百脉根ACC氧化酶基因LcACO1的克隆及序列分析

植物激素乙烯参与植物生长发育多个生理过程的调控。ACC氧化酶是植物乙烯合成途径中的关键合成酶。本研究依据其它物种ACC氧化酶序列信息设计简并引物,并结合RT-PCR和快速扩增c DNA末端技术从牧草百脉根中首次克隆到ACC氧化酶基因的全长c DNA序列,命名为LcACO1。LcACO1全长c DNA为1 012 bp,具有一个924 bp ORF可编码307个氨基酸残基。生物信息学分析表明,LcACO1是含有Fe2+依赖的加氧酶结构域的稳定亲水蛋白,没有信号肽和跨膜结构域,亚细胞定位于细胞质。与其它植物中的ACO蛋白进行同源性比对显示,LcACO1蛋白与鹰嘴豆中ACO蛋白的一致性高达90%。实时荧光定量PCR表明,LcACO1基因在百脉根不同组织器官中差异表达,根中表达量最高,推测其主要在根的生长发育调节方面发挥作用。     

珍珠黄杨BsGAI1基因的克隆及实时定量表达分析

DELLA蛋白是赤霉素信号传导通路中一类重要的负调节因子。本研究以珍珠黄杨叶片为试材,利用PCR技术和RACE技术克隆得到珍珠黄杨DELLA蛋白基因Bs GAI1。其c DNA全长2 576 bp,包括1 884 bp完整的ORF,能够编码含有627个氨基酸的蛋白。同时,蛋白相对分子质量为67.39 k D,等电点(p I)为4.99,并且总亲水性平均数为-0.162,预测该蛋白为亲水性蛋白。生物信息学研究表明,Bs GAI1编码蛋白具有DELLA蛋白的典型结构域。实时荧光定量表达分析表明,Bs GAI1基因在珍珠黄杨根、叶、茎和花中都有一定的表达,在根中表达量最低,茎中表达量最高。研究说明,Bs GAI1基因可能在珍珠黄杨茎节间缩短导致矮化的过程中扮演重要角色。     

玉米ZmBRI1基因的克隆、表达及功能分析

油菜素内酯(BRs)是一种重要的甾族类激素,在植物的生长过程中起着重要的作用。本研究利用同源克隆的方法,从玉米B73自交系中获得了一个新的油菜素内酯受体蛋白编码基因ZmBRI1,该基因全长为3369 bp,编码1122个氨基酸。亚细胞定位分析表明,ZmBRI1蛋白定位于细胞膜上,而且ZmBRI1在各个玉米的各个组织器官中都有表达,其中在幼嫩的组织中表达最高。利用转基因技术将ZmBRI1导入BR不敏感突变体bri1-5中,获得的转基因植株修复了其表型,特别是植株高度、叶片形态和果荚大小。与突变体bri1-5比较,油菜素内酯(brassinolide,BL)处理显著抑制转基因株系根系生长;丙环唑(propiconazole,Pcz)处理显著抑制了下胚轴生长;同时转基因株系DWF4和CPD基因的表达量下降。此外,在野生型(Ws)中过表达ZmBRI1,显著提高了拟南芥在ABA抑制条件下的种子萌发率和植株生长,下调了ABA响应基因RD29A、RD29B、ABI5和RAB18的表达。因此,ZmBRI1不仅参与了植物的形态建成和BR的信号传导,而且参与调控了植物对ABA信号的响应。     

烟草NtCYP734A1基因的克隆及表达分析

油菜素内酯是一种参与胁迫响应的甾醇类植物激素,CYP734A1基因是油菜素内酯代谢通路上的关键基因。为探索CYP734A1基因在烟草响应非生物胁迫时发挥的功能,本研究以普通烟草品种K326为材料,克隆CYP734A1基因,通过生物信息学技术分析NtCYP734A1蛋白的理化性质及进化关系,运用实时荧光定量法分析CYP734A1基因在不同组织、不同非生物胁迫处理下的基因表达模式。结果表明,CYP734A1基因全长1 638 bp,编码545个氨基酸;亚细胞定位预测NtCYP734A1蛋白存在于内质网。qRT-PCR分析表明,烟草CYP734A1基因在不同组织均有表达,叶中表达量最高,茎中的表达量最低。非生物胁迫处理下,CYP734A1基因在各组织的表达量显著改变,在干旱、盐和低温胁迫下根的CYP734A1基因表达上调;在干旱、盐、高温和低温共4种胁迫下,叶中CYP734A1基因表达下调。     

