茶树叶绿素合成相关基因克隆及在白叶1号不同白化阶段的表达

高等植物叶绿素的生物合成对其正常光合作用起关键作用。本文根据前期芯片杂交结果, 采用RT-PCR和RACE技术克隆了3个茶树叶绿素合成相关基因, 分别为谷氨酸-tRNA还原酶(CsGluTR)、叶绿素合酶(CsChlS)、叶绿素酸醋氧化酶(CsCAO), 对应的GenBank的登录号为HQ660371、HQ660370、HQ660369。序列分析表明, CsGluTR基因全长2165 bp, 开放阅读框长1665 bp, 编码554个氨基酸, 推测的蛋白分子量约为60.6 kD, 理论等电点为8.78;CsChlS基因全长1463 bp, 其中开放阅读框长1125 bp, 编码374个氨基酸, 推测的蛋白分子量约为40.5 kD, 理论等电点为8.58;CsCAO基因全长2146 bp, 其中开放阅读框长1611 bp, 编码536个氨基酸, 推测的蛋白分子量约为60.8 kD, 理论等电点为8.03。比对分析表明, 3个基因编码的氨基酸序列与其他植物中同源基因的相似性均在70%以上。利用荧光定量PCR技术检测3个基因在不同白化阶段的表达,表明, CsChlS和CsCAO基因具有明显的表达协同性, 它们在叶片中的表达量与叶片的颜色变化高度同步;而CsGluTR在白化叶片和正常叶片中的表达差异相对较小, 同时在新生芽叶转绿过程中最先恢复正常表达水平。说明在白化叶片中, 叶绿素的合成机制受到较大影响, 叶绿素合成受阻导致的叶片内色素类物质含量降低或消失是叶片白化的直接原因。     

石蒜LrCMO基因的克隆及表达分析

以石蒜(Lycoris radiata)为试材,采用同源克隆和RACE的试验方法,克隆得到LrCMO基因全长cDNA,并对其进行了基因表达分析。结果表明:LrCMO基因全长1 472 bp,其中开放阅读框(ORF)为1 281 bp,编码427个氨基酸残基,预测编码蛋白质的分子量为47.92 kD,理论等电点为5.72;LrCMO是一个稳定的疏水蛋白,不具有跨膜结构,含有叶绿体导肽;LrCMO基因编码的氨基酸与植物其他CMO蛋白具有较高的一致性,且与海枣PdCMO、香蕉MaCMO及油棕EgCMO亲缘关系最高,聚为一类。实时荧光定量PCR分析表明,LrCMO在根、鳞茎和叶片中有表达,且在鳞茎中的表达量最高;LrCMO受聚乙二醇(PEG)处理的诱导表达,其基因相对表达量在处理后12 h达到最高。随着处理时间的延长,LrCMO基因相对表达量逐渐下调至对照水平。     

芒果4CL基因的克隆及其表达分析

4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)是植物类黄酮类化合物和木质素等生物合成途径的一种关键酶,为了研究其在芒果果实中的作用机理,采用RACE方法,从芒果果实克隆得到了一个类黄酮合成相关的4CL基因。该基因全长c DNA序列为1 740 bp,开放阅读框为1 653 bp,编码550个氨基酸,分子量为60.47 k Da,等电点为9.51。对基因组扩增得到了2 318 bp长度的片段分析发现,该基因含有5个内含子,分别在1 013~1 139 bp,1 330~1 415 bp,1 564~1 653 bp,1 722~1 802 bp,1 905~2 000 bp。通过在线软件对其二级结构和三级结构进行了预测,系统发育分析发现该基因编码的蛋白与水曲柳、菘蓝等植物具有较近的亲缘关系。对3种不同着色的芒果品种中的4CL基因的RTPCR进行分析发现:红色的贵妃品种中表达量较高,而绿色的桂七品种中表达量较低。研究表明4CL基因表达芒果果实着色具有密切的相关性。     

