昆虫Kr-h1基因的生物信息学分析

Kr-h1基因是研究昆虫变态发育与害虫生物防治的重要靶标分子。本研究解析了昆虫Kr-h1基因结构、保守结构域、二级结构与三级结构,开展了多序列比对、表达模式分析与系统发育树重构。结果表明,Kr-h1基因外显子数量较为保守,多为2个,而内含子长度变异较大。Kr-h1蛋白一般含8个锌指结构,二维与三维结构显示锌指结构保障了蛋白的稳定性。基于全长序列的系统发育分析显示,昆虫Kr-h1为直系同源,亲缘关系与物种进化相吻合,基于锌指结构的系统发育则显示Kr-h1不同模块进化中的差异。菜粉蝶转录组数据显示,该基因表达模式与变态密切相关。本研究丰富了昆虫Kr-h1基因的知识,以期为菜粉蝶、西花蓟马等昆虫变态发育研究与生物防治提供新策略。     

亚洲玉米螟中肠Cry1Ac毒素结合蛋白V-ATP酶A亚基的研究

运用RT-PCR和RACE技术克隆了亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Guenée)幼虫中肠V-ATP酶A亚基基因ofvaa,其c DNA全序列长2535 bp,开放阅读框1854 bp,编码617个氨基酸,预测蛋白分子量68.01 k D,等电点(p I)4.90。序列中包含有V-ATP酶A亚基特征,即ATP-synt_ab_N结构域ATP-synt_ab_C结构域和可供ATP结合的保守区Walker A(GAFGCGKT),以及天门冬氨酸介导Mg2+反应的保守区Walker B(SMMAD)。原核表达并获得纯化的Of VAA多肽片段,配体杂交试验表明其能够与Cry1Ac毒素结合。生测结果表明,Of VAA多肽片段对亚洲玉米螟有一定的杀虫活性,当其与Cry1Ac毒素混合时杀虫效果呈现加性效应。鉴定的亚洲玉米螟V-ATP酶A亚基基因ofvaa c DNA序列在Gen Bank登录号为HQ434762。     

瘿蚊科3种昆虫核糖体DNA的克隆及序列分析

瘿蚊科是双翅目昆虫中的重要类群?本研究对瘿蚊科3种昆虫—麦红吸浆虫?菊花瘿蚊和食蚜瘿蚊的核糖体DNA进行PCR扩增?克隆?测序及序列分析, 并对ITS-1在麦红吸浆虫4个地理种群中的遗传变异情况进行分析?结果表明, 从3种昆虫中获得的核糖体DNA序列包括:部分的18S rDNA(44 bp)?28S rDNA(37 bp), 全部的ITS-1(487~535 bp), 5.8S rDNA(121 bp)及ITS-2(336~352 bp)序列?3种昆虫ITS序列的碱基差异百分比在17.21%~29.59%之间, 共含有206个变异位点?ITS-1序列在麦红吸浆虫4个地理种群中比较保守, 只有4个变异位点, 单倍型多样性为0.311 7~0.796 5, 核苷酸多样性为0.000 6~0.002 2?本研究为今后瘿蚊科昆虫的分类鉴定?系统发育和遗传进化等相关研究提供了基础?     

球孢白僵菌体壁蛋白水解酶基因BbCDEP的克隆与分析

从玉米螟虫生真菌球孢白僵菌中分离到体壁蛋白水解酶基因片段BbCDEP,长度为1760bp,包含有3个内含子区段,分别位于331～405,586～646,1157～1223bp的位置,该基因编码了一个由377个氨基酸组成的蛋白,与蛋白数据库中同源蛋白AAL5578.1和AAK70804.1的最高同源性分别为98.9%和98.7%,为研究该基因在致病过程中的分子机理提供理论依据。     

亚洲玉米螟幼虫体内储存蛋白cDNA片段克隆与序列分析

为研究亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Guen e)幼虫体内储存蛋白(SP)表达调控的分子机制,根据不同昆虫储存蛋白基因序列的保守区域,设计合成简并引物,采用RT-PCR技术从亚洲玉米螟5龄幼虫中扩增出一段cDNA片段,大小为892bp,编码297个氨基酸,预测分子量为35.7kD,理论等电点pI值为8.73。该基因序列中含有保守的幼虫储存蛋白(LSP)两个特征基序YFTEDIDLNTYYYYFHVDYP和TALRDPVFC。Blast P分析结果表明:该片段推导的氨基酸序列与斜纹夜蛾Spodoptera litura适量甲硫氨酸SP-1的一致性最高,为77%;与小菜蛾Plutella xylostella富含甲硫氨酸SP-1和SP-2、印度谷螟Plodia interpunctellaSP、美国白蛾Hyphantria cuneaSP-2和粉茎螟Sesamia nonagrioides适量甲硫氨酸SP氨基酸序列的一致性分别为74%、74%、72%、71%和65%。构建系统发育树分析了9种鳞翅目昆虫储存蛋白进化关系,结果显示:亚洲玉米螟cDNA片段氨基酸序列与小菜蛾富含甲硫氨酸SP-1的亲缘关系最近,与粉茎螟适量甲硫氨酸SP亲缘关系最远。     

