三种哺乳动物朊蛋白基因的克隆与分析

以外周血液的总DNA为模板，运用PCR方法克隆了汉族人、秦川黄牛和甘肃土种绵羊的Prnp基因，运用分子生物学软件对这些序列进行了分析比较。结果表明，获得的3种哺乳动物的Prnp基因均位于1个单一的外显子内，与GenBank中登录的相应序列具有高度同源性，达99．0％。牛与绵羊Prnp基因同源性为97．3％，推导氨基酸序列同源性为96．5％。人Prnp基因与黄牛和绵羊Prnp基因的同源性分别为86．7％和87．1％，其氨基酸序列的同源性均为90．0％。3种Prnp基因均有富含G—C的重复区，编码的PrP蛋白均由氨基端的信号肽、中间的成熟蛋白和羧基端的GPI锚结合位点组成。基因型分析表明，秦川黄牛和甘肃土种绵羊可能存在感染海绵状脑病的风险。     

东北虎朊病毒基因的克隆与序列分析

根据已报道的哺乳动物朊病毒基因序列设计引物，采用PCR方法扩增了25只东北虎的朊病毒基因，克隆、测序及序列分析表明，所得到的东北虎朊病毒基因片段为402bp，编码134个氨基酸的前体蛋白，核苷酸序列同源性为99．67％。共发现了4个核苷酸多态性（T423C，A501G，C511A，A610G），其中C511A和A610G的碱基突变导致K171Q和A204T氨基酸的变异。与已报道的猫、貂、绵羊、鼠和犬等哺乳动物的氨基酸序列比较，结果与猫（AF003087，97．3％）和绵羊（97．3％）的氨基酸同源性最高。     

籽鹅促卵泡激素α亚基基因的克隆、序列分析及其原核表达载体的构建

以雌性籽鹅脑垂体的总RNA为模板,利用特异性引物通过RT-PCR扩增获得长为363 bp的籽鹅促卵泡激素α亚基的cDNA片段,将扩增的促卵泡激素α亚基基因片段克隆至pMD18-T载体后进行测序。将测序结果与鸡、鹌鹑、火鸡、鼠、羊、牛等多种禽类和哺乳动物的该基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行同源性分析。结果表明,这些物种促卵泡激素α亚基基因序列具有较高的保守性,其中与鸡、鹌鹑、火鸡的核苷酸同源性最高,均为95.9%,推导的氨基酸序列与鸡、鹌鹑、火鸡的同源性最高,均为97.5%。为了对克隆的籽鹅促卵泡激素α亚基基因功能研究提供基础,将籽鹅促卵泡激素α亚基基因克隆至pET-32a(+)原核表达载体。     

鸭IgG的研究进展及Fc段的遗传进化分析

IgG(IgY)是鸭卵黄中的唯一免疫球蛋白。根据GenBank发表的鸭的IgG Fc段的核苷酸序列、氨基酸序列,和多种动物进行遗传进化分析。得出鸭与鸡的核苷酸同源性分别为67.9%,与其他所列哺乳动物的核苷酸同源性集中在40%～52%之间。鸭与鸡的氨基酸同源性57.5%,与其他所列哺乳动物的氨基酸同源性集中在34%～43%之间。进化树结果显示鸭的IgG Fc段基因与鸡此段基因具有较近的亲缘关系。     

鸡α干扰素基因的克隆和鉴定

采用反转录-聚合酶链反应技术，从传染性囊病病毒感染的鸡胚成纤维细胞中扩增出石岐杂鸡的α干扰素（spzChIFN-α)基因，将包括sqzChIFN-α编码区的cDNA片断克隆到pBssK载体中，并对该片断进行序列测定，核苷酸序列测定结果表明克隆的ChIFN-α基因cDNA片段长度为724bp，和其他ChIFN-α基因的同源性在9左.1%以上，与其它α食干扰素基因的同源性在67.4%以上，其中与鸭α干扰素基因的同源性为67.4%，与火鸡α干扰素基因的同源性为89.8%，推导的石岐杂鸡α干扰素氨基酸序列与其它禽类的α干扰素的同源性在49.2%以上，其中与白来航鸡α干扰素的同源性为96.9%-99%，与鸭和火鸡α干扰素同源性分别为49.2%和80.7%。     

