茄子调控抗青枯病反应信号基因的筛选和鉴定

以抗青枯病茄子自交系‘E-31’为材料,利用病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing,VIGS）技术沉默抗病材料中调控抗病相关的信号基因,研究其在茄子抗青枯病反应中的作用。qRT-PCR结果表明,与对照植株相比,VIGS诱导基因沉默植株,目的基因的表达量均下降。MAPK级联途径相关基因MKK2和MAPK6,SA途径中的信号基因PAD4、NPR1、SGT1、TGA和GluA,以及WRRY转录因子基因WRKY70沉默,接种青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）后植株出现不同程度的枯萎,而对照植株无变化。MAPK级联途径相关基因MAPK3和MAPK4,SA途径中的信号基因NDR1,ET途径中的信号基因EIN2和EIL1,JA途径信号基因JAR1沉默后,植株均未出现萎蔫症状。研究结果表明,MKK2、MAPK6、PAD4、NPR1、SGT1、TGA、GluA和WRKY70等基因在茄子调控抗青枯病反应中起正调控作用,而MAPK3、MAPK4、NDR1、EIL1、EIN2和JAR1等基因可能未参与或起负调作用,推断茄子‘E-31’调控青枯病信号途径可能主要依赖于SA途径。     

番茄木虱取食对含Mi-1.2番茄抗氧化酶活性及防御反应相关基因表达的影响

Mi-1.2基因编码CC-NBS-LRR家族抗病蛋白,对线虫及刺吸式昆虫具有广谱抗性。以番茄木虱和携带Mi-1.2基因的番茄品系‘Motelle’作为研究体系,研究番茄木虱取食对番茄叶片抗氧化酶活性及防御反应相关基因表达的影响。结果表明：番茄木虱的取食显著提高了番茄叶片抗氧化酶POD、CAT、APX等的活性,同时诱导Mi-1.2基因表达;番茄木虱的取食上调SA合成有关基因PAL、SA信号途径标志基因PR-1（P4）及与Mi-1.2功能相关基因WRKY70、WRKY72a、WRKY72b的表达。JA/systemin信号途径和伤害有关的PinII、TPI-1、PR-6、PR-7、PR-5等及Prosystemin编码基因Psy的表达未发生变化;JA合成途径相关酶编码基因AOS2、LoxD下调表达,AOC的表达没有变化。SA信号途径可能参与Mi-1.2介导的番茄对于刺吸式昆虫番茄木虱的防御反应。另外,Mi-1.2的RNAi沉默不会改变上述基因的mRNA水平,说明Mi-1.2基因产物对这些基因的表达无调控作用。     

番木瓜开花相关基因CpFT1及启动子的克隆与表达分析

以番木瓜（Carica papaya L.）花为材料,利用番木瓜基因组序列设计番木瓜CpFT1和启动子扩增引物,通过PCR获得了该基因长度为525 bp的基因组DNA序列和1 500 bp的上游调控序列。通过生物信息学分析,发现CpFT1编码174个氨基酸。经序列对比及进化分析发现,番木瓜FT基因与山毛榉FT基因同源性最高。亚细胞定位显示CpFT1蛋白定位于细胞核。进一步分析CpFT1的启动子序列,脱落酸、赤霉素、水杨酸等激素调控相关的元件位于CpFT1上游1 500 bp的序列上。利用实时荧光定量PCR检测了CpFT1在不同性别花器官、花不同发育阶段以及不同激素处理下花中的表达差异,结果表明CpFT1的表达可能受到脱落酸、水杨酸等激素的调控。     

南瓜肌醇单磷酸酶基因CmIMP1和CmIMP2的克隆与表达分析

以中国南瓜（Cucurbita moschata）为试验材料,利用同源克隆和南瓜转录组unigene序列获得2个IMP基因的全长cDNA序列,将两个基因命名为CmIMP1和CmIMP2,GenBank登录号为KP735607和KP735608。CmIMP1基因cDNA全长1 053 bp,包含1个810 bp的ORF,共编码269个氨基酸;CmIMP2基因cDNA全长945 bp,包含1个807 bp的ORF,共编码268个氨基酸。序列分析发现两个基因均含有磷酸酶家族锂敏感的3个特殊结构域,系统进化树分析表明这2个南瓜CmIMP与其他植物IMP有较高同源性（63.8% ~ 94.0%）,并与葫芦科作物最接近。采用荧光定量PCR研究CmIMP在各组织及逆境条件下的表达模式显示,其表达具有组织特异性,在叶中表达最高,须和幼果次之;盐胁迫和干旱胁迫可强烈诱导CmIMP表达,ABA对CmIMP的诱导较微弱,推测CmIMP在南瓜响应非生物胁迫的分子调控机制方面发挥重要作用。     

