中间锦鸡儿CibHLH93基因克隆及表达分析

b HLH属于转录调控因子中的一个大家族,广泛存在于真核生物界,因具有保守性较高的b HLH结构域而得名。b HLH以二聚体形式特异性结合于DNA靶位点,调控多样化的生物过程,对真核生物的生长发育和次生代谢必不可少。植物中,b HLH转录因子通过与其他转录因子互作激活胁迫基因的表达,从而使植物免受非生物胁迫带来的伤害。本研究从实验室干旱转录组数据库中,得到一条中间锦鸡儿b HLH基因全长序列。序列分析显示该基因的开放阅读框为999 bp,编码332个氨基酸。比对分析结果发现其推导的氨基酸序列具有b HLH保守结构域,与拟南芥b HLH93蛋白一致性为68%,将其命名为Cib HLH93。实时荧光定量PCR结果显示,Cib HLH93受到Na Cl、冷、热和脱水的诱导,表达量随处理时间延长呈下降趋势,推测该基因在响应非生物胁迫过程中是一个下调基因。拟南芥叶肉原生质体瞬时表达实验表明,Cib HLH93主要定位于细胞核。以上结果,为进一步揭示Cib HLH93功能的研究提供了基础。     

谷子转录因子基因SiNAC45在拟南芥中对低钾及ABA的响应

NAC(nascent polypeptide-associated complex)转录因子在植物生长发育和非生物胁迫响应等过程中发挥重要的调控作用,目前,关于NAC转录因子参与耐低钾胁迫的研究报道很少。本研究在前期工作对低钾胁迫的转录组测序基础上,对筛选出的一个低钾胁迫下表达量上调的NAC类转录因子基因SiNAC45进行了深入研究。结果表明,SiNAC45基因全长1383 bp,编码461个氨基酸,分子量为50.7 k D,等电点为6.92。SiNAC45在20~100个氨基酸之间有一段NAM保守结构域。系统进化树结果显示,SiNAC45位于NAC基因家族的第1亚族。基因表达谱分析显示,SiNAC45主要在谷子根部表达,并且能够被低钾和ABA诱导表达。亚细胞定位结果显示SiNAC45定位于细胞核。基因功能分析结果显示,在不同浓度低钾处理下,和野生型拟南芥相比,SiNAC45转基因拟南芥的根长和植株鲜重显著增加,说明过表达SiNAC45可以提高转基因植物对低钾胁迫的抗性。下游基因表达分析结果显示,在SiNAC45转基因植物中两种重要的钾离子转运体基因AKT1和HAK1的表达显著提高,证明SiNAC45通过调控植物钾离子转运体基因的表达影响植物对低钾胁迫的耐性。种子萌发试验结果显示,SiNAC45转基因拟南芥与野生型拟南芥相比对ABA的敏感性降低,说明SiNAC45可能负调ABA信号。     

毛竹PheNAC1基因负调控拟南芥对盐胁迫的耐受性

NAC (NAM, ATAF和CUC)转录因子在植物生长发育、衰老及抵御非生物胁迫等过程中具有重要的作用。为探究NAC基因在毛竹(Phyllostachys edulis)生长发育过程中的功能和响应环境胁迫的分子机制,本研究以毛竹为材料,克隆获得PheNAC1基因的全长CDS序列,并对其序列和表达模式进行分析。结果表明,PheNAC1基因编码区为954 bp,编码318个氨基酸。同源性分析表明,PheNAC1与水稻的OMTN3具有较近的亲缘关系(序列相似性为82.28%)。亚细胞定位结果预测PheNAC1定位在细胞核,转录激活活性分析显示其不具有转录激活活性。PheNAC1基因的启动子区含有胁迫响应元件,如：脱落酸(abscisic acid, ABA)有关的脱水胁迫元件(STRE)、厌氧诱导相关元件(ARE)等,表明其可能参与毛竹的胁迫响应。组织特异性表达分析显示,PheNAC1在毛竹叶中表达丰度最高,根和茎中次之;在成熟叶和衰老叶片中的表达显著高于幼叶。在干旱胁迫和盐胁迫后,分别在1和3 h显著上调表达。在笋采后衰老过程中显著上调表达。过表达PheNAC1基因的拟南芥对盐胁迫的耐受...     

