奶牛SRY基因核心保守区真核表达载体构建及序列分析

SRY基因是哺乳动物性别分化与控制的主导基因,参与有序的、多层次调控性别分化和控制的过程。本研究从牛血中提取总RNA,设计特异性引物,利用RT-PCR技术扩增出SRY基因HMG box基因片段,将该片段与pMD18-T载体连接并转化到大肠杆菌(E.coliTop)10中,提取质粒并用EcoRⅠ、AvrⅡ酶消化,将消化后的目的基因纯化并回收,与经同样的酶消化后并纯化回收的载体pPIC9K连接并转化到E.coliTop10,获得重组表达质粒pPIC9K-SRYHMG box,经PCR、酶切、测序验证了此载体构建成功,为下一步使用毕赤酵母表达SRY蛋白打下基础。     

奶牛SRY基因核心保守区真核表达载体构建及序列分析

SRY基因是哺乳动物性别分化与控制的主导基因,参与有序的、多层次调控性别分化和控制的过程.本研究从牛血中提取总RNA,设计特异性引物,利用RT-PCR技术扩增出SRY基因HMG box基因片段,将该片段与pMD18-T载体连接并转化到大肠杆菌(E.coli Top)10中,提取质粒并用EcoRⅠ、AvrⅡ酶消化,将消化后的目的基因纯化并回收,与经同样的酶消化后并纯化回收的载体pPIC9K连接并转化到E.coliTop10,获得重组表达质粒pPIC9K-SRYHMG box,经PCR、酶切、测序验证了此载体构建成功,为下一步使用毕赤酵母表达SRY蛋白打下基础.     

家蚕抗菌肽基因Cecropin-D的克隆及其真核表达载体的构建

从家蚕中提取总RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,获得了家蚕Cecropin-D基因编码区的cDNA,扩增出家蚕抗茵肽Cecropin-D成熟肽基因片段,重组克隆入pMD18-Tvector载体,经DNA测序,该基因为186bp,编码62个氨基酸。用限制性内切酶切下目的基因,插入毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建真核表达栽体pPlC9K-CD。本实验的研究为获得超量表达的高活性表达抗菌肽Cecropin-D以及为研制具有抗菌活性的新型基因药物奠定了基础。     

哺乳动物SRY基因研究进展

 尽管SRY基因的发现已有10多年，但到目前为止，人们还没有弄清楚SRY基因是如何调控胚胎双性腺发育成睾丸的。经过10多年的研究，人们对SRY基因有了新的认识。作者综述了SRY基因的功能，SRY蛋白以及SRY基因在性腺中表达的最新研究进展。     

性别决定及SRY基因在胚胎发生中的表达

性别决定包括初级性别决定和次级性决定。前者是由染色体决定性腺的发育方向,后者通常是指由性腺分泌的激素决定性腺以外的身体表型,即第２性征。新的研究发现,哺乳动物的雄性是由Ｙ染色体短臂上的一个被称为ＳＲＹ的基因所决定的。     

哺乳动物SRY基因研究进展

尽管SRY基因的发现已有10多年，但到目前为止，人们还没有弄清楚SRY基因是如何调控胚胎双性腺发育成睾丸的。经过10多年的研究，人们对SRY基因有了新的认识。作者综述了SRY基因的功能，SRY蛋白以及SRY基因在性腺中表达的最新研究进展。     

性别决定及SRY基因在胚胎发生中的表达

性别决定包括初级性别决定和次级性别决定。前者是由染色体决定性腺的发育方向,后者通常是指由性腺分泌的激素决定性腺以外的身体表型,即第２性征。新的研究发现,哺乳动物的雄性是由Ｙ染色体短臂上的一个被称为ＳＲＹ的基因所决定的。     

