用单克隆抗体检测禽脑脊髓炎病毒抗原

建立了抗禽脊髓炎病毒（ＡＥＶ）的单克隆抗体（ＭＡｂ）ＶＲ９－１。接种ＡＥ鸡胚适应毒Ｖａｎ Ｒｏｃｋｃｌ株、２种疫苗株和２种野毒株的雏鸡脑冰冻切片、鸡胚成纤维细胞和鸡胚脑细胞，用间接免疫荧光和免疫过氧化物酶染色检查，结果，均可与ＭＡｂ ＶＲ９－１起反应。该ＭＡｂ也可用于石蜡包埋切片的抗生物素蛋白－生物素－过氧化物酶染色。试验结果表明，该ＭＡｂ可认别ＡＥＶ毒株的一个共同抗原决定簇，可用于ＡＥＶ检测和定     

禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体制备

禽脑脊髓炎病毒（ＡＥＶ）在患鸡体内含量很低,且细胞培养的复制水平也很低,故对该病毒的研究一直不够深入,国外有关ＡＥＶ单克隆抗体的报告首见于１９９４年［１］。本研究制备了３株抗ＡＥＶ单克隆抗体,为ＡＥＶ的实验室诊断提供了一种简单、快速、可靠的方法,同时...     

利用鸡胚成纤维细胞培养禽脑脊髓炎病毒的研究

利用鸡胚成纤维细胞 (CEF)培养禽脑脊髓炎病毒 (AEV) ,经过六次盲传发现 :AEV在 CEF上无细胞病变 (CPE) ,但利用 CEF细胞上清接种 SPF鸡胚 ,可产生不同程度的 AE鸡胚病变。分别取不同时间的感染细胞上清 ,测定 AEV浓度 ,结合培养条件 ,进而确定 AEV培养的最佳时机。结果表明 :以 AEV在 CEF上培养 7天最好 ,病毒滴度可达 10 2 .8EID50 / 0 .2 ml。将经 CEF培养的 AEV差速离心 (浓缩约 5 0 0倍 ) ,接种 SPF鸡胚 ,可产生典型的鸡胚病变 ,其滴度为 8× 10 5.0 EID50 / 0 .2 m l。通过 Cs Cl密度梯度离心提纯病毒 ,在电镜下观察到了大小基本一致的病毒粒子 ,病毒直径约为 2 5 nm。利用 AEV感染的 CEF或通过“细胞飞片”制备荧光片 ,建立了间接免疫荧光快速检验 CEF是否感染 AEV的方法。     

间接免疫荧光检测禽脑脊髓炎病毒抗体

ＡＥＶＶａｎＲｏｅｋｅｌ鸡胚适应株在鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）和鸡胚神经胶质细胞（ＣＥＢ）传代,用盲传至第６代的ＣＥＦ、ＣＥＢ制成荧光标本。建立了ＡＥＶ荧光抗体检测方法,确定了待检血清稀释度１∶１０和荧光抗体ＦＩＴＣ羊抗鸡ＩｇＧ的稀释度１∶１０的工作浓度。通过对ＮＤＶ、ＭＤＶ、ＩＢＤＶ、ＡＩＶ、Ｒｅｏ等标准阳性血清的交叉试验,证实该法特异性强,且简单、方便、经济,适合于鸡群ＡＥＶ抗体的检测。     

间接免疫荧光检测禽脑脊髓炎病毒抗体

ＡＥＶ Ｖａｎ Ｒｏｅｋｅｌ鸡胚适应株在鸡胚成纤维细胞和鸡胚神经胶质细胞传代,用盲传至第６代的ＣＥＦ,ＣＥＢ制成荧光标本。建立了ＡＥＶ荧光抗体检测方法,确定了待检血清稀释度１：１０和荧光抗体ＦＩＴＣ羊抗鸡ＩｇＧ的稀释率１：１０的工作浓度。通过对ＮＤＶ,ＭＤＶ,ＩＢＤＶ,ＡＩＶ,Ｒｅｏ等标准阳性血清的交叉试验,证实该法特性强且简单,方便经济,适合于鸡群ＡＥＶ抗体的检测。     

禽脑脊髓炎病毒的提纯和电镜观察

将禽脑脊髓炎病毒ＶａｎＲｏｅｋｅｌ株、１１４３株和Ｎ９３７分别经卵黄囊接种于６日龄ＳＰＦ鸡胚，接毒１０日后解剖鸡胚，收集尿囊液，采集脑，消化道和胰腺，用玻璃匀浆器制备２０％的组织悬液。     

禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体的制备及鉴定

选用AEV(VR株 )CEF适应毒制备抗原 ,免疫Balb/c小鼠。应用杂交瘤技术以间接ELISA方法筛选获得一株分泌抗AEV(VR)单克隆抗体的杂交瘤细胞。制备细胞上清及腹水进行单抗特性鉴定 ,经染色体计数、免疫球蛋白类及亚类测定、特异性试验、稳定性试验、SDS PAGE电泳 ,表明该杂交瘤细胞染色体数目介于 90～ 110之间 ,该单克隆抗体亚类为IgG2a,分子量为 142KD ,ELISA测定细胞上清效价为 1∶1× 10 4 ,腹水效价为 1∶1× 10 6,与其它病原无交叉反应 ,抗体分泌稳定。     

禽脑脊髓炎病毒的分离与初步鉴定研究

通过SPF鸡胚连续快速传代,从自然发病雏鸡脑组织中分离出一株食脑脊髓炎病毒（AEV）,经鸡胚接种,雏鸡接种、琼脂扩散试验和电镜观察,初步鉴定该株病毒为AEV,暂命名为AEV-SD961株。     

禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体的制备与初步应用

利用提纯的禽脑脊髓炎病毒（AEV）Van Roekel株作为免疫原，免疫6周龄BALB／c小鼠，采取其脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞融合，用间接ELISA法筛选，间接免疫荧光法（IFA）和免疫组织化学法鉴定，经3次亚克隆得到了稳定分泌抗AEV单克隆抗体的杂交瘤细胞株F11和G2，制备了腹水，并利用该单克隆抗体初步建立了Dot—ELISA、间接ELISA和IFA等特异性检测AEV抗原的方法。     

禽流感病毒单克隆抗体的制备及其抗蛋白抗原的分析

以纯化的H9N2亚型禽流感病毒为抗原,免疫BALB/c小鼠,细胞融合后,经间接ELISA和血凝抑制试验(HI)筛选,获得了8株能稳定分泌抗禽流感病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。特异性试验证明,8株杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水的特异ELISA抗体效价可达1∶3.2×103~1∶5.1×106,其中2株HI效价达212。8株单抗与H5亚型血凝素分型抗原不发生血凝,与减蛋综合征(EDS-76)病毒、传染性支气管炎病毒(IBV)、新城疫病毒(NDV)均不反应。亚类鉴定证实,除1C7单抗为IgG2b外,其他7株均为IgG1亚类。Westernblotting试验分析初步表明,8株单抗至少针对纯化病毒粒子3种不同的蛋白抗原,其中3株针对核蛋白(NP),2株针对基质蛋白M1,2株针对血凝素HA/HA1。对感染细胞的Western blotting分析结果与纯化病毒结果基本一致,其中1株未明显沉淀纯化病毒粒子蛋白的单抗可以与感染细胞的M2蛋白多肽反应。     

抗H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白特异性单克隆抗体的研制及鉴定

以抗H5亚型禽流感病毒（AIV）JSD株鸡胚尿囊液免疫8周龄BALB/c小鼠,第4次免疫后取其脾淋巴细胞与SP2/0-Ag-14骨髓瘤细胞融合,用血凝抑制试验（HI）对杂交瘤进行筛选,经3次亚克隆后,共获得4株针对血凝素（HA）蛋白的特异性单克隆抗体,分别命名为：2D2、2C8、3D3和3D11。该4株单抗的小鼠腹水的HI效价在2^13～2^15,ELISA效价为1.2×10^5～5.1×10^5。亚类鉴定结果表明,2D2和3D11属于IgG1,2C8属于IgG3,3D3属于IgG2a亚类;特异性试验结果表明,上述4株单抗仅与H5 AIV毒株发生特异性反应,而不与其他亚型AIV以及NDV、IBV和EDSV-76等病毒反应;鸡胚中和试验结果显示,4株单抗均具有较好的中和活性。本研究成功获得4株针对H5 AIVHA蛋白的特异性单抗,为临床H5 AIV的血清学监测及鉴定提供了必需的试剂。     

H3亚型禽流感病毒血凝素特异性单克隆抗体的制备

以H3亚型禽流感病毒(AIV)免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用血凝抑制试验(HI)筛选阳性杂交瘤细胞并克隆化。结果获得了4株针对H3亚型禽流感病毒血凝素的单克隆抗体,分别命名为1D7、1F9、5A4、5F5。这些单克隆抗体小鼠腹水HI效价为212～214。用H1、H6、H10亚型禽流感病毒各2株,H4、H5、H9和新城疫病毒(NDV)各1株进行特异性试验。结果表明:所有这些单抗仅与H3亚型AIV发生特异性HI反应,而不与其他亚型AIV及NDV反应。用28株H3亚型禽流感病毒进行排谱试验,结果证明:4株单抗均具有广谱性,其中1F9、5A4、5F5与受试的28株H3亚型AIV均反应,而1D7只与其中的26株反应。以上单抗将为控制畜禽及人类的流感提供必需的诊断试剂。     