番茄SlNAC71基因克隆及表达分析

NAC转录因子在植物逆境应答中具有重要的作用。本研究从番茄中克隆了一个NAC基因Sl NAC71。该基因编码区长1 059 bp,编码352个氨基酸,预测分子量约为39.51 k D,等电点为8.40。推测的氨基酸序列中含有1个高度保守的NAM结构域。Sl NAC71基因序列具有mi R164靶序列识别位点。亚细胞定位预测Sl NAC71蛋白定位于细胞核。进化树分析发现,Sl NAC71和At NAC分为一个分支。组织特异性表达模式分析表明在检测的所有组织中Sl NAC71都有表达,在叶中表达量最高,在茎中表达量最低。Sl NAC71基因的表达受高盐诱导,说明番茄Sl NAC71基因可能参与番茄对高盐胁迫的应答。     

玉米ZmNACx基因克隆及表达分析

NAC转录因子在植物发育和逆境应答中具有重要的作用。本研究从玉米中克隆了一个NAC基因ZmNACx。该基因开放阅读框长900 bp,编码299个氨基酸,预测分子量约为33.539 k D,等电点为8.18。推测的氨基酸序列中含有1个高度保守的NAM结构域。亚细胞定位预测ZmNACx蛋白定位于细胞核。进化树分析发现,ZmNACx和Os NAC1分为一个分支。组织特异性表达模式分析表明在检测的所有组织中ZmNACx都有表达,在根中表达量最高,在叶中表达量最低。ZmNACx基因的表达受干旱诱导,说明玉米ZmNACx基因可能参与玉米对干旱胁迫的应答。     

辣椒转录因子CaNAC23基因的克隆与表达分析

为分析NAC转录因子在辣椒发育及非生物胁迫中的功能,本研究以‘晋尖椒22’为试验材料,克隆获得CaNAC23基因全长,该基因全长1 899 bp,编码632个氨基酸,预测分子量约为72.54 kD,等电点为6.26,无序化区域有7个。二级结构预测和亚细胞定位预测表明CaNAC23含有一个保守的NAC结构域,定位于细胞核。氨基酸序列比对和进化树分析表明CaNAC23和拟南芥AT3G03200 (NAC045)同源性较高,进化上在同一分支。CaNAC23基因的组织表达特异性和非生物胁迫下的表达模式结果表明:CaNAC23在叶片中表达量最高,其次是根,暗示CaNAC23基因可能参与辣椒叶片或根发育相关。CaNAC23能够被干旱和盐胁迫诱导表达,推测其参与调控辣椒的非生物胁迫调控。本研究结果为研究NAC转录因子在辣椒发育及非生物胁迫应答中的功能提供了参考依据。     

野生大豆转录因子GsNAC20基因的分离及胁迫耐性分析

NAC (NAM, ATAF1/2, CUC2)转录因子作为一类新型转录因子已成为非生物胁迫基因工程领域的研究热点。本研究以野生大豆(Glycine soja)为材料,利用酵母单杂交的方法筛选到一个能够与MYB1AT元件(核心序列为AAACCA)结合的转录因子基因,该基因与大豆NAC20 (EU440353.1)基因具有99%的相似性,命名为GsNAC20。GsNAC20蛋白含有典型的NAC结构域和转录激活区。酵母试验表明,GsNAC20转录因子能够与耐逆相关顺式元件MYB1AT特异结合,但不具有自激活功能。细胞定位分析证明该基因位于细胞核中,符合转录因子的特征。GsNAC20能够响应高盐、干旱和低温胁迫,并且在根和叶中具有不同的表达模式。超量表达GsNAC20基因的拟南芥对盐胁迫的敏感性提高。以上结果表明GsNAC20参与植物非生物胁迫反应过程,该基因在非生物胁迫基因工程研究领域具有良好的理论研究和实际应用价值。     

中间锦鸡儿CiMYB185基因克隆及表达分析

为进一步了解植物抗逆境胁迫的机理,本研究以中间锦鸡儿为试验材料,从实验室已建立的转录组数据库中选取转录因子CiMYB185编码基因作为研究对象。利用PCR技术分别以cDNA与g DNA为模板对CiMYB185基因进行全长克隆。测序结果表明:CiMYB185基因的开放阅读框为909 bp,编码303个氨基酸,其基因组DNA序列长度为1 592 bp,含有1个内含子和2个外显子。序列分析发现该基因所编码蛋白的N端包含2个MYB结构域,属于典型的R2R3-MYB类蛋白;利用染色体步移技术克隆得到908 bp的ATG上游启动子序列,序列中包含一些与光反应和激素相关的元件。该研究为进一步了解植物抗逆境胁迫的机理奠定了基础。     

