桑树MaGte4基因的克隆、表达及序列特征分析

Virp1基因是第一个被报道可以结合RNA的Bromodomain(BRD)蛋白,在马铃薯纺锤块茎类病毒(potato spindle tuber viroid,PSTVd)对宿主的感染及其复制中起重要作用。本研究根据NCBI登录的virp1基因序列和桑树基因组数据库设计引物,进行RT-PCR扩增和克隆测序,获得桑树的同源MaGte4基因长1 771 bp的序列。生物信息学分析表明,基因有3个外显子,CDS长1 683 bp,编码560个氨基酸,有与乙酰化组蛋白赖氨酸具有特异相互作用的BRD及其extra-terminal(BET)结构域,且该结构及其氨基酸组成在各物种间比较保守,桑树MaGte4具有和virp1蛋白非常相似的C-末端区域,RT-PCR分析基因在正常和花叶型萎缩病桑树叶片、叶柄和叶脉中均有表达,推测MaGte4的功能可能和Virp1相类似。     

桑花叶萎缩类病毒滚环扩增检测技术体系的建立

为建立一种快速、灵敏、简单的检测类病毒的方法,以桑花叶萎缩类病毒为研究对象,根据其基因组设计了1条特异性连接环化的寡核苷酸链探针和2条PCR扩增检测引物,对收集到的6份桑花叶型萎缩类病毒样品进行了滚环扩增。结果所有样品的RCA扩增产物的核酸电泳,条带呈阶梯状分布,但大部分聚集于上样孔附近,与理论分析相符,表明该方法适用于桑花叶萎缩类病毒的快速检测。进一步利用人工合成的模拟DNA分子测试该检测方法的灵敏度,研究显示,利用RCA技术可以成功检测到10~3拷贝的模式DNA分子。     

桑花叶型萎缩病病原的检测与序列分析

旨在获得安康地区桑花叶萎缩病病原序列,为桑花叶萎缩病的防治提供更多的信息。用RT-PCR技术对安康地区染花叶型萎缩病病株的病原进行了分离,克隆测序并在Mfold网站预测其二级结构。该病的病原为桑花叶萎缩类病毒MMDVd-201110151（GenBank登录号：JQ809700）,核苷酸长度357 bp,GC含量50.7%,219 bp后38个碱基与樱桃小圆形类病毒样核糖核酸具有约85%的一致性。Mfold网站预测二级结构有58.3%的碱基配对,两端为分枝状结构。成功分离到安康地区桑花叶型萎缩病病原。     

绿豆生长素响应因子基因家族序列特征及分子进化

绿豆种子萌发率严重影响和制约其田间产量,研究利用与绿豆种子萌发相关的基因资源具有十分重要的意义。本研究拟通过查询绿豆转录组数据库,分离包含完整ORF的生长素响应因子(ARF)基因家族成员,对比分析该家族成员的蛋白保守结构域,基于氨基酸序列同源性构建系统进化树。结果表明:分离到22个包含完整ORF的ARF基因,其核苷酸序列长度范围为905~3 624 bp,其编码氨基酸序列长度的范围为237~761 aa。其中仅有4个ARF基因包含保守的B3 DNA结合结构域、Auxin响应因子和AUX/IAA家族蛋白结构域,其他基因存在1~2个保守结构域的缺失。系统进化树结果显示,绿豆22个ARF基因与拟南芥12个ARF基因共划分为3大类,9个亚类。这些结果为进一步揭示绿豆ARF基因功能多样性,同时为将来遗传工程改良绿豆品种提供理论参考。     

桑花叶萎缩类病毒的检测与序列多态性分析

为调查桑花叶萎缩类病毒的多态性,通过RT-PCR技术分离了安康地区桑花叶型萎缩类病毒,并对其基因组进行了克隆测序和序列分析。结果获得4 个MMDVd变体,核苷酸长度为356 nt 或357 nt,GC含量均约51%,Mfold网站预测二级结构两端为分枝状结构,其中约有58%的碱基配对。     

桑黄化型萎缩病植原体核糖体蛋白基因操纵子片段序列的扩增与分析

采用PCR技术对桑树黄化型萎缩病植原体核糖体蛋白基因操纵子的部分基因进行扩增,并对扩增片段进行测序及序列分析。结果表明,利用rpF/rpR引物对扩增得到桑黄化型萎缩病植原体核糖体蛋白基因操纵子片段大小为1240bp（GenBank登录号为GQ373255）,该片段包含rps19 基因部分序列,rpl22 和 rps3 基因的全部序列。相似性分析表明,该片段的核苷酸序列与16SrⅠ-rp亚组中各代表植原体的rp基因核苷酸序列的相似性为96.6-99.9%。构建的进化树表明,桑黄化型萎缩病植原体与报道的桑萎缩病植原体（MD）聚类为一个rp亚组,即rpI-B亚组。     

