低氮胁迫对蛋白核小球藻生化组分和絮凝性能的影响

【目的】蛋白核小球藻 (Chlorella pyrenoidosa) 蛋白含量高,富含各种必需氨基酸和多种营养保健因子,2012年被我国增列为新资源食品。本文以蛋白核小球藻 (Chlorella pyrenoidosa) 为材料,研究低氮胁迫对自养和兼养来源的藻细胞生化组分和絮凝性能的影响,为开发应用提供技术支撑。【方法】分别以BG11基本培养基和BG11添加10 g/L葡萄糖接种培养蛋白核小球藻,获得自养和兼养来源的种子藻细胞。以BG11基本培养基中18 mmol/L硝酸钠为正常供氮对照,设置硝酸钠水平为3、6、9 mmol/L的低氮胁迫培养基。种子藻细胞培养14天后,分别采用干重法、脂染色法测定藻细胞干重生物量和总脂含量;蛋白和淀粉含量的测定采用紫外分光光度法;用三维荧光光谱分析藻细胞胞外聚合物 (extracellular polymeric substances,EPS) 组分和含量。【结果】1) 自养与兼养来源的蛋白核小球藻在低氮胁迫处理下均能生长,自养来源藻细胞更能迅速感应低氮胁迫的条件变化,转接后第1天即开始快速生长。四个胁迫处理中,以硝酸钠6 mmol/L组藻细胞干重和油脂含量最高。该低氮胁迫培养4天后,所有藻细胞样品生长到达稳定期,此时自养与兼养来源的藻细胞干重分别为2.56 g/L和4.62 g/L,藻细胞油脂含量分别为15.5%和39.3%,与正常对照组 (硝酸钠 18 mmol/L) 相比均显著增加。2) 低氮胁迫处理能提高蛋白核小球藻的油脂产率。其中6 mmol/L胁迫处理4天后,兼养藻细胞油脂产率最高,达到129.56 mg/(L·d),同比是自养来源藻细胞的7.95倍。3) 兼养组藻细胞胞内外蛋白、淀粉 (多糖) 初始含量显著高于自养组。藻细胞油脂、蛋白、淀粉含量在低氮胁迫处理培养2天或3天内均显著下降,之后低氮胁迫组藻细胞胞内外蛋白含量持续下降,细胞油脂与胞内淀粉含量开始回升,在第4天出现明显的拐点。4) 6 mmol/L低氮胁迫处理4天后,自养来源藻细胞中,对藻细胞絮凝有促进作用的蛋白类色氨酸物质含量比对照组增加40.3%,兼养来源藻细胞蛋白类色氨酸物质和对藻细胞絮凝有抑制作用的胡敏酸和富里酸类腐殖酸物质的含量分别为对照组的83.6%、74.8%和54.8%。兼养和自养组藻细胞自絮凝率分别为78.5%和80.3%,均比对照组显著提高。【结论】自养与兼养来源的蛋白核小球藻对低氮胁迫处理的响应存在差异,藻细胞生化组分含量变化受培养基供氮水平和培养时间的影响。低氮胁迫通过影响藻细胞促进和抑制藻细胞自絮凝的生化组分的比例,显著提高其收获期的自絮凝率。针对供试藻种,以硝酸钠6 mmol/L低氮胁迫处理4天对蛋白核小球藻的油脂产率和絮凝性能的提升效果最佳。     

蛋白核小球藻对铅、镉和汞吸附速率及其影响因素的研究

通过吸附时间、藻细胞密度和重金属浓度等参数条件的变化,研究蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）对海水中Pb2＋、Cd2＋和Hg2＋的吸附。结果表明,蛋白核小球藻对Pb2＋、Cd2＋和Hg2＋的吸附率分别在2～4d内快速升高后趋于平衡,而吸附量在第1d达到最大值后逐渐变小。藻细胞密度为1×106cell·mL-1时,吸附量最大,当藻细胞密度达到4×106cell·mL-1时,吸附率增幅减小并趋于平衡。随着Pb2＋、Cd2＋和Hg2＋浓度升高,吸附率呈逐渐变小趋势,吸附量却增加。蛋白核小球藻吸附Pb2＋符合Freundlich等温线方程,而吸附Cd2＋和Hg2＋符合Dubimim-Radushkevich等温线方程。蛋白核小球藻对Pb2＋、Cd2＋和Hg2＋的最大吸附量分别为4.84、37.7mg·L-1和5.61μg·L-1,吸附能力顺序为Cd2＋〉Pb2＋〉Hg2＋。     