红麻非生物逆境胁迫响应基因HCWRKY71表达分析及转化拟南芥

WRKY转录因子在植物响应非生物逆境胁迫过程中具有重要的调控作用。本研究根据红麻转录组unigene序列(CL3883.Contig4),设计引物进行PCR扩增,经sanger测序获得全长为957 bp的HcWRKY71基因cDNA序列。该基因开放读码框为957 bp,编码1个含有318个氨基酸的蛋白,具有1个WRKY功能保守结构域,属于II类WRKY转录因子。在盐胁迫下,HcWRKY71基因表达量随NaCl溶液浓度升高而增加;在干旱胁迫下,HcWRKY71基因表达量随干旱胁迫时间的增加呈现先下降再上升然后再下降的趋势;在重金属镉胁迫下,HcWRKY71基因表达量随CdCl2溶液浓度的增加而降低。表明该基因表达受盐、干旱和重金属镉胁迫的诱导。利用农杆菌介导花序浸染法将该基因转化拟南芥发现,HcWRKY71基因提高了转基因拟南芥幼苗的耐盐性,这为进一步研究HcWRKY71基因的耐逆机制奠定了坚实的基础。     

拟南芥转录因子NAC103在内质网胁迫应答中的抗性分析

环境胁迫是影响粮食产量和品质的重要因素,在内质网胁迫条件下构建植物基因调控网络有利于粮食增产。为了分析拟南芥内质网胁迫应答过程中转录因子NAC103的生物学功能,本研究利用RNAi技术筛选到NAC103低量表达植株,并利用之前发表过的NAC103过量表达植株,发现低量和过量表达NAC103的转基因植株在内质网胁迫应答中具有不同的表现型。我们统计分析了含有真叶植株、只有子叶植株和没有子叶植株的百分率,结果表明:与野生型拟南芥相比,过量表达NAC103转基因植株对内质网胁迫的耐受性更高,而低量表达NAC103转基因植物对内质网胁迫更敏感。因此,拟南芥转录因子NAC103在抵御内质网胁迫的抗性应答中具有重要作用。     

基于油橄榄全基因组参与水胁迫NAC基因的鉴定及表达分析

本研究以干旱和水淹胁迫中的‘佛奥’和‘TYZ-1号’2个油橄榄品种苗木为试材,基于油橄榄全基因组数据,鉴定出36个油橄榄NAC转录因子家族成员,利用生物信息学软件进行结构及功能预测,将油橄榄OeNAC蛋白与模式植物拟南芥AtNAC蛋白构建进化树。结果表明OeNAC转录因子分为两个大类和14个亚家族,14个亚家族中有13个亚族同时包含了油橄榄和拟南芥NAC蛋白,说明拟南芥和油橄榄的NAC家族在进化水平上有一定的相似性。结合油橄榄水分胁迫(干旱,水淹)基因表达谱,分析出8个NAC转录因子(OeNAC31, OeNAC33, Oe NAC25, Oe NAC30, OeNAC7, OeNAC23, OeNAC20, OeNAC1)在‘佛奥’和‘TYZ-1号’中均呈现高表达且对水分胁迫均有响应,推测这8个基因是油橄榄水分调节的主要基因。将在水分胁迫下具有表达量的Oe NAC蛋白与已知水分胁迫相关的NAC转录因子构建进化树发现8个胁迫相关的转录因子中的Oe NAC31与已知的水分调控因子支持率更高,表明OeNAC31转录因子可能是参与油橄榄水分调控的最主要基因,其在两个品种中都有不同的表达量,这...     

大豆中一个WRKY28-like基因的克隆与功能分析

WRKY转录因子参与调节植物生长发育、生物与非生物胁迫应答等多种过程,AtWRKY28是拟南芥中与抗病和耐逆相关的重要转录因子。为探讨大豆中一个AtWRKY28同源基因GmWRKY28-like(Glyma.14G028900)的生物学功能,本文对该基因进行了克隆、生物信息学分析、亚细胞定位、组织表达等试验,并对其在ABA、PEG、NaCl胁迫下的表达水平进行了分析。结果显示,GmWRKY28-like基因的编码区(CDS)为1008bp,编码335个氨基酸。GmWRKY28-like蛋白具有保守的WRKY结构域,含有22个丝氨酸(Serine)、1个苏氨酸(Threonine)、2个酪氨酸(Tyrosine),不含跨膜结构与信号肽;进化树分析表明大豆GmWRKY28-like与菜豆(Phaseolus vulgaris)WRKY28的相似性最高;亚细胞定位显示GmWRKY28-like定位在细胞核中。该基因在根、种子中表达量很低,在真叶、花、及茎尖分生组织表达量较高。GmWRKY28-like启动子中含有多种与生物和非生物逆境胁迫应答相关的元件,如MBS、W-box、ABRE、Box-W1等,且表达受到ABA、PEG、NaCl的诱导。此外,过表达GmWRKY28-like显著增强了拟南芥的耐盐性。     

