侵染节瓜的3种病毒多重PCR检测体系的建立

 根据侵染节瓜3种病毒——小西葫芦黄花叶病毒（ZYMV）、番木瓜环斑病毒（PRSV）和黄瓜花叶病毒（CMV）的外壳蛋白基因保守区序列设计特异引物,在建立各种病毒单项PCR技术的基础上,通过优化多重PCR反应条件,初步建立了能同步、快速、灵敏地检测这3种病毒的多重PCR检测体系,为节瓜病毒病原的检测提供了理论与技术支持。     

百合三种病毒的多重RT-PCR检测

根据基因库中黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）、百合斑驳病毒（Lily mottle virus,LMoV）、百合无症病毒（Lily symptomless virus, LSV）的外壳蛋白基因序列,设计了3对特异引物,通过对扩增条件进行优化,建立了同时检测CMV、LMoV和LSV的多重RT-PCR检测方法。该方法可以从带有CMV、LMoV和LSV的样品中同时扩增出3条大小与试验设计相符的657 bp (CMV) 、428 bp（LMoV）、171 bp (LSV)的特异性多重RT-PCR扩增带。扩增产物测序表明,CMV、LMoV和LSV 3种病毒与GenBank中登录的亚洲和荷兰多数分离物核苷酸同源性在90%以上,地域差异不明显,外壳蛋白序列高度保守。     

甘肃省河西地区辣(甜)椒病毒病毒原鉴定

2006～2009年用DAS-ELISA方法对采自甘肃省河西地区辣(甜)椒病毒病病株的27份样本进行了烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草蚀纹病毒(TEV)、辣椒轻微斑驳病毒(PMMoV)、番茄斑萎病毒(TSWV)、马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、苜蓿花叶病毒(AMV)和蚕豆萎蔫病毒(BBWV)共9种病毒的检测,同时采用反转录聚合酶链式反应对其中20份样本进行了前4种病毒的测定。结果表明,DAS-ELISA方法检测出的病毒种类有TMV、CMV、PMMoV、PVY和TEV,其中TMV和CMV是优势毒原种群,检出率分别为44.4%和33.3%;RT-PCR方法检测出TMV、CMV、TEV和PMMoV;未检出TSWV、PVX、AMV和BBWV。     

香蕉两种主要病毒多重PCR检测方法的建立

 根据香蕉束顶病(Banana bunchy top virus, BBTV) 和香蕉花叶心腐病(Cucumber mosaic virus,CMV) 的复制酶基因、外壳蛋白基因序列分别设计特异性引物对, 在BBTV单一PCR和CMV RT-PCR优化体系的基础上, 建立了可同时检测BBTV、CMV的多重PCR检测方法。此方法可以特异地从感染BBTV和CMV的样品中扩增出2条带, BBTV (748 bp) 和CMV (557 bp) 。扩增产物序列测定结果表明, BBTV扩增产物与GenBank中其他分离物的核苷酸序列同源性为91% ～99% , CMV扩增产物与GenBank中其他分离物的核苷酸序列同源性为93%～98%。     

重庆南瓜病毒病病原ELISA 检测及CMV 变异分析

 利用7 种植物病毒的抗体,对采自重庆7 个区县的67 份南瓜病毒病样品进行了抗原直接包被酶联免疫吸附分析（ACP-ELISA）检测。检测结果表明,在这67 份样品中,至少59 份感染了所要检测病毒,其中,感染黄瓜花叶病毒 (Cucumber mosaic virus, CMV)、烟草花叶病毒 (Tobacco mosaic virus,TMV)、番茄花叶病毒 (Tomato mosaic virus, ToMV)、芜菁花叶病毒 (Turnip mosaic virus, TuMV)、蚕豆萎蔫病毒2 号 (Broad bean wilt virus 2, BBWV-2)、马铃薯Y 病毒 (Potato virus Y, PVY)和马铃薯X 病毒(Potato virus X, PVX) 的样品分别为80.60%、77.61%、74.63%、82.09%、76.12%、83.58%和55.22%。在检测呈阳性的59 份样品中有93.22%的样品受到2 种以上病毒的复合侵染,而受7 种病毒复合侵染的样品高达60.00%,表明在南瓜上病毒复合侵染现象相当严重。进一步对54 份受CMV 侵染的南瓜样品检测发现,CMV 亚组Ⅰ (CMVⅠ) 病毒侵染的样品有49 份,占90.74%,CMV 亚组Ⅱ (CMVⅡ) 病毒侵染的样品为11 份,占20.37%;其中6 份（11.11%）样品检测到CMVⅠ和CMVⅡ的复合侵染。以免疫捕获反转录PCR (IC-RT-PCR) 扩增了一个CMVⅠ分离物 (CMV-CQ) 近全长CP 基因并进行序列分析,结果证实其属于CMV 亚组Ⅰ型,其核苷酸序列与国内CMVⅠ型赤豆分离物 (CMV-RB) 的同源性最高,为98.1%。     