环绕式LED光质对蛋白核小球藻生长代谢影响

微藻是一类生长速度快、环境适应能力强的单细胞自养生物,利用其生产的碳水化合物、蛋白质、油脂等已在食品、水产养殖、医疗保健等领域广泛应用,然而,高养殖成本始终是限制其产业化发展的难点之一。光源是微藻培养的重要环境因子,现有研究多报道波段及光照周期对微藻生长代谢的影响,其所用光源几乎均采用单侧排布,光在藻液中分布的均匀性和稳定性易受藻液光径、藻密度等影响。该研究以商业化较成熟的微藻——蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）为对象,将环绕式LED人工光源应用于微藻培养中,采用光强为100 μmol/(m²·s)的白、红、黄、绿、蓝、紫6种光质分别培养蛋白核小球藻21 d,每日监测藻液中生物量和光合色素含量变化,测定培养末期（D21）藻体中的蛋白质、油脂和碳水化合物含量及脂肪酸组成和丰度,分析不同波段光质对蛋白核小球藻生长代谢的影响。结果显示,相较于对照组（白光）,绿光和蓝光分别培养蛋白核小球藻7 d和9 d后其生物量显著提高（P<0.05）,培养末期（D21）绿光组和蓝光组的生物量分别提高了24.4%和8.0%（P<0.05）;藻液中叶绿素a的变化趋势与生物量变化类似,但绿光组藻体中总光合色素质量分数却显著低于紫光组（P<0.05）,可能与微藻对紫光的吸收利用率低有关（需要合成更多光合色素来获取光能）;红光组中碳水化合物质量分数增加11.5%而油脂质量分数显著下降23.8%（P<0.05）;蓝光最利于油脂累积,显著提升26.2%（P<0.05）;紫光使蛋白核小球藻的碳分配从碳水化合物向蛋白质合成方向分流;脂肪酸分析表明,绿光和紫光最利于总脂肪酸累积,较对照组（39.5‰）分别提升20.1%和18.2%（P<0.05）;绿光和蓝光更有利于多不饱和脂肪酸的合成。研究结果可为蛋白核小球藻胞内碳分配的优化调控提供有效的光源配置方案,为蛋白核小球藻的高效优质生产提供理论参考。     

pH与氟对莱茵衣藻和蛋白核小球藻胞外碳酸酐酶活性及光合效率的影响

本文研究了不同pH（5.0、7.0和9.0）和F-浓度（0.1、1、10、50、100、200mmol·L-1）对莱茵衣藻和蛋白核小球藻的胞外碳酸酐酶活性、PSⅡ实际光合效率ΦPSⅡ和叶绿素a合成量的共同影响。结果表明：在低于1mmol·L-1的F-作用下,两种微藻的生理和生长指标主要受pH影响;酸性条件下,两种微藻胞外碳酸酐酶活性显著低于中性和碱性条件时,ΦPSⅡ随pH升高而增大,叶绿素a合成量随pH升高而增加。在高于1mmol·L-1的F-作用下,两种微藻的生理及生长指标受F-和pH共同影响,且F-的作用大于pH的作用,胞外碳酸酐酶活性随着F-浓度升高先增加后降低,同时随着pH下降而降低;ΦPSⅡ和叶绿素a合成量则随着F-浓度升高和pH下降而迅速下降。胞外碳酸酐酶活性、ΦPSⅡ和叶绿素a合成量都能够作为指示微藻受氟胁迫的指标,以微藻为材料除去自然界氟超标水体中的超标F-,理论上是可行的。     