甘蔗CIPK基因的同源克隆与表达

CIPK(calcineurin B-like-interacting protein kinase)是植物特有一类的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,该蛋白在植物响应逆境胁迫中发挥着重要的作用,尤其与非生物逆境胁迫(干旱、高盐、ABA等)的信号传导密切相关。根据玉米CIPK15基因(EU957447.1,2247 bp)核酸序列保守区域设计1对同源克隆PCR引物,以甘蔗品种崖城05-179的c DNA为模板,通过RT-PCR扩增得到甘蔗CIPK基因的一条全长c DNA序列(Gen Bank登录号为KM114052)。序列分析结果表明,甘蔗Sc CIPK基因全长1782 bp,具有完整的开放阅读框(ORF,91~1631 bp),编码513个氨基酸,该基因具有CIPK基因的2个特征结构域(Kc-like superfamily和AMPKA-C-like superfamily)。生物信息学分析显示该基因编码的蛋白定位于内质网,为可溶性蛋白,不存在信号肽,二级结构元件多为α-螺旋,含有多个保守功能域,主要参与中间代谢。实时定量PCR表达分析表明,该基因表达具有组织特异性,虽在甘蔗各组织中均有表达,但在芽中的表达量最高。该基因在PEG、Na Cl、ABA、SA和Me JA的胁迫诱导过程中,受ABA胁迫后表达量最高,约为对照的5.3倍,推测该基因的表达与甘蔗抗干旱和抗渗透胁迫有关。     

高粱WRKY家族成员鉴定及生物信息学分析

WRKY转录因子是调控植物生长发育的重要转录因子,本研究利用高粱基因组数据库(v3.1.1),通过生物信息学分析鉴定出97个高粱WRKY基因家族成员,其CDS序列长度为423～4 965 bp,编码氨基酸长度为141～1 655 aa。染色体定位发现97个基因不均匀地分布于10条染色体上,其中3号染色体上数目最多,有23个WRKY基因,6号染色体最少,只有5个WRKY基因。根据WRKY保守结构域和锌指结构的特点对97个转录因子进行分类,可将它们分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三大类,分别有11个、70个和16个成员。另外对WRKY蛋白保守基序分析发现WRKY结构域有3个保守基序组成,各组成员的保守基序基本一致。部分蛋白的WRKY保守域和锌指结构具有多样性,分析发现部分高粱WRKY蛋白的WRKYGQK结构域中‘Q’突变为‘E’、‘S’和‘K’。系统进化关系显示高粱Ⅱ、Ⅲ类WRKY转录因子类聚在Ⅰ的下级分支上,表示Ⅱ和Ⅲ类可能是由Ⅰ类进化而来的。     

金花茶CnLCYE基因cDNA克隆及表达载体构建

利用RT-PCR和RACE技术,从珍稀观赏植物金花茶(Camellia nitidissima)花瓣中克隆得到了一个番茄红素ε-环化酶(lycopeneε-cyclase,LCYE)基因c DNA全长,命名为CnLCYE。碱基序列分析显示,CnLCYE基因全长2 149 bp,包含291 bp的5'非翻译区(untranslated regions,UTR)、265 bp的3'UTR和1 593 bp编码530个氨基酸的开放阅读框。该基因编码的蛋白质含有2个跨膜结构域,一个NADB_Rossmann superfamily结构域以及番茄红素ε-环化酶结构域(PLN02697)。CnLCYE蛋白二级结构以无规则卷曲为主,其次为α-螺旋,β-折叠所占比例最少。氨基酸序列比对分析结果显示,CnLCYE与茄科、蔷薇科等植物LCYE蛋白同源性都在70%以上,与普洱茶(Camellia sinensis var.assamica)LCYE同源性最高。根据该CnLCYE全长序列设计带有KpnⅠ和Bam HⅠ位点的全长扩增引物扩增基因全长,用KpnⅠ和Bam HⅠ双酶切后与表达载体p CAMBIA1300连接,成功构建了CnLCYE基因的正义表达载体,为深入研究CnLCYE基因的功能及其对花色的调控作用提供了帮助。     