重庆辣椒病毒病病原初步鉴定和分析

利用斑点免疫杂交法（Dot-ELISA）和RT-PCR法对重庆地区发生的辣椒病毒病的病原进行了鉴定和优势病毒分析。利用5种常见蔬菜病毒的血清对采自重庆8个区县的152份辣椒病毒病样品进行Dot-ELISA检测,结果表明,共有118份辣椒样品检测呈阳性,其中,黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）的侵染最普遍,总检出率高达57.89%;番茄花叶病毒（Tomato mosaic virus,ToMV）的总检出率最低,为22.52%;烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）、芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus,TuMV）和蚕豆萎蔫病毒2号（Broad bean wilt virus 2,BBWV-2）的总检出率分别为30.26%、36.18%和24.34%。在118份阳性样品中,有66.10%的样品受两种及以上病毒复合侵染,其中33.33%的样品受到CMV和TuMV复合侵染,有26.27%的样品受3种病毒复合侵染。设计5种病毒的特异性引物,随机选取16份阳性样品进行RT-PCR扩增,克隆测序结果表明扩增片段确实是5种病毒的相应序列,且RT-PCR与ELISA检测结果基本吻合。检测结果表明CMV是重庆地区辣椒上的优势病毒种类,且该地区辣椒上病毒复合侵染现象普遍。本文首次报道了ToMV和TuMV侵染辣椒。     

太子参芜菁花叶病毒和蚕豆萎蔫病毒的双重RT-PCR检测

针对不同产地栽培的太子参(Pseudostellaria heterophylla)中主要存在芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,Tu MV)和蚕豆萎蔫病毒(Broad bean wilt virus,BBWV)侵染且为害严重的情况,建立能同时检测这2种病毒的双重RT-PCR快速检测方法。根据Gen Bank数据库中的Tu MV、BBWV外壳蛋白(coat protein,CP)基因核苷酸序列的保守区域分别设计简并引物,在单一RT-PCR检测体系的基础上,建立和优化双重RT-PCR检测体系。双重RT-PCR的优化结果显示,最佳扩增循环数为35,最佳引物浓度为0.4μmol·L~(-1),最佳退火温度为51℃。其灵敏度测定结果显示,2种病毒在样品c DNA稀释至原液的10-4倍后仍能扩增出特异条带。应用该方法对7份栽培太子参样品和4份脱毒苗样品进行了检测,结果表明,建立的双重RT-PCR检测方法可稳定、准确、灵敏地同时检测Tu MV和BBWV。     

黄瓜花叶病毒的RT-PCR检测

根据黄瓜花叶病毒(CMV)的复制酶基因序列设计、合成引物,以感病组织和健康组织总RNA为模板,CMV质粒作为RT-PCR反应的阳性对照,进行cDNA合成和PCR扩增.对2002-2003年采集的98份黄瓜病毒病样本进行了检测,结果从感病组织中扩增出与预期的767bp大小一致的目标片段,而健康组织无此扩增产物.结果表明98份材料中96.94%检测到CMV.     

The Degradation of Starch in Apples Removed From the Tree at Different Stages of Development

The viruses cucumber mosaic (CMV), turnip mosaic (TuMV), broad bean wilt (BBWV), tomato aspermy (TAV) and tobravirus were isolated from field-grown spinach in Britain and identified by host range, electron microscopy and serology. CMV was most prevalent and widespread. Infected CMV-sensitive spinach cultivars usually showed diverse symptoms that were either associated with individual viruses or a mixture of TuMV and CMV. CMV-tolerant cultivars were symptomless when infected with CMV alone but produced diverse symptoms when infected with other viruses. In field experiments there was an association between trap catches of winged aphids and CMV incidence. Virus incidence was greatest in summer-sown crops, less in spring-sown and least in autumn-sown. Sap transmission tests showed CMV incidence to be similar in the CMV-tolerant and sensitive cultivars and that visual assessment underestimated virus incidence. A variant of a spinach CMV isolate overcome CMV tolerance with the production of severe symptoms and concomitant increase in virus content. CMV and BBWV reduced growth in a sensitive and BBWV in a tolerant cultivar.     