养殖污水中蛋白核小球藻的分离鉴定及其污水处理效果

利用BG-11培养基从养殖污水中分离和筛选到小球藻,采用相差显微镜对其外部形态进行观察、傅里叶红外光谱分析球藻组成、X-ray方法分析其晶体组成、凯氏定氮以及有机溶剂萃取方法分别测定其蛋白质以及脂质含量、丙酮萃取法测定其叶绿素a以及国标法测定其处理污水效果。结果表明:根据相差显微镜对球藻外部观察,初步判断该小球藻为蛋白核小球藻;红外光谱测定结果表明,在波数1 080和1 240 cm~(-1)处均有明显的吸收峰,证明了该研究分离的小球藻含有大量蛋白质以及糖类和脂类成分;X-衍射分析结果显示在32°和20°两处均有明显的吸收峰,证明了本研究分离的小球藻含有蛋白质和脂类成分;定量成分测定表明该蛋白核小球藻蛋白质量分数为45.6%,脂质质量分数为8.1%;污水处理结果为化学需氧量去除率为70.9%;总氮、总磷去除率分别为23%和34.7%。该研究对蛋白核小球藻蛋白含量、脂肪含量的测定以及提取进行了分析,证明了蛋白核小球藻对养殖场污水的处理具有很好的效果,为生物新资源的开发以及水环境治理提供了一定的参考。     

季铵盐阳离子表面活性剂对普通小球藻和斜生栅藻的急性毒性

以普通小球藻（Chlorella vulgaris）和斜生栅藻（Scenedesmus obliquus）为受试生物,采用批量培养方法研究了13种季铵盐阳离子表面活性剂（QACS,烷基链长度CL=8~18）对两种淡水藻的急性毒性。结果表明,13种QACS对普通小球藻和斜生栅藻的96h-EC50分别在0.108~9.472mg·L-1和0.085~12.188mg·L-1之间;且随着烷基链长度CL的增加,取代基相同的QACS对两种淡水藻的急性毒性逐渐增大。抛物线模型较线性方程能更好地拟合QACS的急性毒性参数lg（1/EC50）与辛醇/水分配系数lgKow以及与烷基链长度CL之间的关系,且对普通小球藻和斜生栅藻的拟合趋势相同,可为预测类似化合物对淡水藻的急性毒性提供参考。     

高产多糖小球藻新品系选育及其对南美白对虾的促生长和免疫调节作用

小球藻是当前全球研究与应用规模仅次于螺旋藻的经济微藻,多糖为其主要的生物活性成分。针对现有小球藻品种的多糖含量普遍偏低这一关键生产技术难题,本文以12株小球藻中水溶性多糖含量最高的椭圆小球藻Chl-ZN5为出发品系,先经700Gy的60Coγ-射线辐照,再用0.2%的EMS处理4h后,转接到固体培养基上,并用3kGy的60Coγ-射线辐照为压力进行筛选,得到1株高产多糖突变体Chl-ZN5-M2,其水溶性多糖含量和产率分别达25.3%和4.4mg·L-1·d-1,比Chl-ZN5的分别高70.9%和76%,而且在工厂化培植中性能稳定。在南美白对虾日粮中添加0.2%的Chl-ZN5-M2藻粉,能显著改善南美白对虾的免疫活性及相关生化指标,并使生长速率与成活率分别提升26.1%和3.3%。     

香蕉束顶病毒海口分离物核穿梭蛋白（NSP）的纯化及抗血清制备

本研究以本实验室保存的含重组载体pDEST17-NSP的原核表达菌株E．coliBL21（DE3）为材料，于25℃、0．1mmol／LIPTG条件下诱导4h，集菌后超声波破碎，获得以包涵体形式表达的约20kD的融合蛋白。实验结果表明，将沉淀的融合蛋白溶于含6mol／L尿素的Binding Buffer中，再经Ni^2＋-NTA亲和层析纯化后，可获得高纯度的融合蛋白。将纯化融合蛋白经12％SDS-PAGE电泳，切胶回收目的带，液氮研磨并按1：1（W／V）混合佐剂，4次免疫家兔，获得BBTV病毒核穿梭蛋白的特异性抗血清。以融合蛋白作抗原，间接ELISA法测定其抗血清效价为1：5000。田间检测样品的最佳抗血清工作浓度为1：500。Western Blot鉴定结果表明抗血清能与目的蛋白特异性结合。本研究的结果将为下一步NSP基因转录调控和蛋白功能研究奠定一定基础。     