蕨类植物性别决定调控机制研究进展

概述了包括赤霉素、成精子囊素、乙烯、细胞分裂素在内的植物激素、培养密度、营养条件、光照条件等环境因素以及配子体自身条件对蕨类植物性别决定的影响,并结合近年来性别决定调控机制在遗传学以及分子生物学方面取得的研究进展,综述了海金沙（Lygodium japonicum）中成精子囊素通过时空分离的赤霉素生物合成途径调控性别的分子机制、水蕨（Ceratopteris richardii）中性别决定遗传学和分子模型以及与性别决定相关的MADS-box基因,指出蕨类植物性别决定调控机制研究需要解决的一系列问题以及未来蕨类植物性别决定的研究方向。     

红皮梨花青苷调控基因PyMYBa的克隆与表达分析

以红皮梨‘奥冠’为试材,采用RT-PCR结合RACE技术获得1个MYB基因,命名为PyMYBa。该基因开放读码框共714 bp,编码237个氨基酸。PyMYBa分子量27.4 kD,等电点8.78。氨基酸序列分析显示,在其N端具有保守的R2R3-MYB结构域,R3-MYB结构域含有bHLH结合基序。进化树分析表明,PyMYBa与花青苷调控MYB转录因子的同源性很高。基因表达结果表明,PyMYBa在梨叶、花、果皮中表达量明显高于果肉,果皮中的表达量与花青苷调控基因PyMYB10相比,无显著差异。遮光及MeJA处理后果皮中PyMYBa、PyMYB10的表达量变化与花青苷合成量变化趋势相似,推测PyMYBa为梨花青苷合成中重要的正向调控因子。通过原核表达试验获得了该基因的重组蛋白,SDS-PAGE电泳检测结果与预期蛋白分子量一致。     

板栗雌雄花发育相关的MADS-box基因发掘与表达分析

为筛选板栗混合花序中雌雄花形成与发育关键基因,基于板栗雌雄花表达谱测序结果,从差异表达基因中分离到17个MADS-box基因。通过序列结构分析,发现其中2个基因缺少半保守的K盒,为Ⅰ型MADS-box基因,另外15个基因为Ⅱ型MADS-box基因。系统进化关系分析显示,13个包含完整读码框的MADS-box基因中有2个B类基因,1个C/D类基因和3个E类基因。荧光定量PCR结果证实这些MADS-box基因在板栗早期混合花序中的雌雄花之间表达差异显著（变化倍数 > 2）,且部分B、C/D和E类基因在板栗幼叶、纯雄花和雌花中的表达变化趋势相似,推测这些MADS-box基因在板栗雌雄花形成和发育中起重要调控作用。     

芜菁花青素合成关键酶DFR基因启动子的克隆及功能分析

在已经克隆的‘津田’芜菁和‘赤丸’芜菁二氢黄酮醇4–还原酶（DFR）基因的基础上,通过染色体步移法从两种芜菁基因组中克隆了BrDFR1和BrDFR2基因上游1 296和1 297 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,启动子片段中包含TATA box、CAAT box、光调控元件、ABA应答元件、伤害应答元件、低温应答元件、防御与胁迫应答元件、MeJA应答元件等多个顺式作用元件。启动子BrDFR1P和BrDFR2P仅在15个核苷酸位点存在差异。将BrDFR1P和BrDFR2P分别连接到pCAMBIA1301植物表达载体上,构建Promoter::GUS载体,通过农杆菌介导遗传转化烟草。GUS组织化学染色检测表明,BrDFR1P和BrDFR2P均能驱动GUS基因表达。构建BrDFR1P和BrDFR2P的一系列缺失体,融合GUS基因后遗传转化烟草。染色结果表明,BrDFR1P和BrDFR2P缺失片段均具有相应的起始下游基因转录的活性特征。     