果实特异启动子调控薄皮甜瓜ACC合成酶反义基因植物表达载体的构建

从成熟的薄皮甜瓜(齐甜1号)果肉组织中提取总DNA,经PCR扩增得到约0.5kb的ACC合成酶基因的片段,将其克隆到质粒载体pMD18-T中,测序表明,该基因为583bp,编码194个氨基酸;从番茄(东农706)叶片组织中提取总DNA,经PCR扩增得到约2.2kb的E8基因片段,将其克隆到质粒载体pGEM-TEasy中,测序表明,该基因为2192bp;以pCAM2301为起始植物表达载体,pCAM-GT为中间载体,成功构建了果实特异启动子(E8)调控薄皮甜瓜ACC合成酶反义基因植物表达载体,采用冻融法将其转入根癌农杆菌LBA4404,得到了完整的Ti质粒表达载体系统。     

草莓细胞工程技术与分子生物学研究进展

从成熟的薄皮甜瓜（齐甜1号）果肉组织中提取总DNA，经PCR扩增得到约0.5kb的ACC合成酶基因的片段，将其克隆到质粒载体pMD18-T中，测序表明，该基因为583bp，编码194个氨基酸；从番茄（东农706）叶片组织中提取总DNA，经PCR扩增得到约2.2kb的E8基因片段，将其克隆到质粒载体pGEM-T Easy中，测序表明，该基因为2192bp； 以pCAM2301为起始植物表达载体，pCAM-GT为中间载体，成功构建了果实特异启动子（E8）调控薄皮甜瓜ACC合成酶反义基因植物表达载体，采用冻融法将其转入根癌农杆菌LBA4404,得到了完整的Ti质粒表达载体系统。     

香樟IDI基因克隆及表达分析

为了克隆香樟异戊烯基焦磷酸异构酶(isopentenyl diphosphate isomerase,IDI)基因,并进行生物信息学分析,为香樟植物萜类化合物的生物合成研究提供基础。本研究以香樟植物为试样,在转录组测序数据的基础上设计引物,应用RT-PCR技术克隆香樟IDI基因,通过实时定量PCR方法检测IDI基因在香樟根、茎和叶中表达量,利用生物信息学方法对IDI基因编码的蛋白进行表征。结果表明,香樟IDI基因长度868 bp,开放读码框(ORF)为708 bp,编码235个氨基酸,编码蛋白的分子量为27.04 kD,等电点为5.13,蛋白的二级序列结构主要为α-螺旋。经预测香樟IDI是一个定位于细胞质,不含信号肽的亲水性稳定蛋白,具有异戊烯基焦磷酸异构酶的特征结构域。系统进化树分析表明,香樟IDI与野生型马来西亚蕉的亲缘关系较近。实时定量PCR结果表明,IDI在香樟茎中的表达量高于根和叶。本研究成功从香樟中克隆了IDI基因并进行了表征分析,为深入研究香樟IDI基因在萜类合成中的功能提供帮助。     

甜瓜PGIP基因的克隆及表达初步分析

以甜瓜叶片基因组DNA为模板,PGIP基因保守序列设计引物,PCR扩增到1条全长978 bp的目的片段。该基因包含有1个完整的开放阅读框,没有内含子,编码326个氨基酸,其编码的氨基酸序列中含有一段典型的亮氨酸重复序列。序列比对表明:该基因编码的氨基酸序列与GenBank中的PGIP基因氨基酸序列(AAP41199)同源性为100%;RT-PCR表达分析表明,该基因在甜瓜叶、茎、根、果实中表达,在花中不表达。为植物分子抗病育种提供了1条基因资源。     

甜瓜CmMYBL基因调控类黄酮合成的功能分析

MYB类转录因子对植物的次生代谢具有重要的调控作用,广泛地参与了类黄酮代谢途径,在植物果实品质调控及抗病性中发挥作用。本研究以甜瓜品种河套蜜瓜(Cucumis melo L. cv Hetao)为试材,对转录组数据中甜瓜果实成熟期高表达的CmMYBL (v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog like gene)(MELONOMICS登录号:MELO3C003633)基因进行了克隆。利用实时荧光定量PCR技术对其在甜瓜果实发育成熟中的表达模式进行了分析,同时构建了基因的超表达及RNAi表达载体,利用子房注射法转化了甜瓜,经PCR及RT-qPCR方法检测,已经分别获得了2个转基因甜瓜株系。定量分析结果显示,该基因随着果实的成熟其表达量逐渐增加,在成熟时达到最大。对T2代转基因果实中类黄酮合成相关基因分析显示,超表达果实中查尔酮合成酶基因CmCHS (Chalcone synthase)、查尔酮异构酶基因CmCHI (Chalcone isomerase)和黄烷酮-3-羟基转移酶基因CmF3H (Flavanone-3-hydroxyltransferase)的表达量显著高于对照果实,而RNAi果实中CmCHS和CmCHI的表达量显著低于对照果实,CmF3H的表达量略低于对照果实。类黄酮含量分析显示,超表达CmMYBL基因的甜瓜果实中类黄酮含量显著增加,而RNAi果实的类黄酮含量相对较低。本研究初步鉴定出CmMYBL基因对甜瓜类黄酮的合成具有促进作用,为甜瓜类黄酮合成调控的研究提供了理论基础,同时为提高甜瓜果实品质的基因工程提供候选基因。     