在缺少SRY基因的男性个体中SOX9的表达上调

在哺乳动物中,正常的性别是由是否存在Y-染色体基因SRY所决定的。SRY基因在未分化的性腺中表达以后,大量与睾丸分化相关的转录因子和生长因子基因开始特异性表达。然而,在XX雄性个体中这些基因一定在缺少SRY基因的情况下得到上调,但是XX雄性个体中缺少SRY基因的原因还不清楚。作者检测了标记的典型性腺基因在缺少SRY基因的XX雄性睾丸中的表达。结果发现,RT-PCR和免疫组化研究结果显示在缺少SRY基因的XX雄性的睾丸组织中SOX9,DAX-1,Ad4BP/SR-1,WT-1,GATA-4和MIS得到了表达。这些病人睾丸组织中SOX9的表达水平是正常XY个体睾丸组织中的1.9倍,而Ad4BP/SF-1,DAX-1和MIS的表达水平SRY缺少的XX个体睾丸低于XY个体的睾丸。所有的XX病人被发现在每个二倍体基因组中带有两个拷贝的SOX9基因,如同正常的XX雌性和XY雄性。XX雄性病人带有两个拷贝的DAX-1基因和正常的XX雌性一样,而正常XY雄性带有1个DAX-1基因。资料表明Lesions影响SOX9的表达是缺少SRY基因的XX雄性性别决定的关键因素,并且Ad4BP/SF-1,DAX-1和MIS表达水平的降低有...     

重组奶牛神经肽Y基因的原核表达载体的构建、表达及纯化

<正>在奶牛的饲养过程中,由于高产品种的引进、培育,高能饲料的开发、利用,规模化饲养程度的提高等众多方面的原因,使得酮病和脂肪肝的发病率长期以来一直居高不下。我国奶牛酮病的发病率占泌乳牛的15%～30%,脂肪肝的发病率超过30%,又     

用PCR扩增兔SRY基因的研究

用家兔外周血提取基因组DNA,根据欧洲家兔SRY基因的cDNA序列中开放性阅读框部分设计引物,采用PCR技术对基因组DNA进行了SRY基因检测。结果显示,SRY基因(+)是雄性决定基因,这对于幼兔的性别鉴定、性别选择及在胚胎时期诊断性连锁疾病有重要意义。     

奶牛CRY1基因真核表达载体构建、生物信息学分析及组织表达谱研究

【目的】扩增奶牛隐花色素昼夜节律调节因子1(cryptochrome circadian regulator 1,CRY1)基因全长编码区(coding sequence, CDS),构建该基因的真核表达载体并对其进行生物信息学分析,检测奶牛CRY1基因的表达谱,为后续探究CRY1蛋白的生物学功能提供参考。【方法】以奶牛肝脏组织cDNA为模板,PCR扩增CRY1基因CDS区,将其与酶切线性化的pcDNA3.1-3HA空质粒以同源重组法连接,重组质粒命名为pcDNA3.1-3HA-cCRY1;利用在线软件对奶牛CRY1基因进行生物信息学分析。将空质粒pcDNA3.1-3HA和重组质粒pcDNA3.1-3HA-cCRY1转染至HEK293T细胞,利用Western blotting技术检测奶牛CRY1基因在蛋白水平的表达;利用实时荧光定量PCR检测CRY1基因在奶牛不同组织中的表达量。【结果】试验成功获得1 764 bp的奶牛CRY1基因CDS区序列,且成功构建pcDNA3.1-3HA-cCRY1真核表达载体。奶牛CRY1基因与牦牛、山羊、绵羊相似性在98%以上,且遗传距离较近。生物信息学...     

基于SRY基因鉴定新疆野兔性别

为得到形态上性别鉴定特征十分缺乏的新疆野兔样本的性别数据,本研究采用双重PCR法同时扩增SRY基因和APP基因,通过分析PCR产物,对采自新疆9个地区共121例未知性别的野兔样本进行性别鉴定。在验证PCR结果的可靠性后,鉴定出雌性样本69例,雄性样本52例,性别比例经统计学分析后接近1∶1,符合实际。这为后续研究新疆野兔的物种分类、群体遗传学和分子进化等方面提供了基础数据,也在兔类资源的管理保护和开发利用方面有着一定的实际意义。     

SRY基因研究进展及其在动物性别鉴定中的应用

SRY基因是哺乳动物雄性的性别决定基因。研究发现SRY基因的启动能够促进雄性发育,从而控制动物性别。因此SRY基因在动物性别鉴定和性别控制中发挥了重要的独特作用。本文从3个方面阐述了应用SRY基因进行性别鉴定,同时又论述了利用SRY基因进行性别控制的应用现状和发展方向,以期为将来能有效利用该基因达到性别控制提供思路。     