两种季铵盐阳离子表面活性剂对水生生物的毒性效应

为评价两种季铵盐阳离子表面活性剂对水生态的安全性,运用评价化学品对水生生物毒性的标准试验方法,测定了十二烷基二甲基苄基氯化铵（1227）和双八、十烷基季铵盐（C8-10）两种季铵盐阳离子表面活性剂对3种水生生物（斜生栅藻、大型溞和斑马鱼）的毒性。结果表明,在0.05~0.5 mg.L-1的浓度范围内,1227、C8-10对斜生栅藻的毒性表现出明显的剂量-效应关系,随处理浓度的增大抑制效应增强,0.5 mg.L-1C8-10对斜生栅藻具有杀灭作用;同时1227、C8-10与斜生栅藻还存在时间-效应关系,处理后抑制率随时间呈先升高后下降的趋势,72 h时抑制率最高。1227和C8-10对斜生栅藻96 h的EC50分别为0.109、0.103 mg.L-1,对大型溞的48 h LC50分别为1.56×10-2、1.45×10-2mg.L-1,对斑马鱼的96 h LC50分别为2.36、2.19 mg.L-1。C8-10对3种水生生物的毒性均高于1227,两种季铵盐阳离子表面活性剂对大型溞和斑马鱼的致死率（LC50）均随作用时间延长逐渐减小。     

传染性支气管炎病毒青岛腺胃分离株（SD／97／02）核衣壳蛋白基因的序列测定和分析

传染性支气管炎病毒(IBV)为冠状病毒科,冠状病毒属套式病毒目(Nidovirilaes).此病毒可引起鸡急性、高度接触性传染病.IBV的基因组具有先导--引物转录机制,使病毒具有很高的变异率.现已有呼吸型、肾型、肠型和减蛋型.1995年,中国出现一种以腺胃病变为主要特征的鸡传染病,初步鉴定为IBV的又一变异株.IBV的结构蛋白包括纤突蛋白(s1)、基质蛋白(M)和核衣壳蛋白(N).现在大多数研究的重点集中在使机体诱导特异性的中和抗体.纤突蛋白基因s1亚单位上,S1基因的5′末端的高变区(highvariationregion,HVR)的微小变异即可导致毒株之间不能互相保护甚至产生新的组织嗜型.     

基于冻融辅助超声波法的小球藻多糖提取工艺优化

为了优化水提法小球藻多糖提取的工艺,该文在单因素试验的基础上,选择水料质量比、超声波功率、提取时间、冻融-超声波次数进行4因素3水平的正交试验提取小球藻多糖,采用三氯乙酸法去除游离蛋白质。结果表明:小球藻多糖最佳提取条件为水料质量比15,超声波功率600W,超声波作用时间6min和冻融-超声波2次,小球藻粗多糖得率为5.918%。三氯乙酸法脱游离蛋白质以pH值为4为最佳,多糖回收率为57.84%。该研究可为从小球藻中大规模分离和提取以及纯化多糖提供参考。     

小球藻粉水热催化液化制备生物油

为探索新型生物质燃油的开发,该文以小球藻粉为原料,采用水热催化液化方法制备生物油。研究了液化温度,液化时间,催化剂等因素对液化率的影响,在此基础上采用正交试验,以液化率为指标,探讨了生物油优化的制备工艺;利用傅里叶红外光谱(FTIR)和气相色谱-质谱联用(GC/MS)技术分析了小球藻粉生物油的基团结构与组成。结果表明,小球藻粉优化的液化反应条件为:采用质量分数5%的Ce/HZSM-5为催化剂,在300°C水热条件下催化液化20min,小球藻粉和溶剂料液比为1:10g/mL,液化率达39.87%。在此条件下制备的小球藻粉生物油的主要成分为醇类,酯类以及部分碳氢化合物,热值达26.09MJ/kg。和传统木质纤维素类生物质相比,小球藻粉制备的生物油成分更接近传统化石燃油且热值更高,显示了良好的应用前景,为微藻生物质液体燃料的制备提供参考。     