非洲狮朊蛋白基因的克隆与序列分析

根据已报道的哺乳动物朊蛋白基因序列设计了1对引物，采用PCR方法扩增了16只非洲狮的朊蛋白基因，序列分析结果表明，所得到的非洲狮朊蛋白基因片段长678bp、编码226个氨基酸的前体蛋白，其核苷酸序列的同源性为99．79％以上，发现了4个核苷酸多态性位点，无氨基酸变异。经与已报道的猫、貂、绵羊、牛、鼠和犬等哺乳动物的氨基酸序列进行比较，与猫（AF003087，96．7％）和绵羊（96．2％）的氨基酸同源性最高。     

鸡IL-2受体α亚基成熟蛋白基因的克隆及其胞外段的原核表达

以鸡脾淋巴细胞总RNA为模板，采用RT—PCR方法克隆了鸡白细胞介素-2受体α亚基（ChIL-2Rα）编码区基因。将ChIL-2Rα胞外段基因克隆到pET-32a（＋）中，获得重组质粒pET32a—exChIL-2Rα，转化宿主菌E．coli Rosseta^TM（DE3）后，经IPTG诱导表达的融合蛋白大小约为34ku。序列分析发现，鸡IL-2Rα编码区基因与GenBank上已登录序列的核苷酸同源性为99．2％，氨基酸同源性为99．5％。ChIL-2Rα与其他哺乳动物IL-2Rα在核苷酸和氨基酸水平上的同源性分别为29．6％～54．5％和18．8％～28．0％。表明，禽类IL-2Rα与哺乳类的差异较大。     

北京鸭Ⅱ型干扰素基因分子克隆与序列分析

应用反转录－聚合酶链反应（RT－PCR）技术，从伴刀豆球蛋白A（ConA)刺激培养的北京鸭脾淋巴细胞提取的总RNA中扩增得到北京鸭Ⅱ型干扰素（IFN－γ）基因（DuIFN-γ2）。序列分析表明，DuIFN-γ2基因长度与报道的鸭IFN－γ基因（AF087134）长度一致，为497个核苷酸，共编码145个氨基酸的成熟蛋白，推测其分子量约17ku。两者核苷酸水平的同源性为99．6％，有2个位置发生非同义变异，其氨基酸序列的同源性为98．6％；与其他禽类同源性为67．0％－68．0％，与人的同源性为34．4％。     

鸭Ⅰ型禽副粘病毒YH99V株HN基因的克隆和序列分析

在浙江地区进行鸭病病因的调查过程中，从患病鸭群中分离到一株引起鸭产蛋锐减而不死亡的病毒，经鉴定该病毒属于禽副粘病毒Ⅰ型，命名为YH99V株。以YH99V株的基因组RNA为模板，通过RT—PCR一步法扩增出其HN基因的cDNA片段，然后将其克隆至pMD18-T载体中，对其进行序列测定。测序后拼接出HN基因的序列长度为1785bp，该基因的ORF总长为1734bp，编码577个氨基酸。将YH99V株HN基因序列和推导的氨基酸序列与新城疫毒株的HN基因相应序列比较后发现，它们的核苷酸序列同源性分别在82．1％～99．7％，氨基酸序列同源性为87．2％～99．5％。在同源性比较的基础上，进一步绘制了Ⅰ型禽副粘病毒株HN基因的系统发育树。这对于Ⅰ型禽副粘病毒毒力基因的功能分析和该病的分子流行病调查有着重要的意义。     

家禽细菌性疾病的防控思考

我国是禽业养殖大国。家禽养殖业是我国畜牧业的支柱产业。家禽种类多，包括鸡、鸭、鹅、火鸡、鹌鹑、鸽以及多种特种禽类等。鸡存栏量占世界总量26％，水禽占69％。     

猪瘟病毒云南毒株E2基因片段序列测定及分析

用RT－nPCR方法，选择猪瘟病毒2000年云南部分地方流行毒株E2基因主要保护性抗原决定簇编码区片段进行扩增和cDNA序列分析，并与中国标准强毒石门株进行比较。结果显示，云南地方毒株之间核苷酸及氨基酸序列同源性均大于90％；但与中国标准强毒石门株差异较大，其核苷酸及氨基酸同源性均小于80％。     