皮肤组织特异性VEGF基因抑制表达载体的构建

基于四环素基因表达调节系统,构建可特异性抑制皮肤组织VEGF基因表达的四环素转录沉默子表达载体。设计并合成含有限制性内切酶酶切位点的引物,以人类基因组DNA和实验室现有质粒为模板,分别PCR扩增出皮肤组织特异性启动子K14序列和四环素转录沉默子tet R-Krab序列,依次插入到真核表达载体p CAGGS的多克隆酶切位点,构建p CAGGS-K14-tet R-Krab载体。酶切鉴定和DNA测序结果表明载体构建正确,可以用于小鼠受精卵显微注射。成功构建了可特异性抑制皮肤组织VEGF基因表达的转录沉默子表达载体,为建立皮肤组织特异性VEGF基因抑制鼠模型奠定基础。     

香猪SRY基因的克隆及序列分析

试验参照猪SRY基因保守序列设计了1对引物,对香猪基因组DNA进行PCR扩增。将扩增产物通过T—A互补法克隆到质粒pGEM—T载体中,筛选阳性克隆进行DNA测序。测序结果显示,香猪SRY基因开放阅读框全长627bp,编码227个氨基酸。其中核心区域HMG—box长237bp,并且编码79个氨基酸。与白鲸、人、牛、绵羊4种哺乳动物的SRY基因序列相比较,香猪和白鲸的SRY序列具有较高的相似性,相似度达82．1％。序列相似性和邻接法聚类树的结果均显示,在SRY基因中香猪和白鲸有着较近的亲缘关系,表明以白鲸为代表的鲸目和以香猪为代表的偶蹄目有较近的亲缘关系。     

扩增SRY基因鉴定牛、羊胚胎性别的初步研究

本研究利用本试验室设计的SRY基因3对常规PCR引物扩增牛SRY基因和羊的SRY基因,结果表明:第2对引物扩增出公牛和公羊基因组的DNA 750 bp左右清晰条带,而母牛、母羊基因组DNA无此扩增条带,说明第2对引物可以应用于牛和羊的早期胚胎性别鉴定;     

奶牛干细胞多能性基因Nanog和Lin28克隆分析及其逆转录病毒表达载体的构建与包装

以50~60日龄的Holstein奶牛胎儿原始生殖嵴组织为材料,通过RT-PCR的方法克隆奶牛Nanog与Lin28基因开放性阅读框(ORF)全序列。序列全长分别为903 bp和618 bp。所克隆的奶牛Nanog与Lin28基因序列与GenBank中已经发表的参考序列进行比对同源性均为100%。将扩增的基因片段经过酶切后亚克隆到反转录病毒载体pMSCVneo的多克隆位点,经过酶切、PCR和测序鉴定正确后,应用lipofectamine2000介导转染PT67包装细胞,经过14 d G418连续抗性筛选,挑选抗性集落扩大培养。收集病毒上清经过RT-PCR与透射电镜检测,并用NIH3T3细胞测定病毒滴度。结果表明,病毒上清中含有逆转录病毒颗粒,Nanog与Lin28基因在筛选后的包装细胞PT67细胞中均有转录,病毒上清感染滴度值分别达到7.5×107cfu/mL和9.19×107cfu/mL。结果表明,本试验已经成功克隆出奶牛Nanog与Lin28基因开放性阅读框全序列,并建立高效、稳定产生包含有pMSCV-Nanog与pMSCV-Lin28质粒的感染性病毒颗粒的包装细胞株,为进一步产生奶牛诱导性多能干细胞(Induced pluripotentstem cells,iPSCs)奠定基础。     

鸽新城疫F基因毕赤酵母表达载体的构建

应用特异性引物,从鸽新城疫F基因重组质粒pMD-18T-PPMV-1-F中PCR扩增F基因,用EcoRⅠ和NotⅠ分别对扩增产物和酵母表达质粒pPIC9K进行双酶切,将F基因定向克隆到pPIC9K的EcoRⅠ和NotⅠ位点,构建重组质粒pPIC9K-PPMV-1-F,对重组质粒鉴定后用SalⅠ酶切使其线性化,电击转化至感受态毕赤酵母GS115菌中,影印接种法筛选G418抗性菌株,提取酵母染色体DNA进行PCR鉴定,筛选出鸽新城疫F基因的高拷贝重组菌株。     

扩增SRY基因鉴定牛、羊胚胎性别的初步研究

本研究利用本试验室设计的SRY基因3对常规PCR引物扩增牛SRY基因和羊的SRY基因,结果表明：第2对引物扩增出公牛和公羊基因组的DNA 750 bp左右清晰条带,而母牛、母羊基因组DNA元此扩增条带,说明第2对引物可以应用于牛和羊的早期胚胎性别鉴定;