不同壳聚糖改性黏土对小球藻的絮凝效应及絮凝条件优选

微藻个体微小,不易采收,为其开发利用带来了很大困难。利用酸性壳聚糖对3种不同类型的黏土矿物(膨润土、硅藻土、沸石)进行改性,制备无公害复合絮凝剂,探究其对小球藻(C.pyrenoidosa)的絮凝效果,并考察了复合絮凝剂的浓度、静置时间、藻液p H值和壳聚糖与黏土矿物的比例对絮凝率的影响。结果表明:复合絮凝剂的絮凝效果明显高于壳聚糖。其中壳聚糖改性硅藻土对小球藻的絮凝效果最佳,其最佳絮凝条件为p H值为8,壳聚糖和硅藻土的配比为1∶6,浓度为0.2 g/L,沉降120 min。在该条件下,小球藻的絮凝采收率可达到约96.16%。复合絮凝剂无毒环保,不会造成二次污染影响微藻生物质后续加工利用,是一种环境友好,安全健康的微藻絮凝剂,具有良好的应用前景。     

壬基酚对中华大蟾蜍蝌蚪的毒性效应

为评价水体中低浓度壬基酚（NP）对中华大蟾蜍（Bufo bufogargarizans）蝌蚪的毒性效应,采用室内饲养、测定方法,研究了NP在不同暴露时间（8、16、24、32d）,不同浓度（0.002、0.005、0.010mg·L-1）条件下,对蝌蚪生长发育、过氧化氢酶（CAT）活性、丙二醛（MDA）含量和DNA损伤的影响。结果表明：暴露于0.010mg·L-1NP的蝌蚪,其生长发育被极显著抑制（P〈0.01）;CAT活性在两个较低浓度组（0.002、0.005mg·L-1）表现为先诱导后恢复,在0.010mg·L-1浓度组表现为诱导-恢复-诱导（P〈0.05）;MDA含量在两个较低浓度组（0.002、0.005mg·L-1）持续升高（P〈0.05）,呈明显的时间-效应关系;各处理组DNA损伤水平均显著高于对照组（P〈0.05）,但随暴露时间的延长而有所下降,具有一定的剂量-效应关系。总之,即使水体中的NP符合灌溉标准,也可能抑制蝌蚪的生长发育,并对其造成氧化损伤和遗传损伤。     

Effects of Sewage-Sludge Application on Soils and Sunflower Yield: Quality and Toxic Element Accumulation

Sunflower nutrition, sewage-sludge nutrients, and trace-metals supply have been studied in detail, but separately. The objective of the present work was to study the effects of sewage sludge on sunflower yields and the accumulation of nutrients and trace metals in soils and in the crop. Three experiments with sunflower were therefore conducted on farms located in Buenos Aires Province, Argentina. The treatments were control, 7 t dry matter (DM) sewage sludge/ha, and 14 t DM sewage sludge/ha. Soils were Typic Argiudolls and a Typic Hapludoll. At physiological maturity, grains and aerial biomass were harvested. Nitrogen (N), phosphorus (P), and potassium (K) were determined and, after digestion with acids, cadmium (Cd), chromium (Cr), copper (Cu), lead (Pb), nickel (Ni), and zinc (Zn) were analyzed with inductively coupled argon plasma emission spectrometry (ICPES). Soil samples were taken and analyzed for nutrients and Cd, Cr, Cu, Ni, Pb, and Zn. Only available P and nitrate-N increased in the soil after the application of sewage sludge. Sunflower yields increased by increasing grains per head. Individual grain weight, oil content, nutrients, and trace-metals concentrations were not affected, nor were the aerial biomass and its composition. Using sewage sludge according to standard regulations does not affect either toxic-metals uptake or sunflower quality.     