济宁青山羊BMP15基因外显子2的克隆与序列分析

本研究对高繁殖力的山羊品种济宁青山羊和低繁殖力的山羊品种内蒙古绒山羊共20只母羊的骨形态发生蛋白15（bone morphogenetic protein 15, BMP15）基因第2外显子的扩增产物进行了克隆测序及序列比较分析。结果表明：BMP15基因第2外显子的第3对引物扩增片段存在多态。济宁青山羊与内蒙古绒山羊相比，其BMP15基因外显子2差异由2个核苷酸和2个氨基酸改变组成，核苷酸同源性为99%。济宁青山羊与鸡、小鼠、人、猪、牛、绵羊之间BMP15基因外显子2的核苷酸序列同源性为71%～99%，氨基酸序列同源性为43%～99%。     

禽流感病毒H9N2亚型分离株HA基因的克隆及序列分析

以禽流感病毒地方株A/chicken/Mudanjiang/ 0 82 3/ 2 0 0 0 (H9N2 )的总RNA为模板 ,用通用反转录引物和自行设计的一对特异性引物 ,采用RT PCR方法扩增了HA基因。测序及序列分析结果表明 :HA基因全长 1 70 7bp ,编码 560个氨基酸残基 ,与GenBank收录的H9N2亚型的核苷酸同源性最高达 99% ,最低为 87 2 3 % ;氨基酸同源性最大达 98 0 4 % ,最低为 88 57%。经HA裂解位点附近的氨基酸序列分析表明 ,CMJ/ 0 0毒株为低致病力毒株     

Cloning and Sequence Analysis of MHC Ⅰ β2m Gene in Chicken

In order to further understand molecular characteristics and immune mechanisms of chicken major histocompatibility complex class Ⅰ(MHCⅠ) β2m gene,the 15 sequence of chicken MHC β2m gene from three local breeds was cloned by RT-PCR. We compared these sequences with seven MHCⅠβ2m genes of human,mouse and other animals in the GenBank database. The results showed that the amino acid homology among chicken MHCⅠβ2m ranged from 98.0% to 100%,the most sequences were identical. Chicken MHCⅠβ2m shared a 60.6% amino acid homology with duck,the highest degree of homology indicated a close genetic relationship,and the grasscarp had the lowest homology,33.3%. It could be further confirmed by phylogenetic analysis. Moreover,alignment of 10 β2m sequences of mature protein,two cysteines were located in sites 24 and 79,and there was the "YXCXVXH" Ig-motif character between the sites 77 and 83 of chicken β2m. The results showed that MHCⅠβ2m of chicken and other species had the same basic unit of immune function,and they had the unique structural features.     

鸡黄病毒CJD05株E基因克隆与序列分析

为了解福建省鸡黄病毒(CFV) CJD05株来源及其遗传进化关系,根据鸭黄病毒(DFV) BYD-1株E基因全序列设计合成1对引物,特异性扩增CFV CJD05株的E基因,并对其序列进行分析.结果表明克隆获得CFV CJD05株1 503 bp的E基因特异性目的条带,同源性分析表明CFV CJD05株E基因核苷酸序列与DFVBYD-1株、鹅黄病毒(GFV) JS804株的同源性分别为99.2％、99.3％,氨基酸的同源性分别为99.0％、98.6％,表明CFV CJD05株、DFV BYD-1株和GFV JS804株高度同源,与坦布苏病毒(TBSV)的同源性高于其它虫媒介黄病毒.     

云南江城蓝舌病病毒16型毒株分离鉴定及其L2基因序列分析

为了解近年来云南江城县蓝舌病病毒16型（Bluetongue virus type 16,BTV-16）毒株的流行情况及其L2基因与国外流行株的遗传进化关系,本研究将江城县送检的300份牛肝素钠抗凝血提取红细胞后静脉接种10日龄鸡胚,将收集的鸡胚肝脏捣碎离心,上清液接种于C6/36和BHK21细胞传代。针对出现细胞病变的样品,应用群特异性VP7片段引物进行RT-PCR检测,应用BTV-16 L2基因特异性引物对检测出的BTV核酸阳性样品进行RT-PCR扩增和测序,采用DNAStar和Mega 6.0软件对获得的L2基因编码区序列进行核苷酸、氨基酸同源性比对及遗传进化分析,同时利用BTV-16标准阳性血清对分离到的病毒进行中和试验鉴定。结果显示,江城县发现30个可致细胞病变的样品,其中17个样品经RT-PCR初步确认为BTV;经L2基因序列分析和中和试验鉴定,确定其中6株为BTV-16型毒株;核苷酸、氨基酸同源性比对分析结果显示,6个毒株核苷酸和氨基酸同源性分别在93.4%~98.0%和94.2%~99.1%之间;遗传进化分析发现,其中5株与2001-2008年日本及1982-2011年印度分离的BTV-16毒株亲缘关系较近;1株与1985-1990年日本分离的BTV-16毒株亲缘关系较近。本研究发现,云南江城县BTV-16毒株呈现新旧毒株交叉持续流行态势,但在自然进化中遗传变异不大,有一定的稳定性,本研究在分子水平阐明了云南江城县地方流行BTV-16 L2基因间的遗传和差异,为进一步开展BTV分子流行病学及检测研究提供科学依据。     

