桑细菌性疫病菌[Pseudomonas syringae pv.mori(Boyer and lambert)Young et al]的冰核活性研究

对不同桑园桑疫病菌(Pseudomonas syringae pv.mori(Boyer andlambert)Young et al)菌株的冰核活性测定表明,冰核活性细菌占17.8%.冰核活性菌不能利用山梨醇,但能产生硫化氢;而无冰核活性菌株则相反.     

1株高冰核活性细菌的分离与鉴定

从发生冻害的植物组织中分离到1株冰核细菌MB03,该菌株在-3℃时在2 min内的冻结率达到96.5%,而产生1个冰核所需要的细胞数约为2.9×103个,其冰核活性明显高于冰核细菌标准菌株和其它分离菌株.进一步对MB03进行了鉴定,经个体形态与培养特征观测、部分生理生化反应、G C摩尔分数测定、16SrDNA序列对比分析、菌落原位杂交探测特异性基因和PCR扩增冰核基因等鉴定,确定该菌为丁香假单胞菌(P5eudomonas syringae).     

冰核细菌Erwinia ananas 110 冰核基因iceA的原核表达及冰核活性分析

为获得具有高冰核活性的基因工程菌,从冰核细菌Erwinia ananas 110扩增冰核基因iceA,将其克隆到pMD19–T载体上,转化大肠杆菌DH5α,单、双酶切鉴定并测序;阳性克隆目的片段亚克隆到表达载体pET–23a(+)上,转化大肠杆菌DH5α,单、双酶切鉴定重组质粒;阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,并经IPTG诱导表达。SDS–PAGE电泳检测表明,冰核基因iceA能够并以包涵体形式表达,相对分子质量约为180 000。冰核活性测定结果表明,重组菌BL21(DE3)pLysS/pET–ice的冰核活性与野生冰核细菌Erwinia ananas 110在–5、–4、–3、–2 ℃下无明显差别。     

我国生物冰核研究进展

我国从1986年起开展了冰核活性细菌的研究,已取得一定的进展。查明了我国冰核细菌种类、分布规律、冰核活性强弱程度,明确了影响冰核细菌冰核活性的某些因素和提出了菌种保存方法;验证了冰核细菌是诱发和加重植物霜冻的重要因素,研究揭示冰核细菌、低温强度和植物霜冻害三者的关系,并进行了药剂和生物防霜新技术研究;利用冰核细菌研制成功了冰蛋白降水催化剂,开展了促冻杀虫、克隆了编码冰蛋白的冰核活性基因及有关冰核细菌分子生物学应用技术研究;首次报道了大麦黄矮病毒冰核活性,对揭示未知生物冰核种类有一定意义。     

利用转座子Tn5诱变冰核细菌获得无冰核活性菌株

 以云南省冰核细菌的优势种类丁香假单胞菌Pseudomonas syringae和菠萝泛菌Pantoea ananas为重组基因工程菌的受体菌,采用Tn5转座子诱变技术,以大肠杆菌Escherichia coli S17／pZJ25∶∶Tn5作为转座子诱变的供体菌,使Tn5插入并整合到冰核细菌基因组中,使冰核基因的线性连续性被破坏,失去冰核活性。大量筛选接合子,获得157株丧失冰核活性的菌株。     

冰核活性细菌的分子生物学及防霜技术的研究进展

 从冰核活性细菌的分子生物学基础上,研究冰核细菌的基因遗传背景。并提出了冰核细菌的研究方法,防霜新技术的开发应用及冰核细菌在不同领域的应用等方面阐述冰核活性细菌的研究进展。     

冰核细菌对液体食品过冷却点的影响

 于 2 2℃下在KB培养基上培养冰核活性细菌 (Xanthomonascampestris菌株XcIN 1) ,对数生长期离心获得的细胞冰核活性最强。该细胞在 - 3℃时能够起到冰核的作用使纯水结冰。把冰核细菌与液体食品 (如蔗糖、蛋清、牛奶、番茄汁、苹果汁、橘汁、梨汁、酱油、豆酱和食醋 )混合 ,观察其对过冷却点的影响。结果是 ,加入冰核菌使液体食品的过冷却点提高了 0 .3～ 3.7℃ ,表明在冷冻食品工业中应用细菌冰核可以节约能源并提高效率     

冰核细菌的定量分离研究

 冰核细菌可能是自然界中诱发和加重霜冻敏感植物发生霜冻害的重要原因之一。由于单个的冰核细菌细胞并不具有冰核活性,因此,研究植物上冰核细菌的种群数量或密度是研究冰核细菌与植物霜冻害关系的关键。从云南省的元江、寻甸、河口、呈贡、临沧、陆良、宣威、曲靖、富民、昆明市官渡区及越南老街等地采集到108种植物共166个标样中,有45个标样分离共到71株冰核细菌,标样中冰核细菌的检出率为27.1％,最低密度为6.0×10⁴ CFU/g,最高密度为5.12×10⁹ CFU/g。其余121个标样经再次分离未检测冰核细菌,占总标样数的72.9％。在云南植物上,用稀释平板法可检测冰核细菌的最低密度为2.0×10⁴ CFU／g.     

