9个光合作用相关基因在高油酸油菜近等基因系不同生育期中的表达研究

为了明晰与光合作用相关基因在不同油酸含量油菜中的表达,以高油酸油菜近等基因系出苗后7d去根植株、5~6叶期和越冬期的叶片、花瓣和授粉后20~35d的种子为材料,对9个转录组分析得到的差异基因在近等基因系中的表达进行研究。结果发现,在叶片中,除Bna0305890外,其余8个基因在高油酸油菜材料中的表达量均高于低油酸油菜,Bna0104450和Bna0084310的表达量尤其突出。在花瓣中除Bna0391450外,其余8个基因在高油酸油菜材料中的表达量均高于低油酸油菜,Bna0305890的表达量差异较大。在授粉后20~35d的种子中除Bna0104450和Bna0305890外,其余基因在高油酸油菜中的表达量均低于低油酸油菜,Bna0501620和Bna0391450的表达量差异较大。5个时期Bna0104450在高油酸油菜中的表达量均高于低油酸油菜,有望利用其进行高油酸油菜育种材料的早期筛选。     

不同含油量油菜籽代谢物差异分析

高含油油菜可提高单位面积产油量,因而受到广泛关注,但不同含油量油菜种子中代谢物的差异尚未清楚。本研究以2个含油量不同的甘蓝型油菜近等基因系授粉后20～35 d种子为材料,使用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱分析不同含油量材料间代谢物差异。以低含油量材料为对照,共筛选出46种差异代谢物,其中24种与油脂合成通路相关,14种与脂肪酸合成通路相关,3种与糖代谢相关,2种与维生素代谢相关,1种与激素代谢相关,2种与花青素代谢相关。高含油油菜种子种固醇、花青素、硬脂酸、亚油酸等脂肪酸较高,亚麻酸含量较低。该结果有助于揭示油菜种子中油脂合成的机制,可为高含油油菜育种提供参考。     

不同关键酶基因在油菜种子发育进程中的表达

不同关键酶基因在甘蓝型油菜种子发育过程中对油脂积累的影响重大。为此,本实验选取3个不同含油量的甘蓝型油菜作为模型。研究BnACC1、BnDGAT1和BnPDAT1基因在甘蓝型油菜种子发育时期的表达模式。结果表明:BnACC1在这三种甘蓝型油菜种子中的基因表达模式基本一致,在低含油量油菜的种子发育前期和高含油量油菜的种子成熟期相对表达量高,说明在油脂积累旺盛期该基因的高表达可提高含油量;而BnDGAT1和BnPDAT1在这三种甘蓝型油菜表达模式存在差异。其中,BnDGAT1基因在高含油量油菜中的相对表达量高于低含油量油菜。这说明BnDGAT1基因对油脂积累有一定的促进作用。BnPDAT1基因的相对表达量与甘蓝型油菜含油量密切相关。本研究可以为提高油菜含油量的相关分子机制提供了科学依据。     

甘蓝型油菜磷脂二酰甘油酰基转移酶(BnPDAT1) cDNA的克隆和功能鉴定

磷脂二酰甘油酰基转移酶(phospholipids:diacylglycerol acyltransferase, PDAT1)是植物三酰甘油(triacylglycerol, TAG)合成的关键酶。本文在甘蓝型油菜湘油15号cDNA中克隆到3个PDAT1全长编码序列(coding sequence, CDS), 经比对分别定位于A02、A10、C09染色体, 分别命名为BnPDAT1-A02、BnPDAT1-A10和BnPDAT1-C09, 其序列长分别为1998、2002和2005 bp, 各自编码665、666、667个氨基酸。预测BnPDAT1基因编码蛋白定位于细胞质膜, 具有典型的PDAT1保守结构域。多序列比对和进化分析表明BnPDAT1基因编码蛋白与甘蓝、拟南芥、亚麻芥PDAT1蛋白具有较高的同源性。酵母互补实验证实该基因编码蛋白具有PDAT1酶活性。BnPDAT1基因在湘油15号中的表达现先上升后降低趋势, 在开花后25~30 d达最大值, 但3个拷贝的表达变化规律存在差异。     

