Nonapeptide突变体制备及抗新城疫病毒活性研究

以生物工程技术表达及120 g/L SDS-PAGE电泳纯化Nonapeptide突变体,取制备的Non-apeptide突变体进行抗新城疫病毒(NDV)的鸡胚试验、鸡体内抗NDV试验。结果表明,当Nonapeptide突变体基因产物浓度达4μg/mL～6μg/mL,对鸡胚保护率均达到100%,感染鸡胚全部存活;Nonapeptide突变体基因产物浓度大于4μg/mL,对NDV有很好的抑制作用,鸡用药后3 d体内检测不到NDV,低剂量组(2μg/mL)也有较好的抑制NDV作用,鸡用药后5 d体内检测不到NDV。Nonapeptide突变体基因产物具有NDV多克隆抗体相似活性,能够抑制鸡胚中和组织培养中NDV的繁殖,具有中和、抑制NDV吸附作用。     

牛α干扰素在新城疫病毒La Sota疫苗株中的高效稳定表达及抗病毒活性检测

研究在已有的新城疫病毒La Sota株反向遗传系统的基础上,利用新城疫病毒La Sota株作为表达载体,构建表达牛α干扰素(bovine interferon α)完整开放阅读框的全基因组质粒pFL-BoIFN α,转染BHK-21细胞获得表达牛α干扰素重组新城疫病毒.采用RT-PCR方法检测,证实收获的鸡胚尿囊液内的重组病毒含有相应外源基因.将重组病毒尿囊液经紫外线照射灭活新城疫病毒,利用表达绿色荧光蛋白的重组水泡性口炎病毒(VSV-EGFP)在牛肾细胞(MDBK)上测定rL-BoIFN α抗病毒活性,证实表达牛干扰素的重组新城疫病毒尿囊液能有效抑制VSV-EGFP在牛肾细胞上的复制,rL-BoIFNα接种SPF鸡胚所收尿囊液抗病毒活性高达2× 107 IU/mL.结果表明: 牛α干扰素在重组新城疫病毒rL-BoIFNα接种的SPF鸡胚尿囊液中获得良好表达,并具有高效而稳定的抗病毒活性.     

牛β-干扰素在新城疫病毒La Sota疫苗株中的高效稳定表达及抗病毒活性检测

研究利用新城疫病毒La Sota株作为表达载体,构建表达牛β-干扰素基因的重组新城疫病毒全基因组质粒pFL-BoIFN-β, 与辅助质粒共转染BHK-21细胞后获得表达BoIFN-β的重组新城疫病毒.收获的鸡胚尿囊液内的重组病毒经RT-PCR检验证实重组病毒含有相应外源基因.将重组病毒尿囊液经紫外线照射以灭活新城疫病毒,利用表达绿色荧光蛋白的重组水泡性口炎病毒在牛肾细胞上测定rL-BoIFNβ抗病毒活性, 表达BoIFN-β的重组新城疫病毒能有效抑制重组水泡性口炎病毒在牛肾细胞上的复制, rL-BoIFNβ接种SPF鸡胚所收尿囊液抗病毒活性高达2×107 IU/mL.结果表明:重组新城疫病毒rL-BoIFNβ接种的SPF鸡胚尿囊液具有高效而稳定的抗病毒活性,重组新城疫病毒可以作为外源蛋白的高效表达载体而广泛应用.     

IFN-α对山羊副流感病毒3型的抗病毒活性

旨在探讨原核表达纯化的山羊α干扰素(IFN-α)对山羊副流感病毒3型(CPIV3)的抗病毒活性。通过分析山羊IFN-α的序列特点,比对不同种属IFN-α的同源性,进而构建山羊IFN-α成熟蛋白编码基因(去除信号肽基因序列)的原核表达载体pET-30a-gIFN-α,将其转化至感受态细胞Rosetta (DE3),IPTG诱导后镍柱及亲和纯化获得山羊IFN-α。利用RT-qPCR测定山羊IFN-α作用于牛肾细胞(Madin-Darby bovine kidney cell, MDBK cell)后6种干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes, ISGs)的相对表达水平;同时,利用TCID₅₀及Western blot测定其对CPIV3的抗病毒活性。结果表明,原核表达的山羊IFN-α蛋白含量为0.20 mg·mL^-1,Western blot结果表明表达产物相对分子质量约为20 ku,与预期结果相符。RT-qPCR结果显示,山羊IFN-α孵育MDBK细胞后,可显著刺激RSAD2、STAT1及ISG15等6种ISGs基...     