棉花S-腺苷蛋氨酸脱羧酶基因(GhSAMDC2/3/4)的克隆及其诱导表达分析

利用电子克隆结合RT-PCR技术克隆获得陆地棉(Gossypium hirsutum L.)S-腺苷蛋氨酸脱羧酶(S-adenosylmethionine decarboxylase,SAMDC)基因家族3个基因,分别命名为Gh SAMDC2、Gh SAMDC3和GhSAMDC4。序列分析显示,该基因c DNA包含的upstream ORF(u ORF)和main ORF(m ORF)为植物SAMDC基因特征ORF,其中m ORF长度分别为1068 bp、1110 bp和1032 bp,分别编码355、369和343个氨基酸。聚类分析表明,Gh SAMDC2/3蛋白与可可树(Theobroma cacao)SAMDC聚为一类,且Gh SAMDC2与GhSAMDC3蛋白亲缘关系最近;Gh SAMDC4与拟南芥At SAMDC4聚为一类。实时荧光定量PCR分析表明,Gh SAMDC2在茎中表达相对较高,随着纤维发育其表达量不断增加,在纤维发育后期其表达量达到最高;Gh SAMDC2/3/4在不同的胁迫条件下表现出不同的表达模式,Gh SAMDC2受低温和干旱胁迫诱导最强烈,Gh SAMDC3响应盐胁迫显著,Gh SAMDC4受ABA诱导强烈。上述结果为进一步研究棉花SAMDC基因功能奠定了一定基础。     

山葡萄苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)的克隆与表达分析

为了探究山葡萄果皮转色阶段影响花色苷组成的关键酶的表达,以山葡萄幼叶为试验材料,提取山葡萄基因组DNA,应用同源克隆方法获得了PAL基因(GenBank登录号:MH045991)的全长序列,并进行了生物学信息分析。采用Q-PCR方法对山葡萄果皮8个不同着色时期的表达量进行分析。结果显示,PAL基因的DNA序列全长是1 763 bp,具有一个1 671 bp的开放阅读框(ORF),编码556个氨基酸。分子量为61. 07 ku,等电点为5. 76,为稳定蛋白质。整个多肽链具有跨膜螺旋结构,无信号肽,分子进化树分析表明,与欧亚种葡萄同源性较高; PAL基因在山葡萄果皮8个时期的表达规律,分析PAL基因在后4个时期表达量的不规则变化,PAL基因在转色50%和转色100%这2个时期几乎不表达。PAL基因的表达调控受很多因素调节,在山葡萄生长发育前期呈一定规律变化,在后4个时期表达量呈不规则变化,PAL基因在转色50%和转色100%2个时期几乎不表达,这可能受到某种抑制PAL酶活性因子的影响。     

木薯MeTCP4转录因子的克隆、表达分析及植物表达载体的构建

TCP转录因子家族基因参与植物生长及环境胁迫的多重调节,然而该家族基因在木薯中少有研究。木薯TCP家族基因有36个,系统进化树分析MeTCP4家族可分为8个亚组。MeTCP4基因是木薯TCP家族36个基因之一,可被miR319转录后剪切。MeTCP4基因开放性阅读框(ORF)长1 269 bp,编码422个氨基酸,预测编码蛋白质相对分子质量为45.75 kD,理论等电点为6.17。从木薯基因组中成功克隆得到MeTCP4基因全长cDNA,荧光定量RT-PCR结果显示MeTCP4基因在各组织器官都有表达,根部表达最低、茎次之、叶子中表达最高并且MeTCP4基因受干旱及低温胁迫抑制。构建高、低植物表达载体,为进一步研究该基因的功能提供依据。     