冰核活性细菌研究进展及其在防霜技术中的应用

冰核细菌是诱发和加重植物霜冻的重要因子,通过减少和控制冰核细菌,在霜冻防治研究方面取得了一定效果．细菌冰核是一类蛋白质,称冰蛋白,由细菌冰核基因编码,据报道已有11种冰核细菌的冰核基因被克隆并在大肠杆菌中得到表达．综述了冰核细菌生物学及分子生物学特性,以及冰核细菌在防霜技术中的应用,阐述了冰核细菌的种类、影响冰核活性的成冰因素及冰核细菌和霜冻害的关系．药剂和生防菌能够防除植物上的冰核细菌．减轻或控制霜冻危害,是防御植物霜冻的一条新途径．     

茶树上冰核活性细菌的分离、鉴定及防治

霜冻发生时从茶树上分离到1株冰核活性细菌,该菌株在﹣5℃下在2 min内冻滴率达到85%,一个冰核产生需要的细胞数约为5.4×103个,该菌株具有明显冰核活性。对该菌株进行16S rDNA序列对比分析,判断该菌株为萎蔫短小杆菌(Curtobacterium flaccumfaciens)。在-5℃条件下,药剂防治效率顺序为:次氯酸钙>Tween80>藏红>亚甲蓝。在同一生态条件下的土壤中分离出1株拮抗菌,经鉴定该菌株为黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)。     

冰核活性真菌的分离与鉴定

 1997～1998年,从蚕豆等植物霜冻害标本中分离到了12株具有冰核活性的真菌,在-5.5℃下具有较强的冰核活性.室温下保存1年转入冰箱中保存半年的菌丝体培养液仍保持原有的强烈成冰核活性,表明其成冰核活性物质与冰核活性细菌有所不同.经鉴定,这12株冰核活性真菌均为燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum Sac.),这是国内有关冰核活性真菌研究的首次报道.     

云南植物上冰核细菌的种类与分布

 1990～1997年,从云南省24个县市的54种植物上分离到了197株冰核细菌,并进行了鉴定.其中菠萝欧文氏菌83株,占42.1%,草生欧文氏菌9株,占4.6%,流黑欧文氏菌3株,占1.5%,边缘假单胞菌10株,占5.0%,丁香假单胞菌71株,占36.0%,菜豆荚斑假单胞菌19株,占9.6%,草莓黄单胞菌1株,占0.5%,野油菜黄单胞菌1株,占0.5%.冰核细菌的种群和生态学在云南省植物上呈丰富的多样性.云南省植物上冰核活性细菌的优势种类是菠萝欧文氏菌,其次是丁香假单胞菌类.     

云南诱发霜冻害冰核活性细菌的鉴定

 1990年冬,从云南省宾川、大理、昆明、陆良等地采集受霜冻危害小麦、蚕豆、蕃茄上的33个标样,分离出12个冰核活性的细菌菌株.鉴定结果是Erwinia herbicola waranaanas及Pseudomonas syrindae.首次证明云南有冰核活性细菌.     

冰核细菌的研究方法

 简单回顾了冰核细菌研究的历史,根据我们多年来的研究工作经验,详细介绍了冰核细菌研究的基本方法和简单实用的试验研究经验,包括样品的采集、分离及冰核活性的测定等。     

小春作物上冰核细菌种群动态研究

 采用平板稀释分离计数法,在小春作物蚕豆、小麦和油菜生长期间,连续两年定点定期对冰核细菌种群数量动态变化进行检测。结果表明,在云南省昆明地区自然条件下,冰核细菌的数量最大密度出现在2月中旬至3月中旬,可达9.2×10⁹ CFU／g。     

冰核细菌的研究、应用现状和前景

冰核细菌是诱发和加重植物霜冻的重要因子,通过减少和控制冰核细菌,在进行霜冻防治研究方面,取得了一定效果.目前世界上已发现4个属23个种或变种的细菌具有成冰活性.细菌冰核是一类蛋白质,称冰蛋白,由细菌冰核基因编码,报道已有11种冰核细菌的冰核基因被克隆并在大肠杆菌中得到表达.综述了冰核细菌生物学及分子生物学特性,以及冰核细菌在霜冻防除、人工降雨、食品冷藏保鲜、高敏检测和促冻杀虫等方面的研究进展和应用前景.     

Species of Ice Nucleation Active Bacteria on the Apricot and the Relationship Between Their Activity and Flower Frost

During 1996- 1997, sixty samples were collected from apricot in Hebei Province, from which nineteen ice nucleation active bacterial strains were isolated. Nine stains were identified as Pseudomonas syringae pv. syringae by bacteriological determination, while the others were Erwinia uredovora. Assay of ice nucleation activity (INA) showed the activity of the Pseudomonas strains was higher than that of the Erwinia.According to the number of bacterial cells required to produce one ice nucleus active at - 3℃, four stains was classified as strong ones, three as medium-strong, the remainder as weak. In general, the INA of these strains were regarded as medium-strong. Under stress of Iow temperatures, treatment of INA bacteria can greatly raised relative electric conductivity of petals and permeability of cell membrane. The treated petals showed symptoms of serious frost at - 3 - - 4℃ and had supercooling points of 2 - 3℃ higher than controls. Our results demon strated that INA bacteria are one major factor to incite frost damage to apricot flowers. We may reduce frost injury to apricot during flowering phage through control of INA bacteria.     

植物抗霜剂减轻蚕豆霜冻害的研究

 从10种供试药剂中筛选出1号、3号、4号、5号、10号等5种抗霜剂,用于防除INA细菌,减轻蚕豆霜冻,效果稳定。在此基础上开发的农大防霜剂5号,防霜效果好,能使蚕豆增产10%～20%,具有良好的应用前景。