砂藓(Racomitrium canescens)RcRab基因的克隆及生物信息学分析

本研究以砂藓(Racomitrium canescens)为材料,从砂藓干旱处理转录组数据库中筛选获得小G结合蛋白基因Rab的mRNA序列,通过RT-PCR法扩增,得到RcRab基因的CDS序列,并对其进行了生物信息学分析。结果表明,该基因c DNA全长为1171 bp,包含636 bp的开放阅读框,编码211个氨基酸。预测该基因有Rab家族的保守结构域-G结构域。RcRab蛋白分子质量为23.29 kD,理论等电点为5.76,具有亲水性,不属于跨膜蛋白且不存在信号肽。进化树分析表明,RcRab蛋白质与小立碗藓(Physcomitrella patens)Rab蛋白质亲缘关系最近。本研究可为进一步探索RcRab基因在苔藓植物中的抗旱机制提供数据基础。     

烟草SKP1基因cDNA的克隆分析及原核表达

应用DDRT-PCR法获得可被壳寡糖诱导的枯斑三生烟SKP1基因cDNA的3’端序列,通过5’ RACE扩增该基因cDNA的5’ 端,进而扩增此基因cDNA的全长,通过同源性比较分析,与本塞姆氏烟草的SKP1基因同源性达81%,其cDNA全长653 bp(GenBank登录号：AY702087),其中编码区位于73~540 bp,编码一条155个氨基酸的多肽。经预测该多肽的分子量为17 527.78 Da,等电点为4.57,定位于细胞质,功能结构域分析结果显示在4~105位氨基酸有一明显的Skp1结构域,其E值为1.25e-52,因此推断该基因为枯斑三生烟的SKP1基因。将该基因编码区亚克隆到原核表达载体pET23b(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),表达出与预测分子量一致的蛋白。为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

棉花转录因子基因GhMYB的克隆及特征分析

从棉花中克隆了1个MYB基因,命名为GhMYB(Gen Bank No.HQ234875)。该基因c DNA全长1264bp,具有1个774 bp的开放阅读框,5'非编码区为250 bp,3'非编码区为240 bp,编码256个氨基酸,预测分子量约为28.867 k Da,等电点为8.56,推测的氨基酸序列中含有2个高度保守的SANT结构域。GhMYB基因组序列长度为1355 bp,包含2个外显子和1个内含子。氨基酸同源分析发现,GhMYB与来自可可、陆地棉和巴旦木的MYB同源性较高。亚细胞定位结果表明,GhMYB:GFP融合蛋白定位于细胞核中。SDS-PAGE电泳分析表明,p ET-28a-GhMYB最佳诱导表达条件为1.0 mmol·L-1 IPTG在37℃下诱导4 h。电子表达谱分析表明,GhMYB基因在棉铃中特异表达,在根和叶中受水涝胁迫的诱导表达。     

雷蒙德氏棉Plant U-box(GrPUBs)基因家族生物信息学分析

PUBs蛋白调控了作物的生长发育及响应非生物胁迫和生物胁迫的过程。为探讨棉花中U-box类型泛素连接酶家族,本研究利用生物信息学方法分析了二倍体雷蒙德氏棉中PUBs的数目、进化、基因结构、结构域分布及基因表达模式。结果表明,雷蒙德氏棉中有93个Gr PUBs基因家族成员,基因长度为1 101~11 191 bp。亚细胞定位预测结果表明,Gr PUBs编码产物大部分定位在细胞质和细胞核中,少数定位在胞外基质线粒体中。根据除U-box以外所含结构域将该家族成员分为7类,分别含有UFD2结构域、ARM结构域、激酶结构域、只含U-box、WD-40、TPR以及异构酶结构域。Gr PUBs基因家族染色体定位显示,基因在13条染色体上均有分布,但分布不均匀。在第5条染色体最多,有11条基因序列,第4、第12和Scaffold染色体上的基因最少,仅有2条。基因结构分析表明,基因内含子的数目变化较大,在0~17之间,且具有相似结构的基因,其编码蛋白聚为一类。基因表达模式分析发现。几乎1/3的基因在花中优势表达,个别基因在开花后10 d、20 d、30 d和40 d的种子中表达量高于在叶和花中的表达,如Gorai.006G251300。本试验为深入研究U-box类型泛素连接酶在棉花生长发育及抗逆的机理提供了理论指导。     