麻鸡副黏病毒ZH-1株F基因核酸疫苗的构建及其免疫效果

应用RT-PCR方法从麻鸡副黏病毒ZH-1株中扩增F基因并克隆入pGEM○R-T载体,经序列测定、分析,结果显示ZH-1株F基因与NDV国家标准强毒F48E9株的核苷酸、氨基酸序列同源性均达到99%。随后将F基因克隆入真核表达载体pCI-neo,构建真核表达质粒pCI-F,pCI-F体外转染Vero细胞,能在Vero细胞中表达,利用pCI-F质粒进行动物试验,结果表明雏鸡免疫14 d后在体内可检测到特异性抗体,pCI-F质粒二次免疫雏鸡后,对NDV强毒的攻毒保护率为73%,这一结果提示利用F基因构建的核酸疫苗具有重要的开发前景。     

鹅黑素皮质素受体-4基因的克隆与序列分析

黑素皮质素受体-4（Melanocortin receptor-4,MC4R）是其黑素皮质素受体MCR（MC1-5R）家族成员之一,属G蛋白偶联受体。它可与瘦蛋白、神经肽、α-黑素细胞刺激素等一起调节动物体重和采食量。参考鸡MC4R基因序列设计引物,克隆并测序了鹅MC4R基因。结果表明,鹅MC4R基因编码区全长996 bp,其核苷酸序列与鸡的同源性为95.3%,与人、牛、猪等哺乳动物同源性在75%-79%;其氨基酸序列与鸡的同源性达到98.5%。构建哺乳类、鸟类和鱼类MC4R基因核苷酸进化树显示,鹅较早地与哺乳类动物分化开来。分析MC4R蛋白的氨基酸残基特性参数表明,MC4R的7次跨膜结构与MC4R的亲水性区域、电荷密度以及氨基酸残基位于表面概率的变化规律相一致。     

H9亚型禽流感病毒钦州株HA基因的克隆与遗传进化

采集钦州活禽交易市场的鸡气管和泄殖腔的棉拭予样品,用H9亚型分型引物进行PCR初步筛选,阳性样品经SPF鸡胚尿囊腔接种分离病毒,通过RT-PCR方法扩增HA基因,并将其克隆到pMD—18T载体后进行序列测定和分析。结果表明,获得1株H9亚型禽流感病毒命名为：A／Chicken／Guangxi／qz40／2009（简称qz40）。测序结果表明qz40的HA基因片段全长1683bp,编码560个氨基酸;序列同源性比较结果表明,该毒株与参考毒株的核苷酸序列同源性为82．8％．99．9％,推导氨基酸同源性为87．5％．99．6％;HA基因的裂解位点氨基酸顺序为RSSRIGLF,为低致病性毒株;含有7个潜在的N-糖基化位点,其中5个位于HAl部分、2个位于HA2部分;基于H9亚型HA基因的进化树分析表明,qz40株属于欧亚种系的A／Chicken／Beijing／1／94（Ck／Bei—like）群系。     

伪狂犬病病毒BJ/YT株毒力相关基因gE和TK序列分析

本试验对2012年从北京地区约克夏犬体内分离得到的伪狂犬病病毒(PRV)BJ/YT株主要毒力基因gE和TK的分子特征和进化关系进行了分析。结果显示,BJ/YT株gE基因与参考序列的核苷酸和氨基酸同源性分别为98.9%～100.0%和98.3%～100.0%;TK基因核苷酸和氨基酸同源性分别为99.2%～99.9%和99.0%～100.0%。BJ/YT株与同期河北猪源分离株进化关系较近,各毒株之间同源性高,并且存在一致的核苷酸突变位点;与其他参考序列比对分析结果显示,BJ/YT株主要毒力基因存在变异位点,但这些位点均不在已知的主要功能区和抗原表位区内。因此,从分子流行病学角度来看,BJ/YT毒株是近年北京及其周边地区PRV流行毒株,但gE和TK基因的变异对流行毒株的毒力无明显影响。