甘蓝型油菜脯氨酸合成相关同源基因的进化和差异表达分析

以异源四倍体甘蓝型油菜(Brassica napus)及其二倍体祖先白菜(B.rapa)和甘蓝(B.oleracea)为对象,研究了脯氨酸合成途径关键酶基因P5CS和OAT的进化命运以及各自不同祖先来源的同源基因的差异表达情况。序列比对和进化分析表明,甘蓝型油菜中P5CS基因和OAT基因和其二倍体祖先的相对应基因高度同源;进化上,和二倍体亲本相比甘蓝型油菜P5CS2基因发生了1个拷贝的丢失,而OAT基因没有基因丢失现象;半定量RT-PCR结果表明,甘蓝型油菜中来自二倍体亲本白菜和甘蓝的P5CS2和OAT同源基因在所有检测器官中均表达,没有发生基因沉默;但是它们可能发生了亚功能化,不同祖先来源的2个P5CS2同源基因存在较弱的偏向性表达,不同器官的同源基因表达模式稍有不同;而OAT基因明显偏向于表达来自于甘蓝祖先的同源基因,OAT的2个同源基因的不同器官表达模式基本一致;盐胁迫处理后,来自于甘蓝的BnaC.P5CS1.d表达量显著高于来自于白菜的Bna A.P5CS1.a,表明盐处理条件下甘蓝型油菜偏向性表达BnaC.P5CS1.d。甘蓝型油菜的脯氨酸合成基因Bna A.P5CS1.a、BnaC.P5CS1.d及Bna A.P5CS2.a、BnaC.P5CS2.c的盐诱导表达模式均基本保持了亲本来源基因的特征。以上结果表明,与二倍体祖先相比,甘蓝型油菜中脯氨酸合成基因序列和表达模式均存在高度保守性,这可能说明了脯氨酸积累在进化上对植物的有利性。     

转录组结合区域关联分析挖掘油菜含油量积累的候选基因

油菜(Brassica napus L.)是中国食用植物油的主要来源,提高种子含油量是增加菜籽油供应最为有效的方法。本研究利用4个油菜自交系授粉后25 d、35 d、45 d的种子转录组数据分析,筛选出43个与油脂合成相关基因,其中33个基因持续上调表达, 10个基因持续下调表达,主要基因包括BnLEC1、BnABI5、BnOLEO4和BnOBAP1a等。同时,结合50份半冬性甘蓝型油菜重测序数据,检测到与含油量显著相关3个SNP、9个SNP分别定位到BnOBAP1a-A10和BnABI5-A05,其中BnOBAP1a-A10＿Hap1对应材料含油量显著高于Hap2, BnABI5-A05＿Hap1对应材料含油量显著高于Hap3。此外,利用WGCNA构建基因共表达网络发现, BnOBAP1a与BnABI5通过3个转录因子LEC1、HMGB3、HTA11间接相连,形成了潜在调控的分子网络,影响种子油脂积累。这些结果有利于我们开发单体型功能标记进一步提高油菜籽含油量。     

受母性影响的油菜种子性状研究

以种子含油量和大小2种显著差异性状的甘蓝型油菜DH系甘蓝型油菜为亲本材料(DH 0216为高含油量的小种子,DH 0729为低含油量的大种子)进行正交和反交实验,并对正反交种子进行相关性状比较分析。结果表明:正反交种子与亲本某些性状差异显著,尤其在种子含油量以及子叶含油量上,表现出严重的偏母性。但种子大小、脂肪酸组成等差异不明显,也未表现出偏母性。     

甘蓝型优质高产杂交油菜新品种油研50恢复系6215R的选育

1996年春,以R08(从中国油料作物研究所引进的甘蓝型油菜黑籽双低常规品系89008中系选的优系)为母本和甘蓝型油菜黑籽双低品种6218(从上海市大面积油菜生产区引进的沪油15中的1个选系)为父本进行杂交,在此基础上经过7年8代的连续定向选择,于2002年育成了甘蓝型油菜双低常规优质品系(隐性核不育恢复系)6215R.其芥酸含量均在1%以下,硫甙23.6～28.6μmol/g,含油量42.6%～43.7%,种子蛋白质21.6%～23.8%.以该品系作恢复系组配的优质杂交油菜新组合油YL050已通过贵州省2005～2007年区试和生产试验,于2007年12月通过贵州省农作物品种审定委员会审定,正式定名为油研50.     