黄瓜CsWRKY23基因的生物信息学及表达分析

WRKY转录因子是植物中广泛存在的一种转录因子,参与植物的生物胁迫与非生物胁迫。采用RTPCR克隆黄瓜CsWRKY23基因cDNA序列,对序列进行结构域、基因结构分析,构建系统发育树,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析该基因在黄瓜根、叶组织中的表达。结果表明:CsWRKY23的cDNA开放读码框全长1 431bp,含有5个外显子,4个内含子;编码476个氨基酸,含有两个WRKY结构域,编码蛋白的分子量为52.2kDa、等电点为6.43;系统发育分析表明CsWRKY23与拟南芥AtWRKY33同源。qRTPCR结果表明该基因响应低温胁迫,并在根、叶组织中的表达均上调。本研究为进一步鉴定该基因在非生物胁迫的功能奠定了基础。     

贡菊CmNAC78的克隆及启动子元件分析

NAC是植物中特有的一类转录因子,对植物生长发育和抵御非生物胁迫起着重要的作用。本试验以贡菊为材料,克隆CmNA C78基因,其最大开放阅读框(ORF)为1 641 bp,编码547个氨基酸,包含A、B、C、D、E五个结构域;CmNA C78分子量为1 354.64 kD,理论等电点为5.01,不稳定系数为38.37,平均亲水性0.649,脂肪系数为27.24,亚细胞定位预测CmNA C78定位在细胞核内。进化树分析表明,贡菊CmNA C78属于NAC2亚家族,与拟南芥ANAC78亲缘关系较近;采用染色体步移试剂盒方法,克隆了CmNA C78启动子序列2 034 bp,启动子序列中包括茉莉酸甲酯、组织器官发育和低温响应元件等;荧光定量PCR分析不同花期CmNA C78、CmFNS和CmTTG1的相对表达量,结果表明在花蕾期时CmNA C78、CmFNS和CmTTG1表达量最高,其次为初花期。这些研究结果为后续在菊花中CmNA C78的调控机制研究提供参考。     

大豆GmNAC23基因的克隆及特征分析

NAC是一类植物特异性转录因子,其在调节非生物和生物胁迫的发育和响应中起重要作用。为了探索大豆相关基因的功能,利用PCR的方法从大豆中克隆了1个NAC基因GmNAC23。该基因c DNA全长1 077 bp,开放阅读框长1 053 bp,编码350个氨基酸,蛋白质分子量为39. 483 ku,等电点为7. 08。序列分析表明,GmNAC23基因组包含3个外显子和2个内含子。多序列比对结果表明,GmNAC23蛋白含有1个高度保守的NAM结构域。进化树分析表明,该蛋白与绿豆、木豆、鹰嘴豆的NAC蛋白具有同源关系。转录活性分析结果表明,GmNAC23在SD (Trp-/His-/Ade-)营养型缺陷培养基上生长,说明该基因在酵母体内具有转录激活功能。组织特异性表达模式分析表明,在检测的所有组织中GmNAC23都有表达,在根中表达量最高,在茎顶端分生组织中表达量最低。结果表明,大豆GmNAC23基因具有转录激活功能,并且其在根中大量表达。为进一步研究GmNAC23的生物学功能奠定了基础。     

梭梭HaNAC2基因克隆、表达分析及亚细胞定位

本研究从梭梭中克隆得到1个NAC转录因子,命名为HaNAC2。同源性比对分析结果显示该基因含有典型的NAC蛋白结构域。系统发育分析结果推测该蛋白属于NAC家族第Ⅰ组的SENU5亚家族,组织特异性分析结果表明该基因在梭梭同化枝中表达量最高,荧光定量PCR结果显示该基因的表达量随干旱胁迫时间的增加而升高,推测其表达受干旱胁迫诱导。本研究克隆了该基因的启动子并进行分析,结果发现HaNAC2基因的启动子含有启动子固有元件,如TATA-box,CAAT-box等,还含有一些调控元件如MYB结合位点、组织特异性表达响应元件、光响应元件和一些其他的调控序列。通过PEG介导的原生质体转化法进行亚细胞定位分析,结果显示该蛋白定位于细胞核。本研究初步探索了HaNAC2基因的表达及定位,为进一步研究该基因在梭梭抗旱中的功能打下基础。     