生物表面活性素体外抗病毒活性

测定了表面活性素(Surfactin)的体外抗新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)LaSota株、伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)作用,并对其可能的机理进行了初步的探讨.结果表明,生物表面活性素对鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblasts,CEF)的TD50和TD0分别为62.5、16.125 mg/L;对猪肾(Porcine kidney,PK-15)细胞的TD50和TD0分别为31.25、4.03 mg/L;对NDV LaSota株、PRV株所致细胞病变效应有明显的抑制作用,可使细胞存活率显著升高;表面活性素可以直接作用于NDV LaSota株、PRV株,具有一定的抗病毒作用;同时还具有一定的预防NDV LaSota株感染及抑制其复制的作用.但对PRV病毒作用不显著.其抗病毒效果和相应的阳性对照抗病毒药物病毒唑(Ribavirin),无环鸟苷(Acyclovir,ACV)相当,并且由于其细胞毒性较弱,可作为一种抗病毒药物进行开发研究.     

牦牛IFN-α基因的克隆表达及抗病毒活性研究

从我国地方品种环湖型牦牛和野牦牛基因组DNA中克隆了α干扰素(BoIFN-α)基因,PCR产物酶切后与载体pQE30连接,构建重组质粒pQE30/BoIFN-α,将其转化JM109E.coli并用IPTG进行诱导表达。序列分析表明,环湖型牦牛和野牦牛IFN-α成熟肽基因全长均为498个核苷酸,编码166个氨基酸,其中环湖型牦牛IFN-α与已报道的8个BoIFN-α亚型氨基酸的一致性为92.8%~95.2%,野牦牛为88.6%~92.8%,均为BoIFN-α新亚型。SDS-PAGE和Westernblot结果表明,重组蛋白约为20kD,以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的25%。经包涵体提取、尿素变性和复性后,重组牛IFN-α粗提物在MDBK/VSV和CEF/VSV细胞系上的抗病毒活性分别为1.6~1.8×106U/mg和2.3×105U/mg,而且对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)也有一定的抑制作用。     

猪Mx1基因的克隆表达及抗病毒活性研究

本文应用(RT-PCR)技术,从猪瘟弱毒疫苗和Poly:IC共刺激7 h的PK15细胞的cDNA中扩增出编码Mx1蛋白的全长基因,并通过引物设计填补了PK(15)细胞系Mx1 cDNA序列中3’端11bp的缺失,成功获得Mx1完整基因的克隆。构建了重组表达质粒pRetroQ-sMx1,转染HEK293T细胞并表达Mx1蛋白,利用微量细胞病变抑制法测定其抗病毒活性。双酶切鉴定和核酸序列测定证实pRetroQ-sMx1真核表达质粒构建成功,转染HEK 293T细胞后,能够检测到绿色荧光,Western blot证实为目的蛋白。微量细胞病变抑制法测定重组蛋白具有一定的抗水疱性口炎病毒及猪繁殖与呼吸综合征病毒的活性。重组Mx1具有一定抗病毒生物功能,为进一步研究重组Mx1蛋白的活性以及Mx1抗病毒药物奠定了基础。     

鸡抗病毒Mx基因的克隆与序列分析

用干扰素诱导剂poly（I）／（C）诱导鸡胚成纤维细胞,提取细胞总RNA,采用RT—PCR方法扩增了北京白鸡Mx基因全长编码区序列。序列分析表明：该基因编码区长2118bp,编码705个氨基酸残基,其第631位为天冬酰胺,理论上推测具有抗病毒活性。通过与GenBank中已登录的7个品系鸡Mx基因进行核苷酸系统进化树分析,结果显示,北京白鸡Mx基因与WL—N品系鸡Mx基因的亲缘关系最近。北京白鸡Mx基因序列与其他动物Mx基因序列的比较结果显示,核苷酸同源性为49．5％～76．8％,氨基酸同源性为44．1％～61．6％。据此可以推断：克隆的Mx基因具有抗病毒活性的分子特征和特征性功能结构,不同种属动物Mx基因的同源性与其亲缘关系呈正相关。     

神经氨酸酶基因联合抗黏液病毒基因的抗病毒作用

拟构建神经氨酸酶(NA)基因和抗黏液病毒(Mx)基因双基因真核共表达载体,并检测基因表达以及转染鸡成纤维(CEF)细胞后的抗病毒效果。克隆了NA基因和突变型Mx基因的cDNA;分别定向插入真核细胞双顺反子载体pVITRO2中,酶切和测序鉴定双基因共表达载体pVITRO2-Mx-NA的正确性。用pVITRO2-Mx-NA转染NIH-3T3细胞,通过RT-PCR和间接免疫荧光(IFA)方法检测目的基因的表达。随后用pVITRO2-Mx-NA转染CEF细胞,利用RT-PCR及微量细胞病变抑制法测定重组蛋白抗新城疫病毒(NDV)的效果。结果:酶切和测序分析表明成功构建了双基因真核共表达载体pVITRO2-Mx-NA,在转染后的NIH-3T3和CEF细胞中同时检测到了NA和Mx基因的表达。联合基因表达的重组蛋白可保护CEF细胞在孵育的72h内免受NDV的感染,而转染了突变型Mx或者NA单基因真核表达载体的CEF细胞在孵育的48h内亦未受到NDV的侵染;与单基因转染组相比,联合基因转染组明显延迟NDV感染CEF细胞的时间,差异显著(P<0.05)。构建的双基因真核表达载体pVITRO2-Mx-NA转染CEF细胞后,其表达的重组蛋白Mx-NA在细胞水平上具有协同延缓NDV感染的能力,且优于单个基因。     