菊花CmWRKY4基因克隆及表达分析

WRKY转录因子在植物生长发育和逆境胁迫应答中具有重要作用。本研究克隆了一个菊花WRKY基因CmWRKY4,编码区长1 344 bp,编码447个氨基酸,预测分子量约为49.69 kD,等电点为6.62。推测的氨基酸序列中含有2个高度保守的WRKY结构域。亚细胞定位预测CmWRKY4蛋白定位于细胞核。进化树分析发现,CmWRKY4和拟南芥At WRKY3,AtWRKY20和At WRKY25聚在一个分支。组织特异性表达模式分析表明CmWRKY4在检测的组织中都有表达,在根中表达量最低,在叶中表达量最高。Cm WRKY4基因的表达受干旱诱导,说明菊花CmWRKY4基因可能参与菊花对干旱胁迫的应答。     

亚麻木质素合成关键酶基因表达分析

以亚麻(Linum usitatissimum)栽培品种白花为材料,采用半定量RT-PCR方法对亚麻木质素合成关键酶基因CCoAOMT1、4CL1、4CL2、COMT、F5H1、F5H2和F5H3在不同组织及不同时期木质部、韧皮部的表达规律进行了研究。结果显示, 除F5H1在根部未表达外,其他基因在幼苗、根、花期木质部、花期韧皮部、叶、花和幼果中均有不同程度表达。CCoAOMT1在各部位都有较高的表达。2个4CL之间和3个F5H基因之间的部位表达的差异存在一定互补性。在韧皮部中,各基因均在幼嫩(30 d)阶段表达量最低;除4CL2在花期(60 d)达到表达高峰外,其他基因均在花后(70 d)表达量最高;4CL1在各时期均有较强表达,而F5H3在各时期弱表达。在木质部中,除4CL1在各时期均表达弱和F5H1在花前期为表达高峰外,其余基因均在幼嫩阶段表达量最高;随后逐渐降低,在花期后表达量大幅降低;与其他基因的明显区别在于各时期4CL1的表达量以韧皮部明显高于木质部。     

地被菊CmGATA8基因及启动子克隆与表达分析

地被菊花色艳丽、花型整齐、花香清新淡雅,但在东北地区很多地被菊品种不能越冬.本试验以地被菊'YINGJIE'为材料,克隆CmGATA8,全长为1 152 bp,最大开放阅读框(ORF) 951 bp,编码317个氨基酸,包含一个GATA结构域;CmGATA8分子量为34.75 ku,等电点为6.07,不稳定系数为59....     

甘青青兰Dt4CL基因过表达载体构建与生物信息学分析

4香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate:coenzyme A ligase, 4CL)是黄酮类、木质素生物合成的关键酶之一,位于苯丙氨酸代谢途径的主途径向分支途径过渡的关键点上,控制进入不同的次生代谢支路以产生不同的次级代谢产物。本试验以甘青青兰(Dracocephalum tanguticum Maxim)为材料,利用PCR技术从甘青青兰中克隆出该家族成员一个基因,命名为Dt4CL1,利用双酶切及质粒重组法构建过表达载体Dt4CL1-PHB。对该基因编码的蛋白进行理化性质、疏水性、信号肽、二级结构、三级结构及系统进化树等生物信息学分析。结果显示该基因ORF全长1 719 bp,编码572个氨基酸,预测分子量为61.61 kD,理论pI为5.39。系统进化分析表明,Dt4CL1蛋白与丹参、夏枯草及小冠薰的4CL蛋白同源性最高。本研究结果为之后研究Dt4CL1的功能提供科学依据。     