姜荷花叶绿素降解酶基因PPH的克隆与生物信息学分析

为了获得姜荷花叶绿素降解的关键酶基因PPH信息,本试验在前期通过姜荷花全长转录组测序获得大量转录组信息的基础上,进行筛选分析,获得了2条PPH基因,分别命名为PPH1和PPH2。PPH1基因(GenBank:MT077178),cDNA序列全长1 795 bp,开放阅读框1 437 bp (138～1 574 bp),编码一条478 aa的氨基酸序列。PPH2基因(GenBank:MT077179),c DNA序列全长1 393 bp,开放阅读框1 227 bp (70～1 296 bp),编码一条408 aa的氨基酸序列。采用BLAST、Translate tool (ExPASy)、Clustal Omega、Find Conserved Domains(NCBI)、ProtParam、TMHMM Server、SOPMA、SWISS-MODEL、ClustalX (1.81)、MEGA 4.1等预测和分析了这2个基因编码蛋白氨基酸的一级结构(包括氨基酸序列的组成,保守区,理化特征等)、二级结构、三级结构及分子系统进化关系。PPH1和PPH2的核苷酸与蛋白氨基酸序列与其它物种的PPH基因都具有很高的同源性,两者都包含有水解酶(Hydrolase)特征PLN02578的保守区。分子系统进化分析表明,姜荷花的PPH1和PPH2聚为一小类,然后与小果野芭蕉PPH (XP_018677219.1)的亲缘关系最为接近,而与双子叶植物的关系较远。本研究为后期通过遗传转化手段改良姜荷花不育苞片的颜色提供了分子基础。     

甘蔗、斑茅及割手密Ⅲ型过氧化物酶基因克隆及比较分析

研究旨在通过比较分析甘蔗及其近缘种割手密和斑茅Ⅲ型过氧化物酶(Prxs)基因差异,探讨这三种植物Prxs功能差异的遗传基础。采用同源克隆方法,成功克隆获得了甘蔗、斑茅和割手密的Prxs基因DNA序列(Genebank登录号分别为KJ001797,KJ001798和KJ001799)。经测序鉴定,克隆获得的这三个基因DNA长度分别为3 030 bp、3 048 bp和3 028 bp,外显子长度均为1 083 bp,其中编码区长度为996 bp,编码331个氨基酸。蛋白质保守结构域分析表明,此三个基因均具有过氧化物酶典型保守结构域,属于依赖于亚铁血红素Ⅲ型过氧化物酶亚类,为目标基因,且在功能位点区域高度保守,只存在一个氨基酸位点差异。基因结构比较分析表明,克隆获得的割手密、斑茅和甘蔗过氧化物酶基因均包含4个外显子,与高粱、玉米和水稻的同源基因外显子个数一致,外显子长度有较小差异,而内含子长度却存在较大差异。高粱、玉米和水稻Prxs同源基因均处在靠近染色体末端的位置,说明此基因存在一定的同线性。本研究结果为深入研究Prxs基因在不同植物中功能差异提供了一定的参考,为研究植物中Prxs基因的进化规律奠定了一定的基础。     

椰子DNMT家族基因的鉴定和生物信息学分析

DNA甲基化(DNA methylation)能引起染色质结构、DNA结构和稳定性等的改变,影响基因的时空表达。DNA甲基转移酶(DNA methyltrans ferase, DNMT)负责催化完成DNA的甲基化。本研究通过比对已有的椰子基因组数据,找到CnDNMT家族基因,删除不含DNA＿methylase结构域的蛋白,共鉴定4个具有DNA甲基转移酶保守结构域的DNMT基因,分别命名为CnDNMT1～CnDNMT4。采用生物信息学的方法,对基因结构、表达量、蛋白保守结构域、启动子序列等进行了分析。结果表明：这4个基因为DNA甲基转移酶家族中的2个亚家族：CMT和DRM。氨基酸序列分析表明,椰子CnDNMT家族蛋白均为酸性蛋白,且亚细胞定位预测定位在细胞核中。motif搜索结果表明CnDNMT蛋白家族含有5个椰子CnDNMT基因家族含有5个保守元件,5个保守元件的结构域所含有的氨基酸位点数量基本一致,CnDNMT2基因在胚乳中表达量很高,这说明CnDNMT2可能在椰子胚乳发育过程中起重要作用。     