鸡Mx基因的原核表达及表达蛋白抗病毒活性初步研究

将鸡Mx基因克隆入pET一32a载体,筛选鉴定后将重组阳性质粒转化到大肠埃希菌株BL21进行诱导表达,表达产物用west,ern blot鉴定,并经镍亲和层析法纯化及透析复性,得到的蛋白用微量细胞病变抑制法检测其抗病毒活性.结果显示,构建的载体经PCR扩增得到长度为2 118 bp的特异片段,测序结果证实与鸡Mx基因同...     

禽流感病毒分离鉴定及其NA基因克隆分析

将疑似禽流感病死鸡病料组织研磨液接种SPF鸡胚分离病毒,尿囊分离毒经电镜观察后,应用特异性RT-PCR方法和血凝及血凝抑制试验进行分型检测,同时对核蛋白全长基因进行扩增测序分析。通过血凝及血凝抑制试验初步证实分离的禽流感病毒为H5亚型,然后对分离株HA基因和NA基因进行RT-PCR分析,确定该分离株禽流感病毒为H5N1亚型。通过NA全基因扩增测序、Blast分析显示该分离株NA基因序列与已发表的毒株基因序列(EU429747)同源性为97%,但基因3′端发生明显变异。     

禽流感病毒NS1蛋白亚细胞定位研究

为深入研究NS1蛋白的生物学功能,了解NS1蛋白在哺乳动物细胞中的分布和亚细胞定位情况.采用RT-PCR扩增出禽流感病毒NS1基因片段,克隆至载体pEGFP-N1,经酶切和测序鉴定后,将构建的重组质粒pEGFP-N1-NS1经脂质体介导转染293T细胞和Hela细胞,在荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜下观察NS1在细胞...     

猪流感病毒聚合酶PB1蛋白亚细胞定位的研究

猪流感病毒PB1蛋白在其复制中起着转录作用,是病毒复制所必需的蛋白。克隆了猪流感病毒的PB1基因,构建重组真核表达载体p3xFLAG-CMV-7.1-PB1,利用脂质体转染Vero细胞后,分别用Western blot和IFA检测重组蛋白FLAG-PB1蛋白的表达,结果表明重组蛋白能在真核细胞中得到表达,其亚细胞定位为细胞核表达,与其功能密切相关,为以后流感病毒的相关研究打下了基础。     

表达H5N1亚型禽流感HA-NA基因重组火鸡疱疹病毒的构建

将禽流感病毒H5N1亚型具有免疫原性的血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因,克隆于表达质粒Tmd-CMV-IRES-EGFP中,使其位于含细胞巨化病毒(CMV)早期启动子的调控下,并与增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)串联,将上述串联基因插入到火鸡疱疹病毒(HVT)基因的非必需区(US10)中,从而构建了带标记的重组转移质粒。将该转移载体质粒感染HVT的鸡胚成纤维细胞(CEF),利用脂质体共同转染CEF,待病毒蚀斑出现后,利用蚀斑筛选带有绿色荧光的重组病毒蚀斑,数轮蚀斑纯化,经荧光和PCR初步鉴定获得了重组火鸡疱疹病毒。     

犬瘟热病毒V蛋白的表达、鉴定及亚细胞定位

为研究犬瘟热病毒（canine distemper virus,CDV） V蛋白的功能,将CDV V基因片段与pGEX-6P-1载体连接,构建pGEX-6P-1-CDV-V重组表达质粒,通过原核表达系统表达了V蛋白,并将纯化的V蛋白免疫BALB/c小鼠,制备阳性血清。同时,将CDV V基因片段与pcDNA3.1载体连接,构建pcDNA3.1-CDV-V重组表达质粒,经转染Vero细胞后,用激光共聚焦技术确定V蛋白在真核细胞中的分布及亚细胞定位。结果显示,成功表达了V蛋白,并制备了阳性血清。重组质粒pcDNA3.1-CDV-V在外源真核细胞Vero中获得了表达,表达蛋白主要聚集于细胞质。本试验结果为进行CDV V蛋白的功能研究奠定了基础。     