紫苏甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因PfPMK的克隆与表达分析

为了研究甲羟戊酸-5-磷酸激酶(PMK)在紫苏萜类物质生物合成代谢通路中的重要作用，对紫苏转录组数据进行分析，挖掘出紫苏PMK基因参考序列，采用基因克隆技术从紫苏中克隆了PMK基因，利用生物信息学和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法对紫苏PMK基因进行了分析。结果表明，紫苏PMK基因开放阅读框(ORF)全长为1 524 bp,编码507个氨基酸。生物信息学分析显示，PfPMK的分子质量为54.73 ku,等电点为5.20,为亲水蛋白；紫苏PfPMK氨基酸与SmPMK、SsPMK、SbPMK和PvPMK同源性较高，说明紫苏PfPMK蛋白在进化过程中保守性较强。亲缘关系分析显示，PfPMK与丹参和一串红的PMK亲缘关系很近，在线软件WoLF-PSORT预测PfPMK蛋白可能定位于质膜或内质网膜上。qRT-PCR结果表明，PfPMK基因在紫苏根、茎、叶中均有表达，在根中的表达量高于在叶和茎中的表达量；紫苏不同生长发育时期的qRT-PCR分析显示，PfPMK基因在9月中下旬表达量较高。首次从紫苏中克隆出PfPMK基因，生物信息学分析该基因属于甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因，参与了紫苏萜类物...     

果子蔓凤梨Actin基因的克隆与序列分析

持家基因Actin常被用作定量、半定量PCR试验的内参,以确定目标基因的相对表达量。基于前期从全长cDNA文库中获得Actin基因的EST单克隆,进行Primer Walking测序,获得一个Actin基因的全长cDNA序列,序列长1625bp,ORF为1131bp,可编码377个蛋白氨基酸,命名为Goactin1(GenBank登录号:HQ184438)。蛋白质理论分子质量为41.7kD,等电点pI为5.31,包含一个Actin superfamily保守区,二级结构主要由随机卷曲、Alpha螺旋、延伸链和Beta转角组成。此外以2BTF A链为基础建立起了Goactin1蛋白的三级结构图。系统进化树分析表明Goactin1蛋白与马铃薯、棉花、烟草、短柄草、拟南芥等的Actin蛋白聚为一类,它们的亲缘关系最近。     

橄榄类黄酮3'-羟化酶CaF3'H基因的克隆及其表达特性分析

以‘清榄一号’橄榄(Canarium album)果肉为材料,通过RACE技术克隆得到橄榄类黄酮3'-羟化酶(F3'H)cDNA序列全长,命名为CaF3'H(GenBank登录号KY189088.1)。CaF3'H全长为1 649 bp,包含一个1 554 bp开放阅读框(ORF),编码517个氨基酸,5'和3'非编码区(UTR)长度分别为40 bp和55 bp,编码的氨基酸序列含有P450结构域和半胱氨酸亚铁血红素结合域保守区。氨基酸多重比较分析表明:橄榄和芒果的氨基酸序列相似性为78.89%,较之于其他物种相对最高。蛋白结构预测结果显示,CaF3'H蛋白呈弱亲水性,存在跨膜结构域,没有信号肽。实时荧光定量PCR分析显示,CaF3'H在‘清榄一号’和‘檀香’2个橄榄栽培品种的表达量在花后50 d达到最大值,此后其表达量随果实的成熟呈现出波动,总体表达量比花后50 d都低,这与橄榄生长发育时期多酚含量的变化趋势相符,推测CaF3'H基因在调控果实多酚含量过程中发挥着重要作用。     

巨峰葡萄Rs基因的克隆鉴定、序列分析与时空表达特征研究

探究白藜芦醇合酶(Resveratrol synthase,Rs)在巨峰葡萄果实发育中的潜在作用。对其序列进行结构及功能分析,并鉴定其在果实不同发育时期的时空表达特异性。采用生物信息学分析及qRT-PCR的方法,对巨峰葡萄Rs基因序列进行分析,并对其结构和亚细胞定位进行预测,以及分析果实不同时期不同组织的表达情况。克隆得到的Rs基因cDNA全长1 539 bp,开放阅读框(ORF)为1 179 bp,编码392个氨基酸,预测蛋白分子质量42.88 ku,理论等电点(pI)为6.09,且该基因含有查耳酮和二苯乙烯合酶活性位点以及完整的芪合酶家族特征位点;蛋白互作预测发现,Rs和OMT2.1具有互作,后者可催化白藜芦醇生物合成紫檀芪;亚细胞预测结果表明,Rs基因主要在细胞质和叶绿体中表达;启动子分析发现,Rs基因表达可能受光照、MYB、真菌和激素的调控并存在一定的组织特异性。qRT-PCR表达分析显示,葡萄Rs基因在果皮和果肉中不同时期均有表达,但在花后25 d的青皮中表达量最高。结合Rs基因在白藜芦醇积累的作用,可以推测可能在果实发育前期的果皮中白藜芦醇有较高积累。巨峰葡萄Rs基因在进化过程中具有较高的保守性,其表达可能受环境、真菌和激素的调控且与OMT2.1具有互作效应。而且在不同的组织和时期存在一定的特异性。     