芸芥中DnaJ同源基因的克隆与表达分析

为研究芸芥自交亲和机理,采用mRNA差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)分析技术,从芸芥自交亲和系开花前柱头中获得1条差异片段。测序及DNA序列的生物信息学分析表明,该差异片段与拟南芥DnaJ蛋白同源基因At J3有较高同源性,暂命名为esAtJ3基因。该序列含有一个长度为297 bp的完整开放阅读框,编码98个氨基酸残基,含有一个DnaJ-C保守结构域,属于植物DnaJ超家族。esAtJ3基因编码的蛋白无信号肽,是一个亲水性蛋白,该蛋白主要由不规则卷曲和α螺旋组成。实时荧光定量PCR分析表明,esAtJ3基因在芸芥SC系开花前柱头中表达量较高,初步推测该基因可能参与芸芥亲和性调控。     

香蕉果实可溶性淀粉合成酶基因MaSSⅢ-1的分子特征与时空表达模式

为弄清香蕉果实可溶性淀粉合成酶基因(MaSSⅢ-1)的分子特征及时空表达模式,以‘巴西蕉’果肉为试材,采用PCR法进行MaSSⅢ-1基因克隆,通过Quantitative real-time PCR (qPCR)和Western blot技术对MaSSⅢ-1基因及其蛋白表达模式进行分析。结果显示:MaSSⅢ-1基因cDNA全长为2397 bp,编码798个氨基酸,包括4个典型的结构域,GenBank登录号为KU757067。MaSSⅢ-1基因在香蕉根、球茎、花和苞片中表达量较低,在叶、果皮和果肉中表达量较高;随着香蕉果实发育,MaSSⅢ-1基因表达量逐渐上升,在抽蕾后50～60天达到最大;随着果实采后成熟,MaSSⅢ-1表达量在采后5天达到最大,随后逐渐下降。在香蕉果实不同发育及采后成熟阶段,MaSSⅢ-1蛋白呈现出与mRNA水平相一致的表达趋势。证明MaSSⅢ-1基因的表达不仅涉及到香蕉果实支链淀粉合成代谢,可能还涉及采后早期果实成熟或者支链淀粉降解。     

BR相关基因在低温调控马铃薯萌芽中的响应分析

油菜素内酯(BR)是调控植物生长发育的重要激素。本项目组研究发现,BR合成和信号转导基因表达量均随马铃薯块茎休眠解除而升高,抑芽剂可明显抑制BR合成相关基因delta24-甾醇还原酶(DWF1)、甲基甾醇单加氧酶(SMO1)、信号转导成员油菜素内酯不敏感蛋白(BRI1)、信号转导激酶(BSK)和信号激活因子细胞周期蛋白(CYCD3)等在马铃薯块茎中的表达。还发现,低温可以显著延长马铃薯‘费乌瑞它’等品种的贮藏时间,而对‘米拉’等品种的作用不显著。为进一步探明BR合成、信号转导和激活基因在低温调控马铃薯萌芽中的响应情况,本试验以休眠中后期的马铃薯‘费乌瑞它’和‘米拉’原原种为材料,采用常温(23±2)℃和低温(4℃)贮藏,利用q RT-PCR技术测定两个品种在萌芽过程中5个BR合成、信号转导及激活关键基因的表达量变化。结果表明,低温下,两个品种中的DWF1、BRI1基因在萌芽过程中的表达量保持在低水平;SMO1、BSK和CYCD3基因的表达量在‘费乌瑞它’的萌芽阶段维持在低水平,而在‘米拉’中的表达量却呈相对较高的水平。由此推测低温通过抑制SMO1、BSK和CYCD3基因在‘费乌瑞它’萌芽过程中的表达,抑制萌芽,而有效延长马铃薯贮藏时间。与低温显著延长该品种贮藏时间、延迟萌芽的效果一致。本研究为阐明马铃薯萌芽过程中BR调控机制及其与环境温度的关系,利用分子技术辅助选育耐贮藏品种,以及为马铃薯贮藏调控新技术研发提供新的依据。     