甘蓝型油菜SUMO蛋白家族成员鉴定及Bna.SUMO1.C08基因的功能研究

蛋白翻译后修饰对蛋白的功能非常重要。SUMO化修饰就是一种非常重要的蛋白翻译后修饰,它对植物生长发育的关键过程有很大的影响。甘蓝型油菜作为重要的油料和经济作物在SUMO化修饰方面却鲜有报道。为弥补这一空白,本研究对甘蓝型油菜中的SUMO化修饰进行了探究。首先通过生物信息学方法在甘蓝型油菜中鉴定到31个SUMO蛋白成员,分为3类:“典型”群组、“非典型”群组和SUMO-V。然后对甘蓝型油菜中AtSUMO1基因的同源基因Bna.SUMO1.C08进行表达模式分析,发现该基因在根、叶和角果中表达比较高。亚细胞定位结果发现,Bna.SUMO1.C08蛋白定位于细胞核和内质网中。最后在甘蓝型油菜中过表达Bna.SUMO1.C08基因发现其能够增强植株对PEG胁迫的抵抗能力。本研究为后续甘蓝型油菜中SUMO化修饰的研究奠定了一定的基础。     

油菜种子形成中含油量与其合成相关酶活性的变化及其相关性

以具有相同遗传背景的高、低含油量基因型油菜品系04-1989-9和04-1989-4为材料, 研究种子形成过程中含油量与脂肪合成相关酶活性的动态变化及其相关性。结果表明, 两品系的种子含油量、6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)活性、磷脂酸磷酸酯酶(PPase)活性均在开花后逐渐增加, 花后24~31 d达最高峰,且品系间差异均达显著或极显著水平; G6PDH、PPase活性和含油量呈极显著正相关, 推测二者是影响含油量的关键因子。     

甘蓝型黄籽油菜育种研究的新进展

一、高含油量和高产品种的选育1.我国第一批甘蓝型黄籽品系在生产上的应用 自1975年以来,在我国我们首次发现和建立了甘蓝型黄籽油菜种质库。1985年育成955和2328两个黄籽品系,这两个品系用     

甘蓝型油菜油酸脱氢酶基因(fad2)多个拷贝的发现及分析

以甘蓝型油菜湘油15为材料, 随机挑选56个来自基因组的fad2基因克隆、47个来自幼苗整株的fad2基因cDNA克隆和9个授粉27 d后种子中fad2 cDNA克隆进行双向测序。基因组中56个fad2序列的碱基同源性为91.0%~99.9%, 从中得到11个差异序列, 即11个不同的fad2基因拷贝。将其翻译成氨基酸序列发现, 6个拷贝在编码区中出现多个终止密码子, 另外5个的同源性为90.60%~99.74%, 与47个来自幼苗整株的fad2基因cDNA序列进行比较, 发现fad2基因没有内含子。从种子中的9个fad2 cDNA克隆序列中找到2个有差异的cDNA, 它们的编码区中没有终止密码子, 说明在种子中有多个fad2基因表达。基因组中的11个拷贝根据同源性可分成两组, 命名为fad2I和fad2II。RT-PCR分析发现在授粉27 d的种子中fad2I有较强表达, fad2II没有表达; 但在叶片中两者都有表达。     

甘蓝型油菜油酸脱氢酶基因(fad2)多个拷贝的发现及分析

以甘蓝型油菜湘油15为材料, 随机挑选56个来自基因组的fad2基因克隆、47个来自幼苗整株的fad2基因cDNA克隆和9个授粉27 d后种子中fad2 cDNA克隆进行双向测序。基因组中56个fad2序列的碱基同源性为91.0%~99.9%, 从中得到11个差异序列, 即11个不同的fad2基因拷贝。将其翻译成氨基酸序列发现, 6个拷贝在编码区中出现多个终止密码子, 另外5个的同源性为90.60%~99.74%, 与47个来自幼苗整株的fad2基因cDNA序列进行比较, 发现fad2基因没有内含子。从种子中的9个fad2 cDNA克隆序列中找到2个有差异的cDNA, 它们的编码区中没有终止密码子, 说明在种子中有多个fad2基因表达。基因组中的11个拷贝根据同源性可分成两组, 命名为fad2I和fad2II。RT-PCR分析发现在授粉27 d的种子中fad2I有较强表达, fad2II没有表达; 但在叶片中两者都有表达。     