松墨天牛肌球蛋白轻链2基因的鉴定及表达模式

为阐明松墨天牛肌肉收缩机理和相关基因表达模式,用构建c DNA文库方法,从松墨天牛c DNA中克隆到松墨天牛肌球蛋白轻链2基因,命名为Ma MLC-2(Gen Bank:KM371003)。该基因c DNA为882 bp,其中开放阅读框(ORF)为618 bp,编码205个氨基酸,推测的蛋白等电点为4.66,分子量为22.26 k Da。Ma MLC-2的氨基酸序列与赤拟谷盗同源性最高,为96%,与东方蝼蛄等8种昆虫同源性为85%~88%。松墨天牛与赤拟谷盗处在系统发育树的同一分支上。Ma MLC-2属于亲水性氨基酸,存在2个EF-hand结构域,长度均为29个氨基酸,其中第1个EF-hand结构域含有Ca2+结合位点。SWISS-MODEL预测结果显示,Ma MLC-2有2个螺旋-环-螺旋结构。用RT-q PCR分析了Ma MLC-2基因的相对表达量,结果显示:蛹和幼虫的表达量高于成虫;成虫中足表达量最高,腹部表达量最低,各部位均有表达,且有显著差异(P0.05)。     

马尾松Aux/IAA家族相关基因克隆及初步分析

生长素信号转导途径在植物生长发育过程中起到至关重要的作用,Aux/IAA(auxin/indoleacetic acids)家族基因可以直接和生长素相连而发生作用。研究马尾松Aux/IAA家族相关基因,可为马尾松体内生长素信号转导途径提供理论支持。本研究克隆出3个Aux/IAA家族基因,分别命名为Pm IAA1、Pm IAA2和Pm IAA3。Pm IAA1基因,c DNA全长1 330 bp,包含711 bp完整的ORF,能够编码含有236个氨基酸的蛋白质,此蛋白相对分子质量为26 015.6 u,等电点为7.01;Pm IAA2基因,c DNA全长1 628 bp,包含909 bp完整的ORF,能够编码含有302个氨基酸的蛋白质,此蛋白相对分子质量为41 176.1 u,等电点为5.25;Pm IAA3基因,c DNA全长1 316 bp,包含759 bp完整的ORF,能够编码含有252个氨基酸的蛋白质,此蛋白相对分子质量为28 060.1 u,等电点为6.01。Pm IAA1蛋白与火距松IAA1蛋白同源性高达95%,Pm IAA2蛋白与火距松IAA2蛋白同源性高达97%,Pm IAA3蛋白与火距松IAA3蛋白同源性高达98%。Pm IAA1、Pm IAA2、Pm IAA3蛋白都含有Aux/IAA结构域,此结构域可以与ARFs(auxin response factors)结合而发生作用,这符合Aux/IAA家族的特点。利用实时定量技术得知,Pm IAA1、Pm IAA2和Pm IAA3在马尾松嫩根、嫩芽、嫩叶中都有表达。Pm IAA1在嫩叶中表达量最高、嫩根中次之、嫩茎中最低;Pm IAA2和Pm IAA3在嫩根中表达最高、嫩叶和嫩茎中次之。本研究可为生长素调控马尾松生长发育相关机理提供依据。     