油菜O-acetylserine (thiol) lyase isoform A(OASTL)基因的克隆及序列分析

植物OASTL蛋白是半胱氨酸生物合成过程中的关键酶,催化半胱氨酸合成的最后一步。克隆低镉积累基因型油菜中OASTL基因,为研究该基因在镉积累过程中的功能提供参考。本研究以镉低积累品种美国‘油王88’幼苗为材料,采用同源克隆法PCR扩增OASTL基因,并对其进行生物信息学分析。克隆得到美国‘油王88’OASTL基因cDNA编码区长为969 bp,编码322个氨基酸;编码蛋白的理论分子量为33.9 kD,理论等电点为5.50,溶液中的不稳定指数为27.45,为稳定蛋白,属于磷酸吡哆醛(PLP)依赖型的β-取代丙氨酸合成酶超家族成员。氨基酸序列聚类分析表明,其与花椰菜和小白菜的相似性最高。亚细胞定位预测分析表明,OASTL蛋白定位于细胞质中,推测OASTL蛋白主要在细胞质中发挥重要作用。OASTL基因的克隆及其结构、性质与功能的初步分析,为油菜抗重金属育种提供理论基础和基因资源。     

沙棘HrCYP85A1基因生物信息及表达分析

沙棘具有重要的生态价值及经济价值,油菜素内酯(BR)对植物抵御非生物胁迫具有响应作用,同时,CYP85A1是参与油菜素内酯合成反应的关键基因。因此,为了解析HrCYP85A1基因在沙棘抵御干旱胁迫中的作用,本研究以中国沙棘为试验材料,利用生物信息学软件对HrCYP85A1基因特点及蛋白结构进行了分析,并且利用荧光定量PCR技术分析了在干旱胁迫下HrCYP85A1基因的表达。结果表明,HrCYP85A1基因具有3个基序(motif),与多个物种的CYP85A1序列具有高度同源性;HrCYP85A1基因编码的蛋白位于质膜位置,且其为亲水性蛋白;HrCYP85A1参与NaCl、PEG与ABA等非生物胁迫的响应,说明其与沙棘多种非生物胁迫密切相关。本研究结果将为今后研究沙棘CYP家族基因功能提供了依据,并为林木抗逆研究及分子育种提供科学依据。     

甜瓜CmERFV-4基因cDNA克隆及特性分析

乙稀应答因子(ethylene-responsive factor,ERF)是乙烯信号通路中的组分之一,通过认别并结合下游功能基因启动子顺式作用元件GCC-box,从而实现对植物发育的调控和逆境胁迫的响应。本研究以甜瓜品种河套蜜瓜为研究材料,从成熟甜瓜果实中克隆得到554 bp的CmERFV-4基因cDNA,基于该cDNA序列,进行了蛋白理化性质、空间结构与系统进化分析。实时荧光定量PCR检测表明,在不同组织检测结果中CmERFV-4基因在子叶中的表达量最高,在不同发育阶段果实检测结果中该基因在授粉后40 d果实中的表达量最高。构建了该基因超表达载体和RNAi载体。     

香蕉果实可溶性淀粉合成酶基因MaSSIII-1的分子特征与时空表达模式

为弄清香蕉果实可溶性淀粉合成酶基因(MaSSIII-1)的分子特征及时空表达模式，以‘巴西蕉’果肉为试材，采用PCR法进行MaSSIII-1基因克隆，通过Quantitative real-time PCR (qPCR)和Western blot技术对MaSSIII-1基因及其蛋白表达模式进行分析。结果显示：MaSSIII-1基因cDNA全长为2397 bp，编码798 个氨基酸，包括4 个典型的结构域，GenBank 登录号为KU757067。MaSSIII-1 基因在香蕉根、球茎、花和苞片中表达量较低，在叶、果皮和果肉中表达量较高；随着香蕉果实发育，MaSSIII-1 基因表达量逐渐上升，在抽蕾后50~60 天达到最大；随着果实采后成熟，MaSSIII-1 表达量在采后5 天达到最大，随后逐渐下降。在香蕉果实不同发育及采后成熟阶段，MaSSIII-1 蛋白呈现出与mRNA水平相一致的表达趋势。证明MaSSIII-1 基因的表达不仅涉及到香蕉果实支链淀粉合成代谢，可能还涉及采后早期果实成熟或者支链淀粉降解。     