低温对高浓度人尿液废水培养小球藻的影响

针对寒区气温低,微藻培养过程加热能耗大的问题,以蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosa和普通小球藻 Chlorella sp为试验藻种,利用人工气候培养箱,在人尿液废水添加比例40%条件下,研究2种小球藻在15.0、17.5、20.0、22.5、25.0 ℃较低温度下的生长特性和小球藻蛋白质含量,以及培养液中营养物质的利用情况。结果表明,2种小球藻均可以在高浓度尿液废水中生长,蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosa对各试验组培养液中总氮、氨氮、总磷和化学需氧量（Chemical Oxygen Demand, COD）的平均去除率分别达到78.02%、79.59%、79.31%、20.11%,最大生物量达到0.502 g/L;普通小球藻 Chlorella sp对培养液中总氮、氨氮、总磷和COD的去除效果更好,平均去除率分别达到87.90%、89.55%、89.29%、68.66%,最大生物量达到1.007 g/L。2种小球藻对低温的响应均呈现随温度的升高生物量和培养液中相关指标的去除率也随之增大的趋势,但不同温度区段的变化率存在差异,温度为20.0 ℃及以上时变化较小,温度低于20.0 ℃时变化较大。并且在微藻培养各指标中,微藻的生物量和蛋白含量,以及培养液中的COD含量变化较大,而培养液中的总氮、氨氮、总磷的变化规律差别较小。普通小球藻Chlorella sp对低温的耐受特性明显优于蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosa,普通小球藻 Chlorella sp更适合在低温条件下用于高浓度尿液废水的处理和资源化。该研究为寒区微藻的低耗高效培养和尿液废水的资源化利用提供理论支持。     

Effect of gallium on photosynthetic pigments and peroxidase activity of Chlorella pyrenoidosa

Green algae (Chorella pyrenoidosa) were grown in iron‐deficient and normal iron supplied nutrient solution and treated with 1 uM gallium. Treatment with gallium enhanced the growth rate and chlorophyll content of algae cultures. Significant changes were recorded in individual photosynthetic pigment composition of treated cultures. In both iron‐deficient and normal iron supplied cultures, gallium treatment enhanced peroxidase enzyme activity. Partially purified peroxidase showed different kinetic properties in the samples treated with gallium. An iron‐gallium interaction is proposed that affects chlorophyll metabolism and peroxidase activity in green algae.     

酸雨与镉对大豆幼苗光合作用复合影响的模拟试验

采用生化分析方法、叶绿素荧光测定系统及透射电镜技术,测定不同强度酸雨与镉胁迫对大豆幼苗叶绿素含量、Hill反应速率、Mg2＋-ATPase活性、荧光参数及叶绿体结构的复合影响。结果表明,与对照相比,单一酸雨和镉作用下,各指标随胁迫强度变化趋势为叶绿素含量（Hill反应速率和Mg^2＋-ATPase活性）降低,初始荧光＂先降后增＂,最大光化学效率和最大量子产量＂先增后降＂。酸雨与镉复合作用下,叶绿素含量的变化表现为上述单一作用的相加效应,Hill反应速率、Mg^2＋-ATPase活性变化为单一作用的协同效应,荧光参数对酸雨与低（高）含量镉复合作用的响应表现为单一作用的拮抗效应（协同效应）。酸雨与镉复合作用下,叶绿体超微结构受到损伤。结合各指标变化进一步得出,叶绿体结构损伤是酸雨和镉对大豆幼苗叶绿素含量及光合光反应,乃至光合作用受抑的内在原因之一。     

夹竹桃（Nerium indicum）皂甙对鲫鱼（Carassius auratus）幼鱼的影响

为了评价夹竹桃皂甙对非靶标生物的潜在危害,采用半静态法研究了不同浓度（0、5.89、20.12mg·L-1和80.76mg·L-1）的夹竹桃皂甙对鲫鱼幼苗的死亡情况、特定生长率、糖原、蛋白质含量、SOD酶活性和微核率的影响。结果表明,当夹竹桃皂甙处理浓度≤20.12mg·L-1时,处理组的鲫鱼在试验期间无死亡;而在80.76mg·L-1皂甙的处理下,鲫鱼5d后全部死亡。当皂甙染毒浓度达20.12mg·L-1时,随处理时间的增加,特定生长率、糖原和蛋白质含量逐渐下降,而SOD活性先上升后下降;在清水中恢复饲养7d后,鲫鱼幼苗特定生长率和SOD活性受到的抑制作用逐渐减弱,糖原和蛋白含量恢复至与对照组相比无显著差异。此外,微核试验表明夹竹桃皂甙对鲫鱼幼苗的微核率无影响。研究结果表明,夹竹桃皂甙对鲫鱼的毒性属低等毒性且未发现遗传毒性,但高浓度的皂甙能影响鲫鱼幼鱼的正常生理代谢,导致生长受到抑制,严重时可致其死亡。