成功构建重组质粒pET32a-EⅢ.阳性重组菌经IPTG诱导表达5h即可得到融合蛋白,分子质量约33.0 kDa,主要以包涵体形式存在.Westem blotting鉴定结果显示,融合蛋白与抗Flag标签单克隆抗体、小鼠抗坦布苏病毒多克隆抗体均可发生特异性反应,检测到预期的目的条带.[结论]GTMUV E蛋白结构域Ⅲ能在大肠杆菌中成功诱导表达,且获得的融合蛋白具有良好的免疫原性,可用于研制GTMUV诊断抗原和亚单位疫苗.     

梁平柚葡萄糖基转移酶基因的克隆及原核表达

基于GenBank公布的葡萄糖基转移酶(LGT)基因的核苷酸序列,设计并合成特异性引物,以梁平柚成年树幼叶总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增葡萄糖基转移酶基因,将该基因片段克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,构建了该基因的融合表达载体pET28a-CmLGT,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中.经1.0mmol/LIPTG诱导表达获得大小约为62Kd的目的融合蛋白.     

新疆南疆地区牛乳头瘤病毒1型L1基因克隆及原核表达

本研究以构建牛乳头瘤病毒1型L1基因原核表达系统pET32a-L1及表达牛乳头瘤病毒1型L1蛋白为目的,为进一步制备基因工程疫苗奠定基础.从牛体表赘生瘤组织中提取DNA,PCR扩增L1基因片段,克隆至pGM-T载体.测序成功后将目的片段和表达载体经双酶切连接于表达载体pET32a中,并构建重组质粒pET32a-L1.重...     

油菜菌核病菌激发子基因SsXYN克隆及表达载体构建

以核盘菌菌株NGA4提取的总RNA为模版,利用RT-PCR技术扩增获得SsXYN基因的全长cDNA片段,将其克隆到pMD19-T载体上,菌落PCR、酶切鉴定和cDNA测序结果表明成功克隆了核盘菌SsXYN基因。从pMD19-T:SsXYN载体上,用BamH I和Sal I双酶切切下目的基因片段,将该基因片段连接到原核表达载体pET32a中。菌落PCR和酶切鉴定结果显示成功构建了表达载体pET32a:SsXYN。利用热击法将该重组表达载体导入大肠杆菌BL21,获得携带SsXYN基因的大肠杆菌菌株,为进一步研究激发子诱发植物抗病性机理奠定了基础。     

西农萨能羊MAT基因的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】制备高特异性、高效价的乙酰/丙二酸单酰转移酶(MAT)多克隆抗体,为研究山羊MAT在脂肪酸代谢中的功能奠定基础。【方法】采用PCR方法扩增奶山羊的MAT基因,将其亚克隆到pET32a(+)载体得到pET32a(+)-MAT原核表达载体,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。使用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化融合蛋白,纯化的MAT蛋白经复性后进行活性检测。采用皮下免疫法将纯化的MAT蛋白免疫兔子制备多克隆抗体,用ELISA和Western blot检测血清多克隆抗体的效价和特异性。【结果】PCR扩增得到981bp的MAT基因编码区;成功构建了pET32a(+)-MAT原核表达载体,诱导表达获得了56ku的重组蛋白。活性检测表明,复性后的MAT具有转移酶活性,ELISA检测显示抗体效价达1∶128 000,经Western blot鉴定,制备的多克隆抗体能特异性检测原核表达的MAT蛋白以及在HEK-293细胞中表达的MAT蛋白。【结论】获得了具有酶活性的MAT蛋白以及高特异性、高效价的兔抗MAT多克隆抗体,为研究MAT在脂肪酸代谢中的功能提供了重要的试验工具。     

牛A组轮状病毒VP4全基因的克隆与原核表达

以G6型牛轮状病毒总RNA为模板,应用RT-PCR技术扩增牛轮状病毒VP4开放性阅读框,通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pEASy-T3载体中,成功构建出克隆质粒pEASY-T3-VP4.经双酶切后再将该基因重组于原核表达载体pET32a(+)中,构建出原核表达质粒pET32a-VP4.将pET32a-VP4转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约108 KD的融合蛋白带,成功构建了能够稳定表达VP4蛋白的基因工程菌株,为进一步研制牛轮状病毒基因工程疫苗奠定了基础.     

猪瘟病毒E2糖蛋白主要抗原域的原核表达及纯化

本实验利用PCR方法从pUC18-E2上扩增出E2基因的主要抗原域片段,长为601 bp,将该PCR产物克隆到原核表达载体pET32a上,得到pET32a-e2重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE和Western blot检测蛋白表达,目的蛋白以包涵体形式表达,其分子量42KD左右;Ni亲和层析柱纯化融合蛋白,并通过Western blot检测.pET32a-e2重组子的构建及蛋白表达与纯化为进一步制备多克隆抗体或单克隆抗体打下了基础.     