苦瓜转录因子McEIL2的克隆及其表达分析

本研究从已构建的苦瓜果实均一化文库筛选得到一个EIN3-like同源EST序列,结合RACE技术,克隆得到EIN3基因c DNA全长序列,命名为Mc EIL2(Gen Bank登录号:KF595122)。该基因全长2 122 bp,开放阅读框1 890 bp,编码629个氨基酸,预测该蛋白的分子量为71.58 k D,与黄瓜Cus EIN3、甜瓜Cm EIL1、苜蓿Mt EIL1、绿豆Vr EIL1和番茄Le EIL1的蛋白同源性分别为89.61%、78.37%、71.23%、69.09%和65.66%。Mc EIL2基因的编码蛋白亚细胞定位于细胞核,荧光定量分析表明Mc EIL2基因表达量在幼果期先强后弱,绿熟期最低,破色期表达量大幅增加至最高随后下降,推测该基因参与苦瓜果实成熟软化调控过程。本研究初步明确了Mc EIL2基因在苦瓜成熟过程表达模式,可为今后进一步揭示苦瓜果实成熟软化的分子机制奠定基础。     

甜瓜蛋白激酶类基因CmPKC的克隆及原核表达载体的构建

根据已知的甜瓜蛋白激酶类基因CmPKC的部分序列,设计带有酶切位点的引物,采用RT-PCR方法获得该基因的完整cDNA序列,并对其蛋白进行功能预测和理化性质分析;采用实时荧光定量PCR分析不同白粉病抗性材料、不同处理时间点该基因的表达量变化情况;将该基因完整的ORF连接到原核表达载体p EASY-E1上,转化大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3),通过不同浓度IPTG诱导表达,获得适宜的诱导表达体系,SDS-PAGE检测表达产物。结果表明克隆获得的CmPKC基因长约为2 830 bp,开放阅读框为2 493 bp,编码831个氨基酸。生物信息学预测该蛋白的跨膜区域有4个信号肽;在甜瓜白粉病不同抗性材料上相对表达量变化趋势不同,在抗性材料上表达丰度出现的时间较感病材料早,且在不同材料上相对表达量变化趋势与已报道的一个甜瓜感病相关MLO家族基因一致,推测我们所获得的基因也可能与感病及开花、生长发育基因相关,且属于早期应答基因。该蛋白适宜的诱导体系是100 mg/m L IPTG诱导4 h,原核表达产物与预期大小一致,表明该基因能够成功表达,为深入探索该基因的功能提供了研究依据。     

黄瓜ζ-胡萝卜素脱氢酶基因克隆及表达分析

以西双版纳黄瓜为试材,从黄瓜果肉中克隆ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)基因的cDNA序列,命名为CsZds。获得目的片段长度为1805bp,该序列具有完整的开放阅读框,位于31~1761bp,编码576个氨基酸。序列比对分析结果显示,该蛋白在氨基端变化十分明显,中部较为保守,存在一个特征序列。系统进化分析表明,推测的CsZDS蛋白与南瓜中ZDS蛋白同源性最高,达到91.84%。利用实时荧光定量PCR技术分析结果显示,随着果实成熟期的延长,西双版纳黄瓜CsZds基因的表达量呈明显上升的趋势,在转色期达到最大。在果实发育过程中,西双版纳黄瓜CsZds基因的表达量高于普通黄瓜。     

油菜B-box型锌指蛋白基因BnSTO的克隆和表达

B-box型锌指蛋白参与植物多种生长发育和非生物逆境胁迫响应过程。笔者通过RT-PCR克隆得到甘蓝型油菜2个B-box型锌指蛋白基因Bn STO-1和Bn STO-2。Bn STO-1的ORF长度为723 bp,推测编码240个氨基酸,定位于A8染色体。Bn STO-2的ORF长度为726 bp,推测编码241个氨基酸,定位于C8染色体。2个基因均由3个外显子和2个内含子构成,在氨基酸水平上的相似性达到了96.68%。系统进化分析表明Bn STO与拟南芥At STO的亲缘关系较近,同源性较高。荧光实时定量PCR结果表明Bn STO在检测的各个组织中均有表达,其中叶和蕾中的表达量最高;高盐、干旱和高温能显著诱导Bn STO-1和Bn STO-2的表达,但出现峰值的时间不同,推测2个基因均可能参与了油菜的非生物逆境胁迫响应。