柽柳GRAS转录因子基因启动子克隆和表达分析

克隆获得柽柳GRAS 转录因子基因启动子序列,并对其表达模式进行分析,从而初步探究GRAS转录因子基因的表达特征和功能。CTAB法提取刚毛柽柳基因组DNA,按照Genome Walking Kit 说明克隆GRAS 转录因子基因启动子序列,将克隆获得的GRAS 转录因子基因启动子序列定向替换pCAMB1301 载体上的35S启动子序列,构建融合表达载体,以驱动GUS 基因表达,瞬时侵染拟南芥后进行GUS 基因的染色。成功克隆获得刚毛柽柳936 bp 的GRAS 转录因子基因启动子序列。PLACE 和PlantCARE 数据库分析结果表明该启动子不仅包含启动子区的核心元件CAAT-box 和TATA-box,还含有多个与逆境应答有关的顺式调控元件。成功将GRAS 基因启动子序列定向置换pCAMBIA1301 的35S 启动子,构建重组载体PGRAS::GUS。瞬时转化拟南芥后GUS 染色,结果显示转基因拟南芥叶片被染色而根部着色较浅。初步表明克隆获得的GRAS 基因启动子具有启动子表达活性,其可能参与了柽柳的抗逆应答,为进一步分析该基因的抗逆功能和抗逆机制奠定了基础。     

蓝莓VcMYB启动子克隆及其功能初步分析

为探究VcMYB启动子在转录过程中如何发挥调控作用,利用FPNI-PCR法从蓝莓中克隆到调控原花青素合成相关的转录因子VcMYB的768 bp启动子序列。用PLACE和Plant CARE在线启动子预测工具分析了该启动子,结果表明其序列中存在启动子的基本元件CAAT-box和TATA-box,还包含一系列的响应元件,如光响应元件、低温响应元件、防御与胁迫响应元件和茉莉酸甲酯响应元件等。为进一步分析该启动子的功能,构建了该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体VcMYBpro::GUS,并用农杆菌转化拟南芥。对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色分析,结果表明该VcMYB启动子能驱动GUS基因在转基因拟南芥中表达,并且经脱落酸(ABA)、4℃低温、LED光照和持续光照处理后,转基因拟南芥中GUS的表达活性增强,推测该基因受ABA、低温和光的调控。     

巴西橡胶树NAC转录因子HbNAC1基因的克隆及生物信息学分析

为了研究植物特有的NAC(NAM,ATAF1/2和CUC2)转录因子在巴西橡胶树生长发育、胁迫应答和激素调节中的功能,对巴西橡胶树NAC转录因子进行了克隆和分析。根据橡胶树胶乳cDNA文库中筛选到的NAC EST序列,利用RACE-PCR技术克隆了橡胶树HbNAC1的cDNA序列。生物信息学分析显示HbNAC1基因开放阅读框(ORF)为891 bp,编码了一个296个氨基酸组成的中性不稳定水溶性蛋白,该蛋白的N-端具有保守的NAC结构域,C-端高度变异,具备了NAC转录因子的基本特征。HbNAC1定位在细胞核中,具有3个糖基化位点和21个磷酸化位点,三级结构由3个α-螺旋和9个β-折叠组成。序列比对和系统进化分析显示HbNAC1蛋白属于NAC转录因子家族中的ANAC011亚族,推测其可能作为一种氨基酸合成相关的调节酶参与调控植物的免疫反应。     

马铃薯StNAC72基因克隆及表达分析

NAC转录因子在应答非生物胁迫中具有重要的调节作用。本研究以宁薯4号叶为材料,应用RT-PCR技术从已建立的转录组测序数据库中获得了马铃薯StNAC72基因全长序列,对其序列特征进行生物信息学分析;并应用real-time PCR技术分析了干旱和干旱后复水处理下根、匍匐茎和叶中该基因的时空表达特征。结果表明,StNAC72基因开放阅读框长1 074 bp,编码357个氨基酸,含有典型的NAM结构域。进化树聚类分析显示,该基因与拟南芥AtNAC072/RD26亲缘关系最近,属于NAC蛋白的SNAC(stressassociated NAC)组成员。转录水平表达分析显示,StNAC72基因表达量存在组织表达差异;干旱处理致使匍匐茎和叶中StNAC72均表现出上调表达模式,干旱处理后匍匐茎中StNAC72表达量较无处理的匍匐茎中上调近10倍;根中该基因对胁迫应答变化不明显,但表达量相较对照根中上调近1倍。干旱后复水处理促使StNAC72表达量下调,且以匍匐茎中该基因对胁迫应答最为显著,说明该基因可能参与干旱及水分刺激信号传导过程。研究结果为应用StNAC72改良马铃薯抗逆能力提供了基础理论数据。