绿色荧光蛋白基因原核表达质粒pET32a-AcGFP1的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

 为了构建绿色荧光蛋白AcGFP1基因的原核表达载体pET32a AcGFP1,并诱导使其在大肠杆菌中高效表达,本研究以pIRES AcGFP1质粒为模板,采用PCR技术特异性扩增绿色荧光蛋白AcGFP1基因,通过酶切和连接使其与原核表达载体pET32a（+）构成重组子,经PCR、酶切和测序鉴定后,重组质粒转化大肠杆菌Rosetta（DE3）,用不同浓度的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达绿色荧光蛋白,经15% SDS PAGE鉴定,结果显示：重组质粒pET32a AcGFP1中的AcGFP1序列与Clontech公司的pIRES AcGFP1质粒的AcGFP1序列完全一致,表明本实验已成功构建了含有绿色荧光蛋白基因AcGFP1的原核表达质粒。此外,pET32a AcGFP1转化Rosetta（DE3）,经不同浓度的IPTG诱导,SDS PAGE检测均获得高效表达,为今后构建pET32a(+) TAT AcGFP1融合表达载体以及深入研究TAT的细胞膜穿透作用的机制奠定基础。     

水稻OsRFP1基因的原核表达与蛋白纯化

以推导的氨基酸序列分析,水稻OsRFP1基因编码一分子量为34.24kDa锌指蛋白。将OsRFP1基因编码区cDNA序列插入到pGEX4T-3载体中构建OsRFP1-gst融合基因的表达载体,并将质粒转化宿主菌大肠杆菌BL21DE3。经IPTG诱导,融合蛋白在BL21DE3细胞中获得表达。利用亲和层析的方法对融合蛋白进行了纯化,SDS-PAGE蛋白电泳显示获得一60kDa的唯一蛋白条带,即OsRFP1-GST融合蛋白。     

谷胱甘肽-S-转移酶-ASPP2融合蛋白的原核表达及纯化

为表达并初步纯化包含ASPP2活性区域和不包含其活性区域的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)-ASPP2融合蛋白。采用PCR扩增两段ASPP2基因短片段,在引物5'端和3'端分别引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点,将其克隆进入原核表达载体pGEX-4T-1;异丙基硫代-半乳糖苷(IPTG)诱导重组质粒pGEX-4T-1-ASPP2在大肠杆菌BL21(DE3)中表达同时带有谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签的融合蛋白;超声法裂解大肠杆菌,应用谷胱苷肽琼脂糖树脂纯化可溶的GST-ASPP2融合蛋白;通过SDS-PAGE和Western blot验证GST-ASPP2融合蛋白的表达。结果表明,已成功的构建了GST-ASPP2小片段融合蛋白表达载体,在Western blot分析中,4个蛋白条带均能被鼠抗GST单克隆抗体特异性识别,条带所在位置和GST-ASPP2的分子质量相符。构建了GST-ASPP2重组质粒,在大肠杆菌BL21中高效表达GST-ASPP2融合蛋白,为进一步研究ASPP2全长,N-末端和C-末端生理意义奠定了基础。     

传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)ORF086基因的表达·纯化及其抗体的制备

[目的]构建传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）ORF086基因的融合表达载体,制备抗体为进一步研究ORF086蛋白的免疫保护性提供前提条件。[方法]PCR扩增目的基因,构建重组质粒,经酶切鉴定,PCR和核酸序列分析后,IPTG诱导表达,Ni-柱纯化,注射新西兰白兔获得抗血清。[结果]扩增出ORF086基因,成功构建了重组质粒pET32a-ORF086,SDS-PAGE电泳和Western-blot分析显示,获得一条36.0 kD的融合蛋白。[结论]成功构建了原核表达载体,融合蛋白主要以包涵体的形式存在,经柱层析纯化蛋白,纯度达90%以上。     

抗玉米赤霉烯酮毒素单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白的表达

根据抗玉米赤霉烯酮毒素单链抗体的氨基酸序列及大肠杆菌偏爱密码子,用重叠延伸PCR法合成了单链抗体的重链和轻链,经（Gly4Ser）2Linker连接,获得完整的单链抗体基因ZEN2 scFv。将ZEN2 scFv与碱性磷酸酶（AP）编码序列连接形成融合蛋白基因ZEN2 scFv-AP,构建到pET载体,转化大肠杆菌菌株BL21（DE3）,经IPTG诱导表达及亲和层析纯化,在SDS-PAGE和Western blot分析中均检测到1条分子质量为75 ku的可溶性蛋白条带,ELISA分析证实,细菌表达的ZEN2 scFv-AP融合蛋白具有碱性磷酸酶活性。这一研究结果为建立快速、灵敏、经济的玉米赤霉烯酮毒素的ELISA检测奠定了基础。     