H5亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备

禽流感病毒基于其表面囊膜蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）表面抗原的不同，可分为不同的亚型，各亚型之间变异较大，其中H5亚型为强毒之一，也是引发2004年世界禽流感暴发的主要血清亚型。我国现阶段具有检测禽流感病毒的一系列较成熟的诊断方法，包括病毒检测和抗体检测，其中病毒的检测对于禽流感的确诊具有十分重要的价值。在病毒检测的方法中，病毒分离需要的实验周期较长，难以达到对高致病性禽流感快速诊断的需要；RT—PCR方法常由于多种客观因素的干扰而出现假阳性或假阴性结果，且检测成本较高；     

禽白血病病毒群特异性抗原单克隆抗体的制备与鉴定

为制备禽白血病病毒(ALV)群特异性抗原的单克隆抗体(MAb),本研究从ALV-J病毒株感染DF-1细胞的冻融裂解液中提取DNA,通过PCR方法扩增出ALV群特异性抗原p27基因,并将其克隆至pMD18-T载体中,酶切鉴定后进行序列测定和分析。最后将p27基因亚克隆至载体pET-30a(+)中,转化受体菌BL21,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE检测获得融合蛋白。经过western blot检测,表达的蛋白具有良好的反应原性。将纯化的p27蛋白作为抗原,免疫7周龄BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,获得5株能稳定分泌特异性MAb的杂交瘤细胞株。5株MAb与纯化的p27蛋白以及不同亚群ALV可以发生特异性反应。所制备的MAb为禽白血病的诊断方法研究奠定了基础。     

Preparation and characterization of monoclonal antibodies against an avian reovirus

Thirteen monoclonal antibodies against avian reovirus strain Uchida were derived. Of the 13 antibodies, three (MAb1, MAb2, and MAb3) had the ability to neutralize the infectivity of the virus. MAb1 neutralized strains Uchida, CS-108, and TS-142 equally. MAb2 neutralized the same three strains, but the activity of neutralization was 10 times higher against Uchida than against CS-108 and TS-142. MAb3 neutralized only strain Uchida. It seems that MAb1 and MAb2 have a rather broad neutralization activity and that MAb3 has a type-specific activity. These data indicate that there are both type-specific and more broadly specific neutralization epitopes in avian reovirus particles, as in mammalian reoviruses. In Western blot analysis, MAb1 bound to a sigma protein of strain Uchida, so it was suggested that this protein carries the epitope of the less specific neutralizing activity.     

抗禽流感病毒NS1蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的初步分析

为制备抗禽流感病毒(AIV)NS1蛋白的单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位鉴定,本研究以原核表达并纯化的NS1重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA进行筛选,制备的D7和D9 2株能够稳定分泌抗NS1蛋白MAb的杂交瘤细胞,亚型鉴定均为IgG1型,轻链均为k链.Western blot鉴定表明,这2株MAbs均能够识别NS1重组蛋白.间接免疫荧光鉴定表明,这2株MAbs均能够识别真核表达的NS1蛋白.利用噬菌体展示技术得到D9对应的短肽WNLNTV,与NS1蛋白aa 182～aa 187基本匹配,提示182WNDNTV187为NS1蛋白的一个线性表位.该结果为进一步研究NS1蛋白的结构和功能以及建立诊断方法奠定了基础.     

Detection of avian encephalomyelitis virus

Methods for the detection of two strains of avian encephalomyelitis virus (AEV) in chick embryo brain cell cultures and chickens were compared. It was found that the agar gel precipitin test (AGPT) and the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) carried out on the serum of inoculated chickens were more sensitive than either the indirect fluorescent antibody test in cell cultures or the detection of clinical signs in chicks. On the basis of results obtained in this experiment the effects were then determined of routes and time of inoculation of chickens on the detection of AEV. It was found that birds infected at two weeks old produced higher antibody titres than one-day-old birds and the AGPT and ELISA detected comparable levels of antibody in them. It was recommended that the tests to detect the presence of AEV as a contaminant of vaccines be replaced by a serological test carried out on chicks inoculated intramuscularly at two weeks old.