北美鹅掌楸CCD1基因的克隆与表达分析

本研究以北美鹅掌楸为试验材料,从北美鹅掌楸和鹅掌楸转录组数据库中挖掘出37条CCD基因家族的EST序列,并将这些序列归类于CCD基因家族中。以其中一条预测为CCD1的EST序列为基准设计引物,通过反转录PCR(RT-PCR)与c DNA末端快速扩增(RACE)技术从北美鹅掌楸中克隆得到一条全长为1 929 bp的序列,命名为LtCCD1基因。该基因包含102 bp 5'端、177 bp 3'端非翻译区序列和1 650 bp的开放阅读框,共编码549aa。LtCCD1基因与多个物种CCD1基因相似度大于80%,其编码的蛋白质拥有CCD基因家族典型的结构域RPE65。系统发育分析发现,LtCCD1基因编码的蛋白质与Anthurium amnicola、Crocus ancyrensis和番红花的CCD1基因编码的蛋白质亲缘关系较近。LtCCD1蛋白质分子量为61.96 kD,等电点为6.10,属酸性蛋白;无规则卷曲是该蛋白质二级结构的主要成分。利用在线软件Target P进行亚细胞定位预测并结合CCD1蛋白在其它植物中的定位信息,推测该蛋白可能位于细胞质内。使用实时荧光定量PCR技术对该基因进行组织特异性表达分析,发现LtCCD1基因在北美鹅掌楸的花瓣、花萼、雄蕊、雌蕊、花芽、叶、叶芽、茎8个组织中均有表达,表达量从大到小的顺序依次为:叶、花萼、花瓣、茎、雌蕊、叶芽、花芽、雄蕊。该研究结果可为进一步分析北美鹅掌楸中CCD1基因的功能奠定基础。     

油菜超氧化物歧化酶基因家族生物信息学分析

超氧化物歧化酶(SOD)是重要的抗氧酶,在生物体内广泛存在。以油菜基因数据库为搜索平台,通过对油菜超氧化物歧化酶基因家族进行生物信息学分析。结果表明:油菜SOD基因家族主要含有32个基因,蛋白质的氨基酸序列长度86 aa^386 aa之间。BanSODs基因具有相对保守的结构,即包含SOD DNA结构域;HMA DNA结构域;Mn/N DNA结构域;Mn/C DNA结构域,SOD蛋白结构中含有7个α螺旋和4个β折叠结构域。进化树分析表明油菜SOD蛋白序列与谷子、小立碗藓蛋白序列具有相对较高的同源性。该研究结果可以为进一步了解油菜SOD基因家族和玉米抗氧化机制提供一定参考。     

芒果4CL基因的克隆及其表达分析

4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)是植物类黄酮类化合物和木质素等生物合成途径的一种关键酶,为了研究其在芒果果实中的作用机理,采用RACE方法,从芒果果实克隆得到了一个类黄酮合成相关的4CL基因。该基因全长c DNA序列为1 740 bp,开放阅读框为1 653 bp,编码550个氨基酸,分子量为60.47 k Da,等电点为9.51。对基因组扩增得到了2 318 bp长度的片段分析发现,该基因含有5个内含子,分别在1 013~1 139 bp,1 330~1 415 bp,1 564~1 653 bp,1 722~1 802 bp,1 905~2 000 bp。通过在线软件对其二级结构和三级结构进行了预测,系统发育分析发现该基因编码的蛋白与水曲柳、菘蓝等植物具有较近的亲缘关系。对3种不同着色的芒果品种中的4CL基因的RTPCR进行分析发现:红色的贵妃品种中表达量较高,而绿色的桂七品种中表达量较低。研究表明4CL基因表达芒果果实着色具有密切的相关性。     

马铃薯扩展蛋白基因家族的鉴定与表达分析

为了分析马铃薯扩展蛋白基因家族的进化与功能,鉴定了马铃薯的扩展蛋白基因家族,分析了其基因结构特征、系统发育及表达模式等。结果表明,马铃薯基因组包含33个扩展蛋白基因,包括A(21)、B(5)、LA(1)和LB(6)4个亚家族,分布在马铃薯11条染色体上。扩展蛋白氨基酸长度为194~488 aa,编码蛋白质具有保守的结构域,蛋白质亚细胞定位预测结果表明所有蛋白均定位于细胞外。基因结构分析表明,马铃薯扩展蛋白家族有23个基因(69.7%)含有2~3个内含子。基因表达分析发现,该家族基因在马铃薯根、茎、匍匐茎、果实及块茎发育过程中表达丰度较高,并且其表达受到高温、盐、激素及病害等逆境的调控。