白花泡桐纤维合成酶PfCesA4基因克隆及初步表达分析

本研究的目的是克隆白花泡桐纤维素生物合成途径关键酶基因——纤维素合成酶家族基因。采用PCR和RACE技术,利用Oligo、Primer Premier 5等软件进行引物设计,从白花泡桐中克隆出纤维素合成酶基因一条,NCBI分析后,命名为PfCesA4 (NCBI登录号:MK340936)。PfCesA4基因的cDNA全长为3 735 bp,其开放阅读框(ORF)长度为3 138 bp,能够编码含有1 045个氨基酸的蛋白质,此蛋白质的相对分子质量为119 081.91 u,等电点为7.24。二级结构分析表明其以α-螺旋和无规则卷曲为主。结构域和跨膜区分析表明其在N端含有锌指结构域及2个跨膜区,在C端含有6个跨膜区,这些结构域能够表现纤维素合成酶的特征。系统进化树分析表明在所选取的物种当中,白花泡桐与芝麻的亲缘关系较近。组织特异性分析结果表明,其在茎中的表达量最高,根部次之,叶部最少;且在茎中,木质部的表达量高于韧皮部,说明其可能主要参与次生壁的建成。通过对PfCesA4基因的克隆及分析,能够为泡桐纤维素生物合成途径及后期利用分子手段对泡桐木材进行遗传改良提供基因资源。     

油茶CoSAUR32和CoSAUR50基因的克隆及表达分析

本研究以油茶‘华硕’为试验材料,通过PCR克隆获得两个生长素响应SAUR (Small auxin upregulated RNA)基因家族的基因,命名为CoSAUR32和CoSAUR50。CoSAUR32基因开放阅读框(ORF)为372 bp,编码123个氨基酸;CoSAUR50基因开放阅读框(ORF)为318 bp,编码105个氨基酸。序列分析发现CoSAUR32和CoSAUR50蛋白均无信号肽与跨膜结构,在叶绿体和细胞核中均可表达。对其进行同源性比对及进化树分析发现,油茶两个SAUR与茶树SAUR亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果表明,CoSAUR32和CoSAUR50基因在自交授粉子房中36 h时的表达量显著高于异交子房,在自交授粉花柱中24 h时的表达量显著高于异交花柱。推测CoSAUR32和CoSAUR50可能参与油茶自交不亲和过程。本研究为挖掘SAUR基因的功能及解析油茶自交不亲和分子机制提供参考依据。     

华北紫丁香肉桂酸4-羟化酶(SoC4H)基因的克隆及表达分析

华北紫丁香系木犀科丁香属落叶灌木,是北方著名的花木之一。为了进一步研究华北紫丁香肉桂酸4-羟化酶(SoC4H)在花色苷代谢途径中的表达特性,利用RT-PCR技术对SoC4H基因进行分离克隆,并对其进行生物信息学分析,同时利用实时荧光定量PCR技术分析了该基因的组织表达模式。结果表明,SoC4H基因的最大开放阅读框(opening reading frame,ORF)长为1 518 bp,编码505个氨基酸残基;该基因的基因组序列无内含子;SoC4H基因在初花期和根部的表达量较高。     

津田芜菁泛素结合酶BrUBC11基因的克隆及表达分析

为阐释津田芜菁Br UBC11基因的表达特性,克隆了津田芜菁UBC11基因的全长c DNA序列,命名为Br UBC11,Gen Bank登录号为KM396887。其c DNA全长685 bp,ORF区全长447 bp,编码148个氨基酸的开放阅读框;亚细胞定位结果显示,Br UBC11-GFP定位于细胞核内,表明Br UBC11蛋白可能在细胞核中发挥其功能。荧光定量PCR检测Br UBC11在芜菁不同组织中的表达结果表明,该基因在花瓣中表达量最高,花蕾中次之,具有组织特异性。而且Br UBC11在芜菁白色根皮中的表达受长波紫外线(UV-A)诱导。研究结果显示,在芜菁中,UBC11属于多功能基因,具有潜在的参与花发育和UV-A信号转导相关途径的功能。