香蕉3种病毒的多重PCR检测体系

根据GenBank中已发表的香蕉束顶病毒（Banana bunchy top virus,BBTV）﹑黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）和香蕉线条病毒（Banana streak virus,BSV）的基因序列,找出保守序列分别设计出特异引物,在建立各种病毒单项PCR技术的基础上,通过优化多重PCR反应条件,建立了能同时检测3种病毒的多重PCR检测体系。该体系可同时扩增BBTV的615 bp、CMV的480 bp和BSV的945 bp的特异片段。这些片段克隆测序结果表明,多重PCR扩增的不同病毒片段是特异和专化的,其核苷酸序列与相应的病毒基因片段的相似性都达91%以上。该体系的灵敏度测定结果表明,从相当于或大于10-2 mg感病植物组织中均能检测到这3种病毒。     

北京、山东和广东黄瓜病毒检测

采集北京顺义和昌平、山东寿光及广东深圳等地田间感染病毒病的黄瓜材料284份,利用黄瓜花叶病毒(CMV)、西瓜花叶病毒(WMV)、小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)及番木瓜环斑病毒(PRSV)5种黄瓜病毒抗体采用酶联免疫吸附(ELISA)法对其进行病毒病种类鉴定。结果表明,顺义和昌平采集到的126份和124份病毒样品,均在其叶片上检测到CMV、WMV、ZYMV 3种病毒,其中CMV检出率最高,均为100.00%;其次是ZYMV,检出率分别为80.95%和66.94%;WMV检出率最低,分别为51.59%和53.23%;在感病果实上只检测到CMV。在寿光采集的28份发病叶片中,检测到CMV、WMV、ZYMV、PRSV 4种病毒,其检出率分别为100.00%、35.71%、35.71%、17.86%。在深圳采集的6份黄瓜感病材料中,检测到CMV、WMV、PRSV 3种病毒,其检出率分别为100.00%、50.00%、50.00%。调查结果还发现,在北京顺义和昌平、山东寿光及广东深圳均存在2种或2种以上病毒复合侵染的现象。     

北京地区南瓜病毒病病原种类鉴定

为明确北京地区南瓜病毒病种类及其主要侵染病原,2016~2017年在北京周边采集疑似感染病毒的南瓜病样84份,并根据南瓜上的6种病毒特异性引物对其进行反转录PCR(RT-PCR)检测。结果表明:共有79份南瓜病样检测显示阳性,其中黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的检出率最高,为52.38%;其次是小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)和西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV),检出率分别为44.01%、14.29%,其他病毒暂未检出。此外,16.67%的样品受2种病毒复合侵染,CMV和ZYMV复合侵染占7.14%,ZYMV和WMV复合侵染占9.52%。北京地区南瓜上优势病毒种类为CMV,且存在病毒复合侵染现象。     

草坪土壤的N2O产生途径及其对施氮肥的响应

 硝化作用、反硝化作用和硝化细菌反硝化作用是土壤中产生N₂O的主要途径。以常用的冷季型草坪草早熟禾为对象,采用气体抑制剂培养法研究了不同施氮量对草坪土壤N₂O排放及其产生途径的影响。结果表明,对照草坪土壤的N₂O日排放量为7.2 ~ 8.2 g · m^-2 · d^-1,年施氮量10 g · m^-2未改变草坪土壤N₂O排放强度,年施氮量25、35 g · m^-2处理则分别比对照增加1.52倍和1.88倍,但二者之间没有显著差异。对照草坪土壤N₂O产生途径主要以异养硝化作用为主,其贡献率达65.7%,反硝化作用贡献率为34%,自养硝化和硝化细菌反硝化过程几乎不发生。年施氮量25 g · m^-2时,N₂O排放以硝化细菌反硝化、异养硝化和反硝化途径为主,贡献率分别为35%、35%和29%。年施氮量35 g · m^-2时,N₂O排放来自于4个途径,其中反硝化途径占41%,自养硝化途径贡献率增加至20%。     