芸薹属种间远缘杂交结实的特异性观察

通过对甘蓝型油菜与白菜、白菜与甘蓝型油菜进行种间远缘杂交,观察杂交当代结荚、结籽以及种子发育的特异性。采用特定的芸薹属甘蓝型油菜、白菜不育系材料和白菜、甘蓝型油菜自交材料进行配组,选用染色体数目不同的甘蓝型油菜不育系和白菜薹不育系分别与白菜薹和甘蓝型油菜进行杂交,观察分析杂交后的种子发育过程,分析不同组合的结荚、结籽以及种子发育的特异性。结果表明:以染色体数目多的油菜不育系为母本,杂交亲和力明显高于以染色体数量少的白菜型不育系做母本的杂交组合;虽然其结实率远低于非远缘杂交组合,但所结的种子大多发育正常;而以染色体数量少的白菜型不育系为母本同染色体数目多的甘蓝型油菜进行杂交,在种胚的发育过程中,出现严重的遗传紊乱,致使杂交结实过程中出现授粉困难,授粉后绝大部分受精不良,甚至胚发育死亡,特别是部分种子尚未发育成熟即在荚内发芽等特异情况的发生得到了反复验证,但其内在机理尚不清楚。     

甘蓝型油菜在海南种植的生育期、品质性状和育性分析

为进一步拓展自育早熟甘蓝型油菜新品种(系)的种植区域及多功能用途,本试验主要在海南省海口市和东方市种植并研究了63份甘蓝型油菜和3份白菜型油菜品种(系)分期播种和不同栽培方式下各材料生育期、菜籽品质和高温耐热表现的变化。结果表明,在海口市越冬种植单作甘蓝型油菜有33份品种(系)呈现早熟的特点,生育期为77～124 d,在东方市与苦瓜间作秋播的生育期在89～145 d之间,可与苦瓜套作收获的甘蓝型油菜有22份品系(苦瓜生育期≤120 d)。越冬种植和间作种植的甘蓝型油菜含油量均值为32.82%和32.35%,其中‘利油杂718’的含油量最高,为42.52%。海口越冬种植品种有4个低芥酸品种(≤3%)和17个低硫苷品种(≤30%);在东方市与苦瓜间作的29份材料中有3份低芥酸和13份低硫苷,其中越冬品种20N9-314-1和秋播品种20N9-314-2符合双低标准,不同季节或地点种植种子品质略有变化。在海口夏播参试材料中5份材料(20N9-114-1×20N9-115-1, 440-1, 20N9-356-1,‘硒滋圆2号’和21QZ-314-2)由室外移入室内培养箱后,不育转变为部分不育...     

甘蓝型优质高产杂交油菜新品种油研50恢复系6215R的选育

1996年春,以R08（从中国油料作物研究所引进的甘蓝型油菜黑籽双低常规品系89008中系选的优系）为母本和甘蓝型油菜黑籽双低品种6218（从上海市大面积油菜生产区引进的沪油15中的1个选系）为父本进行杂交,在此基础上经过7年8代的连续定向选择,于2002年育成了甘蓝型油菜双低常规优质品系（隐性核不育恢复系）6215R。其芥酸含量均在1％以下,硫甙23．6～28．6μmol／g,含油量42．6％～43．7％,种子蛋白质21．6％～23．8％。以该品系作恢复系组配的优质杂交油菜新组合油YL050已通过贵州省2005～2007年区试和生产试验,于2007年12月通过贵州省农作物品种审定委员会审定,正式定名为油研50。     

甘蓝型油菜皖油20号种子不同部位油脂合成的转录调控分析

甘蓝型油菜是主要的油料作物之一,种子含油量一般在35%～50%。油脂主要储存于油菜种子胚中,胚主要由子叶[包括外子叶(OC)和内子叶(IC)和胚轴(EA)]组成。低芥酸油菜品种皖油20号(WY20)种子不同部位的含油量存在显著差异。WY20的胚中, OC含油量最高, EA含油量最低。同时,脂肪酸组成在种子不同部位也存在差异, EA中棕榈酸(C16:0)、亚油酸(C18:2)及二十碳酸(C20:0)的比例均显著高于子叶,特别是C16:0在EA中的比例约为子叶的2倍。而油酸(C18:1)及二十碳烯酸(C20:1)在子叶中的比例均显著高于EA。硬脂酸(C18:0)在OC中含量最低,在IC和EA中无差别。亚麻酸(C18:3)则在OC中含量最高,在IC和EA中无差异。对发育34d种子的IC、OC和EA进行转录组分析,将三个部位中基因表达定量分析的结果两两比较后共发掘出7192个差异表达基因,其中OC和IC之间差异表达基因数目较少,子叶和EA间有较多的差异表达基因。子叶和胚轴中的差异表达基因富集在光合作用、脂肪酸代谢和叶绿素合成等生物学过程。基因功能注释显示,差异表达基因中有355个和脂质代谢相关,且多集中在质体中脂肪酸从头合成途径。本研究表明油脂合成途径关键基因的差异调控是造成油菜种子不同部位含油量和脂肪酸组成差异的主要因素。     