人LIF基因与增强型绿色荧光蛋白融合表达载体的构建及转染

目的：构建携带人LIF基因与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的融合表达载体,并转染人胚肺成纤维细胞,为研究LIF在维持人胚胎生殖细胞自我更新中的作用机制奠定基础．方法：以重组质粒pcDNA3．1／lif为模板,PCR扩增LIF基因,将扩增片断双酶切后连接到质粒pEGFP-N1中,形成重组表达载体pEGFP—N1／lif．并用脂质体法转染人胚肺成纤维细胞,荧光显微镜下观察,RT—PCR及Western杂交检测融合蛋白的表达．结果：成功构建融合表达载体pEGFP—N1／lif,在人胚肺成纤维细胞实现表达,检测到融合蛋白EGFP—LIF．结论重组pEGFP—N1／lif载体构建成功,可用于标记LIF蛋白、为进一步研究LIF在维持人胚胎生殖细胞自我更新中的作用机制奠定基础．     

微小牛蜱Bm86基因的克隆与原核表达

根据已发表的Bm86基因序列,设计表达型引物,利用RT-PCR技术,从微小牛蜱饥饿幼蜱的研磨物中扩增Bm86基因,将PCR产物连入pGEM-T Easy载体,构建重组克隆载体pGEM-T easy-Bm86.测序分析表明:克隆的微小牛蜱Bm86基因序列与GenBank上登录的Bm86基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为97%和95.6%.然后对重组克隆载体pGEM-T easy-Bm86进行双酶切,获得带有粘性末端的Bm86基因片段,并将此片段定向亚克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-Bm86,将其转化到BL21宿主菌中,用IPTG进行诱导表达.SDS-PAGE检测表明表达产物为分子量为88 Ku的融合蛋白,目的蛋白约占蛋白总量的39%,表达量约为1.08 mg/mL.Western blot分析表明此表达产物能被兔抗微小牛蜱阳性血清所识别.     

革胡子鲶生长激素成熟肽cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达

[目的]构建革胡子鲶生长激素基因原核表达体系。[方法]采用PCR方法,扩增得到了革胡子鲶生长激素基因成熟肽的cDNA序列,将该序列克隆至原核表达载体pRSET-A,构建重组质粒pRSET-mGH,并在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行表达。[结果]革胡子鲶生长激素成熟肽cDNA序列全长534 bp,编码1个由178个氨基酸残基组成的生长激素成熟肽,分子量为20.28 kDa,等电点为5.93。SDS-PAGE和Western blot分析表明,表达的目的融合蛋白分子量为27.41 kDa,主要以非可溶性的包涵体形式存在于菌体沉淀中。目的融合蛋白的表达量高达细菌沉淀蛋白总量的36.8%。[结论]该研究为革胡子鲶生长激素的产业化开发和应用奠定了基础。     

微小隐孢子虫Cp735基因的克隆及原核表达

采用PCR方法从微小隐孢子虫基因组中扩增cp735基因.与pMD- 18T载体连接后,挑取阳性重组子测序分析.用基因重组技术将Cp735基因克隆入原核表达载体pET-28a中,构建Cp735基因的重组原核表达载体pET28a-Cp735.将pET28a-Cp735在大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达,并用SDS- ...     

金黄色葡萄球菌wood46株eno基因的克隆及原核表达

为获得Eno的重组蛋白,采用PCR法从金黄色葡萄球菌wood46株基因组扩增eno基因,并连接到pMD18-T载体上,转化至BL21感受态细胞中;重组质粒经PCR及酶切鉴定后,送上海生工测序。将鉴定正确的质粒酶切回收产物与原核表达载体pET-32a连接,然后转化至BL21感受态细胞,对平板筛选的阳性质粒进行PCR和酶切鉴定。对鉴定正确的重组菌进行诱导表达并纯化。实验结果表明成功构建了pET32a-eno表达载体,并获得了该纯化蛋白。该实验结果为S.aureus亚单位疫苗研究奠定了一定的基础。     

陕北白绒山羊Lhx2基因cDNA序列的克隆与原核表达

根据GenBank中已发表的Lhx2基因序列设计引物,采用RT-PCR方法,从陕北白绒山羊皮肤组织克隆Lhx2基因编码区cDNA,对其进行生物信息学分析,并构建原核表达载体pET-Lhx2,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。最终获得陕北白绒山羊Lhx2基因,长1 221bp;酶切和测序结果显示,原核表达载体pET-Lhx2构建成功;SDS-PAGE和Western blot分析表明,重组原核表达载体在大肠杆菌中成功表达出目的融合蛋白。