新疆哈密瓜病毒的DAS-ELISA检测和分子鉴定

为了明确当前新疆哈密瓜病毒病的主要毒原种类及其遗传分化,为哈密瓜病毒病害的防治提供科学依据,对吐鲁番、鄯善、昌吉等哈密瓜主产区的病毒病调查、采样,采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（DAS–ELISA）和RT-PCR技术对侵染哈密瓜的7种主要病毒及瓜类重要检疫性病毒--黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）进行检测和分子鉴定。结果表明：在所检测的121个样品中,黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）的检出率最高,为70.2%;西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus,WMV）和小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV）次之,分别为62.0%和37.2%,甜瓜坏死斑点病毒（Melon necrotic spot virus,MNSV）的检出率仅为2.5%,CGMMV、南瓜花叶病毒（Squash mosaic virus,SqMV）、番木瓜环斑病毒（Papaya ring spot virus W,PRSV-W）和烟草坏死病毒（Tobacco necrosis virus,TNV）未检测到。CMV、WMV、ZYMV在田间分布广泛,2种及3种病毒的复合侵染发生普遍（60.19%）。对各病毒分离物进行CP基因扩增、序列测定和系统发育分析,确定了CMV新疆哈密瓜分离物归属于CMV亚组ⅠB。ZYMV、WMV和MNSV与已报道的病毒株系CP基因核苷酸序列具有较高的同源性,但存在一定的变异,ZYMV和WMV具有明显的地域分化现象。     

Production of virus-free plantlets by anther culture of LiliumבEnchantment’

Anthers of the LiliumבEnchantment’, excised at the uninucleate microspore stage, were cultured on MS media containing 6% sucrose with auxin and cytokinin. When anthers were cultured on the medium with 2 mg l⁻¹ picloram and zeatin, 12–86% of them formed nodular calli. Anthers excised from greenhouse- and field-grown plants showed different responses: anthers of greenhouse-grown plants had a significantly higher capability to form callus and regenerate bulblets than those of field-grown plants. In anthers from greenhouse-grown plants, bulblet formation was dependent on the time at which anthers were excised from donor plants: anthers collected from early forced mother-plants had a higher capability of forming bulblet than others. All regenerated plantlets were diploid, which was substantiated by histological observation showing that the anther-derived calli originated from anther wall tissues. Virus tests by ELISA were made for 49 plantlets selected randomly at transplanting: 20 plantlets (41%) were virus-free, and the rest showed positive reactions for lily symptomless virus, cucumber mosaic virus and/or tulip breaking virus.     

石河子地区加工番茄坏死条斑病毒原的ELISA检测及品种抗病性鉴定

用番茄花叶病毒、蚕豆萎蔫病毒和黄瓜花叶病毒的单克隆抗体对田间表现坏死条斑症状的315个加工番茄自然病株进行了ELISA检测。结果表明,这3种病毒的检测侵染率很高,分别为69.3 %、66.7 %和75.1 %,但其单一病毒的侵染率却很低,仅分别为1.5 %、2.4 %和8.5 %。表明这3种病毒是石河子地区加工番茄上的主要病毒种类,其复合侵染极可能是造成田间大量病株呈现严重坏死条斑症状的主要因素。并且对田间自然发病的21个加工番茄品种的上述3种病毒带毒情况进行了ELISA检测,虽然供试品种体内带毒量都较高,但品种之间却表现出一定的抗病性差异。     

北运蔬菜基地辣椒病毒病病原种类的分子 检测

辣椒病毒病是广东、海南两省北运蔬菜基地的主要病害,十分有必要对其病原 种类进行全面
检测,以便为病毒 病的防治提供依据。本试验运用RT-PCR 方法对这两省北运蔬菜基地的辣椒病毒病或疑
似病毒病的病株样本进行分子检测。结果表明：广东省的病毒检出株率为55.67%,最主要的病毒种类是
黄瓜花叶病毒（CMV）和辣椒轻斑驳病毒（PMMoV）,另有少量的马铃薯Y 病毒（PVY）、马铃薯 X 病毒（PVX）
和番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）;海南省的病毒检出株率为44.67%,最主要的病毒种类仍然是CMV 和
PMMoV,另有少量的PVY。在田间,两省均以CMV 和PMMoV 复合侵染辣椒为主。     

不同处理方式对蔬菜种传病毒病的消毒效果评价

为了研究不同种子处理对种子传播病毒的灭活效果,试验以番茄、辣椒、甜瓜、南瓜种子样本中被番茄花叶病毒(ToMV)、烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶瓜病毒(CMV)感染的种子为研究对象,经过酶联免疫吸附测定(ELISA)和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测试选择出研究材料,采用7种病毒失活处理方法,分别为醋酸、过氧化氢、盐酸、次氯酸钠浸种,干热处理,温汤浸种和臭氧熏蒸处理。结果发现,能有效减少病毒浓度的处理为盐酸浸种、干热处理、温汤浸种(65℃)和臭氧(10 g/m3)处理,分别能将种子传播病毒的浓度平均降低51%、50%、42%和32%。其他灭活方法治疗效果较差,病毒浓度平均降低了12%~27%。盐酸浸种和干热处理是最有效的方法,对种子出芽率和活力没有影响。