甘蓝型油菜隐性核不育优良恢复系6958R的选育

1998年春以R06(从中国油料作物研究所引进的甘蓝型油菜黑籽双低常规品种中双4号中系选的优系)为母本和甘蓝型油菜黑籽双低品种湘油15(从湖南省大面积油菜生产区引进的湘油15中的1个选系)进行有性人工杂交,采用常规杂交育种程序经过7年8代的连续定向选择,于2004年育成了甘蓝型油菜双低常规优质品系(隐性核不育恢复系)6958 R(又简称58 R).其芥酸含量均在1％以下,硫甙21.2 ～25.2μmol/g,含油量42.6％～43.6％,种子蛋白质23.5％～ 25.6％.以该品系作恢复系组配的优质杂交油菜新组合普遍表现配合力强,杂交优势明显,丰产性突出,且组配的绝大多数组合均表现株高适中,分枝角度小,株型紧凑,着果密,角果粗,千粒重大,在生产上比较受欢迎.是一份难得的具有优良、特异农艺性状和一般配合力、特殊配合力都很强的甘蓝型油菜隐性核不育系的骨干恢复系.现已用该恢复系组配选育成功翔油1号、益油1号两个综述性状表现均很突出杂交油菜新品种.     

高油酸油菜成熟期种子转录组分析

为了找出差异基因用于高油酸油菜育种,对两个油酸含量不同的高油酸油菜材料(油酸含量分别为84.4%和56.2%)成熟期种子进行转录组分析和实时荧光定量PCR分析。Illumina Hiseq TM2000测序得到8.09 Gb clean reads,组成52 361个unigene,平均长度为659 bp。比对公共数据库得到48 911(93.41%)个氨基酸序列。鉴定出6 414个在高油酸油菜和低油酸油菜中差异显著的基因,这些基因有1 296个在高油酸油菜中上调表达(20.21%),5 118个下调表达(79.79%),共有2 043个差异基因在119个代谢通路中富集表达。将其中14个与脂肪酸代谢和光合作用相关基因进行荧光定量PCR验证。Bna0799930,Bna0104450和Bna0305890在高油酸油菜中上调表达,其余的下调表达。Bna0501620,Bna0391450和Bna0084310在高油酸油菜中的表达量超过低油酸油菜中表达量2倍以上,分别为4.48倍,4.21倍和2.26倍。这些新发现的差异基因可用于高油酸油菜分子育种研究。     

Bna.C02SWEET15通过光周期途径正向调控油菜开花时间

开花时间是作物的重要农艺指标,关系着作物的生育周期和产量。糖转运体作为植物重要的碳水化合物运输载体,作用于油菜开花时间的研究鲜有报道。本研究在油菜FOX-Hunting文库中鉴定了一个与油菜开花相关的蔗糖转运蛋白Bna.C02SWEET15,通过组织表达和亚细胞定位分析,转基因和突变体表型观察,开花关键基因表达水平检测等解析其生物学功能与调控机制。Bna.C02SWEET15在油菜各组织部位均能够表达,在花后30d种子中最显著。Bna.C02SWEET15定位于细胞膜,启动子活性主要在花药和花后30d种子中。在拟南芥中过表达Bna.C02SWEET15使植株开花提前,利于植株开花的光周期关键基因CO、FT、LFY表达明显上升,负调控基因FLC表达量降低。拟南芥突变体atsweet15a和RNAi-Bna.C02SWEET15转基因油菜均为晚花表型。推测Bna.C02SWEET15能够通过光周期途径正向调控油菜开花时间影响油菜的生育周期。研究结果对理解糖转运体在作物中的调控作用,为油菜高产育种提供了基因资源,奠定了理论基础。