植物在低温胁迫下的过氧化氢代谢及信号转导

 过氧化氢(Hydrogen peroxide, H₂O₂ ) 是植物细胞代谢过程中产生的一种活性氧, 被认为对细胞具有毒害作用。然而越来越多的研究证明, H₂O₂是植物细胞抵抗胁迫反应过程中的重要信号分子, 尤其H₂O₂在植物受到低温胁迫时所具有的信号调控功能越来越受到关注。作者综述了低温胁迫下的H₂O₂代谢情况, 并从H₂O₂与乙烯、水杨酸等信号分子的互作效应, 以及H₂O₂对抗冷基因、根系吸水性的调控来探讨其在抗冷信号转导过程中的功能及作用机制。     

森林草莓独脚金内酯合成关键基因D27的克隆与表达分析

根据森林草莓中独角金内酯合成过程中的关键基因D27的序列信息设计引物,获得了D27基因的完整开放阅读框架。采用MEGA5.0软件,对森林草莓与其他物种D27基因编码的氨基酸序列进行聚类分析,发现森林草莓D27基因与其他物种D27基因具有较高的同源性。设置正常供磷、缺磷和在缺磷条件下接种丛枝状菌根真菌处理,利用电感耦合等离子发射光谱仪测定草莓植株的磷含量,结果表明缺磷条件下接种丛枝状菌根真菌,草莓植株中磷含量极显著提高,而缺磷处理的磷含量极显著降低。实时荧光定量PCR结果表明,与正常供磷处理相比,缺磷和接种丛枝状菌根真菌处理条件下,D27基因的表达量分别上调7倍和11倍,这说明D27基因的表达既受到磷水平调控,又受到菌根形成的调控。     

香樟两个DREB1转录因子基因的分离及其对不同胁迫的响应分析

以香樟（Cinnamomum camphora）实生苗为试验材料,利用同源克隆结合RACE技术获得了两个冷诱导转录因子基因CBF/DREB1的cDNA全长序列,命名为CcCBFc和CcCBFd,GenBank登录号分别为KP336741和KP336742。序列分析显示这两个基因均没有内含子,cDNA全长为897和1 010 bp,开放阅读框分别为654和621 bp,编码217和206个氨基酸,预测蛋白分子量分别为24.0和22.9 kD,等电点分别为5.26和8.58。基于氨基酸序列的同源性比对和系统进化树分析表明,这两个基因均属于DREB1家族,与双子叶植物进化关系较近。实时定量PCR结果显示,CcCBFc和CcCBFd都能被低温（4 ℃）、干旱（20%PEG）、盐（250 mmol ? L-1 NaCl）和ABA（100 μmol ? L-1）诱导,表明CcCBFc和CcCBFd可能在香樟应对非生物胁迫过程中发挥重要作用。     

桃冷处理响应基因PdCIbHLH的克隆和功能鉴定

以山桃(Prunus davidiana Franch)为试材,克隆获得冷处理响应基因PdCIbHLH(cold-induced b HLH),其ORF为1 617 bp,编码含539个氨基酸的蛋白质,含有典型的bHLH结构域。系统发生分析表明,Pd CIbHLH与苹果MdICE1的同源性最高。PdCIbHLH在山桃不同器官中均可表达,在叶片中表达最高,在枝条中表达较弱。叶片中PdCIbHLH受4℃处理诱导表达。在拟南芥中超量表达PdCIbHLH,其低温抗性较野生型显著升高。酵母杂交试验结果显示,PdCIbHLH可与AtCBF3的启动子相互作用。烟草瞬时表达试验结果表明,PdCIbHLH可激活AtCBF3的表达。推测PdCIbHLH通过直接激活CBF的表达正调控植株对低温处理的响应。     

黄瓜转录因子CsCBF3 的克隆及表达分析

利用RT-PCR 技术从黄瓜中克隆了植物低温信号转导途径中的关键转录因子C-repeat-Binding
Factor3，将其命名为CsCBF3，GenBank 登录号为JQ900769。CsCBF3 基因开放阅读框全长为615 bp，
编码204 个氨基酸。进化树分析表明，CsCBF3 隶属于CBF 基因家族，与葡萄CBF3 蛋白亲缘关系最近，
而与黑麦草、水稻CBF3 蛋白亲缘关系较远。生物信息学分析结果表明，CsCBF3 编码的蛋白包含保守的
AP2 DNA 结合域，N 端的核定位信号区和C 端的酸性氨基酸富集区，且该蛋白中的一些磷酸化位点及二
级结构在与DNA 互作过程中发挥重要作用。荧光定量PCR 检测结果显示低温可诱导CsCBF3 的表达，且
其表达量在迅速达到峰值后又降低，说明CsCBF3 是一个快速响应基因，推测其在黄瓜耐冷过程中起着重
要的作用。     