Expression,Identification and Subcellular Localization of V Protein of Canine Distemper Virus

In order to study the function of canine distemper virus (CDV) V protein,V gene fragment was inserted into the pGEX-6p-1 vector,and then pGEX-6p-1-CDV-V recombinant expression plasmid was obtained.Purified V protein immunized BALB/c mice to prepare the positive serum.Meanwhile,to confirm the distribution of V protein and subcellular localization with confocal laser technology,a eukaryotic expression recombinant plasmid pcDNA3.1-CDV-V was built,then transfected into Vero cells.The results showed that V protein was successfully expressed and the positive serum was prepared.The recombinant plasmid pcDNA3.1-CDV-V was expressed in Vero cells and mainly expressed in cytoplasm.The results laid a function for functional studies of CDV V protein.     

10株H9N2亚型禽流感病毒HA和NA基因的序列分析

为了从分子水平上掌握我国H9亚型禽流感的变异情况和流行规律,本研究汇集近年来从我国部分省市养殖场分离的10株禽流感H9N2亚型毒株,采用RT-PCR技术对其HA和NA基因进行扩增、克隆和测序,并对所得全序列进行同源性和遗传进化分析。结果显示,本试验分离到的10株病毒的HA和NA基因变异程度不大,变异概率大;在遗传进化树中均属于欧亚分支中的类CBJ194亚分支,与CBJ194的HA基因核苷酸同源性在88.8%~95.8%,NA基因核苷酸同源性在93.4%~97.6%,可能与CBJ194由同一毒株进化而来。由于基因突变使ACHB101毒株的HA基因出现了新的糖基化位点,ACHN102毒株的保守受体结合位点发生变异。NA基因推导氨基酸序列中第63、64、65位有T、EI、3个氨基酸的缺失,导致61位糖基化位点的丢失。唾液酸吸附位点上有明显的突变。HA和NA基因的变异可能与频繁的疫苗免疫选择压力有关。     

猪β-干扰素的基因改造表达及其抗猪繁殖与呼吸综合征病毒活性测定

本研究根据GenBank上登录的猪β-干扰素基因成熟肽核苷酸序列(mPoIFNβ),在保持原猪β-干扰素蛋白序列不变的基础上,对猪β-干扰素基因进行了毕赤酵母偏嗜性改造,并构建了毕赤酵母重组表达质粒pPICZαC-PoIFNβ。pPICZαC-PoIFNβ经SacⅠ酶切线性化后,电击转化导入感受态的毕赤酵母菌株X-33中,转化子经YPDS+Zeocin抗性平板筛选和PCR鉴定后获得多株阳性菌株。阳性酵母菌株经甲醇诱导分泌表达了重组PoIFNβ,其表达量约为127.9 mg/L。表达产物经SDS-PAGE和Western blotting检测,结果表明,表达产物为分子质量约25和28 ku的混合物,并且二者都可与PoIFNβ阳性血清结合。以细胞病变抑制法测定重组β-干扰素在BHK-21细胞上的抗水泡性口炎病毒活性为2.8×10³ IU/mL;对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在Marc-145细胞上抗病毒活性达到1.6×10³ IU/mL。     

滑液支原体GDPD基因的原核表达、酶活性分析及亚细胞定位

为了解滑液支原体（Mycoplasma synoviae,MS）甘油磷酸二酯磷酸二酯酶（glycerophosphodoester phosphodiesterase,GDPD）的生物学功能,本试验参照GenBank中MS WVU1853株序列设计特异性引物,应用PCR技术扩增获得MS WVU1853株GDPD基因,在测序及序列分析的基础上将其克隆至pET-28a（+）质粒构建原核表达载体pET-GDPD,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后经IPTG诱导表达,纯化表达产物并分析其酶促活性,进而制备其多克隆抗体,应用间接ELISA和Western blotting检测其免疫原性并分析其在MS内的分布。结果表明,MS WVU1853株GDPD基因CDS全长726 bp,编码242个氨基酸,重组蛋白分子质量约为28 ku。酶促活性检测表明,重组蛋白可催化对硝基苯磷酸二钠（pNPP）转化为对硝基苯酚,且其作用的最适pH为9.0,最佳温度为37℃,Pb²⁺具有较强的抑制作用,而Ca²⁺对其具有较强的促进作用。间接ELISA及Western blotting检测结果表明,MS GDPD具有良好的免疫原性,可刺激新西兰兔产生高水平的抗体,血清效价高达1：160000;亚细胞定位结果表明,MS GDPD在细胞膜和细胞浆内均有分布,但在细胞膜的含量略高于细胞浆。本研究结果为探究MS GDPD生物学功能提供了一定的参考依据。