筇竹CBF1基因的原核表达和多克隆抗体的制备

以筇竹（Qiongzhuea tumidinoda Hsueh et Yi）叶片为试材,采用RT-PCR方法克隆其CBF1基因,并将CBF1连接到原核表达载体pET32a（+）上,经克隆测序确定所构建的重组载体pET32-QZ开放阅读框正确。将重组载体pET32-QZ转化大肠杆菌Rosetta2（DE3）菌株,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝染色,证明CBF1蛋白得到了高效表达,所表达蛋白是大小约为45 kD的融合蛋白。经镍柱纯化后作为抗原免疫家兔,制备CBF1蛋白特异性抗血清。所制备的多克隆抗体能够与融合蛋白和经冷诱导的筇竹叶片总蛋白在25 kD处出现杂交条带。上述结果表明,表达的目的蛋白可用于免疫组织化学、蛋白质印迹检测。     

转香樟CcCBFs烟草的抗逆性分析

为探究香樟CBF基因（CcCBFa、CcCBFb和CcCBFc）增强植株非生物胁迫抗性的功能,对获得的T1代转基因烟草,分别进行300 mmol · L-1甘露醇模拟干旱、300 mmol · L-1 NaCl溶液模拟高盐和4 ℃模拟低温胁迫处理,测定其丙二醛、脯氨酸和可溶性糖含量,探讨其抗逆性。结果表明：CcCBFb和CcCBFc可显著增强烟草抗旱性;CcCBFa和CcCBFc可显著增强烟草抗盐性;CcCBFc可显著增强烟草抗寒性。CcCBFc可以提高转基因烟草抗旱、抗盐、抗寒能力。     

冷诱导转录因子CBF3 转化茄子的初步研究

成功构建了含冷诱导转录因子CBF3（ CRT binding factor）的植物表达载体,通过农杆菌介
导法转入三月茄,采用PCR 检测DNA 和卡那霉素涂抹叶片法进行田间抗性鉴定,证实获得含抗寒基因
CBF3 的茄子转基因植株2 株,建立了抗寒的茄子再生与转化技术体系。     

草莓FaCBF1基因的克隆及表达分析

以‘丰香’草莓为试材,通过SON-PCR结合RT-PCR技术获得了1个冷诱导转录因子CBF/DREB家族基因编码区全长cDNA序列,命名为FaCBF1,GenBank登录号为FJ767754。该基因包含1个长为636 bp的完整开放阅读框,编码211个氨基酸,预测分子量为23.4 kD,等电点为6.53。氨基酸同源性分析表明,FaCBF1与GenBank中登录的蔷薇科植物CBF/DREB具有较高的同源性。进化树分析表明,草莓FaCBF1与近缘属的月季、苹果和沙梨处于同一进化枝上,而与李属植物进化关系较远。半定量RT-PCR分析显示,FaCBF1能被低温、干旱和高盐胁迫诱导,但对ABA诱导不敏感;在同一诱导时期在根中的表达量高于叶和茎中的表达量。     

月季CBF 转录因子基因的克隆及表达分析

 根据CBF（C-repeat binding factor）AP2/EREBP 保守区设计1 对简并引物,采用PCR 方法对月季‘寒锦4 号’（Rosa hybrida‘Hanjin 4’）CBF 转录因子基因中间片段进行克隆;再根据中间片段区域设计了两对特异引物,采用反向PCR 方法对该基因的5'和3'端的序列进行克隆,将中间片段与反向PCR 产物拼接得到CBF 基因全长序列,命名为RhCBF,GenBank 注册编号为EF582843;该基因序列长758 bp,ORF 为603 bp,编码200 个氨基酸;同时,根据基因序列设计1 对特异引物,利用荧光定量PCR分析月季CBF 在不同逆境胁迫下的表达情况。结果显示低温和盐均可以诱导RhCBF 的表达,而干旱处理不能诱导其表达。     

羊肚菌冷链物流系统安全性评价

针对羊肚菌冷链物流系统安全性评价问题,分析了冷链物流安全评价的内容,建立了羊肚菌冷链物流安全生产能力指标体系,并详细分析了指标体系中的20项评价指标。对提高冷链物流企业的安全生产能力和管理水平具有一定的借鉴意义。