木贼镰孢菌D25-1全基因组序列的测定及结构分析

 木贼镰孢菌是多种植物的病原菌,也具有益生作用,功能复杂多样。本研究基于Illumina Hiseq 4000和PacBio平台对木贼镰孢菌D25-1全基因组序列进行了测定及组装,共组装出16个基因组片段,GC含量48.01%,总长40 776 005个碱基,Gap数为0。对内含子、外显子、基因长度、非编码RNA、重复序列等基因组信息均进行分类统计,外显子40 110个,总长19 787 286 bp,内含子26 281个,总长2 290 434 bp,多数基因长度为500~1 499 bp,tRNA 333个,rRNA 71个,sRNA 69个,snRNA 31个,miRNA 108个,共预测的重复序列1 713 918 bp,占基因组4.2033%。比较基因组学分析发现木贼镰孢菌组装结果较好,特有基因3 483个和共有基因1 805个,并对共有基因进行了COG分类注释。基因家族分析发现2 500多个单拷贝同源基因。构建进化树发现木贼镰孢菌和假禾谷镰孢菌的遗传距离最近,在全基因组水平上确定了其进化地位。本研究为基因表达的调控机制、基因功能演化分析、病害防控等研究提供基础的数据。     

木贼镰孢菌D25-1全基因组序列的测定及结构分析

 木贼镰孢菌是多种植物的病原菌,也具有益生作用,功能复杂多样。本研究基于Illumina Hiseq 4000和PacBio平台对木贼镰孢菌D25-1全基因组序列进行了测定及组装,共组装出16个基因组片段,GC含量48.01%,总长40 776 005个碱基,Gap数为0。对内含子、外显子、基因长度、非编码RNA、重复序列等基因组信息均进行分类统计,外显子40 110个,总长19 787 286 bp,内含子26 281个,总长2 290 434 bp,多数基因长度为500~1 499 bp,tRNA 333个,rRNA 71个,sRNA 69个,snRNA 31个,miRNA 108个,共预测的重复序列1 713 918 bp,占基因组4.2033%。比较基因组学分析发现木贼镰孢菌组装结果较好,特有基因3 483个和共有基因1 805个,并对共有基因进行了COG分类注释。基因家族分析发现2 500多个单拷贝同源基因。构建进化树发现木贼镰孢菌和假禾谷镰孢菌的遗传距离最近,在全基因组水平上确定了其进化地位。本研究为基因表达的调控机制、基因功能演化分析、病害防控等研究提供基础的数据。     

棉铃虫膨胀线粒体基因组的鉴定与分析

以已公布的棉铃虫线粒体DNA序列对来自4头棉铃虫雄蛹的DNA的三代测序数据进行筛选,获得了11条与线粒体DNA有同源性的三代read序列,并根据其中的read 66003鉴定出了一种膨胀的线粒体基因组。该线粒体基因组大小为27 113 bp,其保守区域包含13个蛋白编码基因、2个rRNA基因、22个tRNA基因以及1个AT富集区,与已公布的棉铃虫线粒体基因组的结构相似。膨胀区域位于cox1基因编码区内部,大小为11 467 bp,经预测含有一个完整的真核基因(依赖ATP的RNA解旋酶)以及多种转座元件的片段,但与线粒体DNA无同源性,也无I类或Ⅱ类内含子存在的证据。对田间和室内棉铃虫DNA样品的PCR扩增未能检测到膨胀线粒体基因组的存在。以上结果表明膨胀片段可能是细胞核DNA序列通过偶然的水平转移事件而整合到线粒体基因组中的,且该种膨胀方式的发生概率极低。本文报道的膨胀线粒体基因组为日后动物线粒体基因组学的研究提示了一种独特的变异方式。     

绿僵菌蝗虫菌株Pr1蛋白酶基因的克隆及序列分析

从绿僵菌蝗虫菌株M2189克隆了昆虫表皮降解酶Pr1的基因。以特异性引物，分别进行了DNA-PCR和mRNA-RT-PCR反应，得到了预期扩增片段，回收纯化后通过pGEM-T载体转化大肠杆菌JM109，得到重组质粒，EcoR Ⅰ酶切鉴定表明目的片段已插入质粒。对重组质粒中插入的DNA片段进行了核苷酸序列测定，表明该序列全长1369bp，其中有3个内含子，分别为76、59、67bp；编码序列长度为1167bp，含有起始密码子和终止密码子，是一个完整的蛋白读码框。与菌株Mel得到的Prl编码序列（GenBank／M73795）相比，二者的核苷酸数目相同，同源性达到92．2％，编码的389个氨基酸中48个不同，占12．3％。     

南方水稻黑条矮缩病毒湖南分离物S9片段ORF序列分析

本文克隆了湖南省2011-2013年水稻的15个SRBSDV分离物S9两个基因,并测定了其核苷酸序列,序列分析与比较表明,S9两个ORF序列同源性均大于99.5%。突变位点分析表明,S9编码的两个ORF有3~9个突变位点,但大部分的核酸突变为无义突变。系统发育分析表明,S9编码的两个ORF高度同源,处于相同的的系统发育分支。     

Characterization of the cytochrome b gene fragment of Puccinia species responsible for the binding site of QoI fungicides

The fragment of the cytochrome b (cyt b) gene responsible for the binding site of QoI fungicides was sequenced for different Puccinia species by using DNA and RNA as template for PCR and RT-PCR, respectively. Degenerated primers for the cyt b gene amplified in P. recondita f.sp. tritici a 450 bp fragment, which was cloned and sequenced. At cDNA level, several Thermal Asymmetric InterLaced (TAIL)-PCR cycles were needed to produce a 996 bp long fragment, which corresponded to almost the whole cyt b gene (about 1160-1180 bp, without introns). This fragment was sequenced and specific primers were designed. Amplification with cyt b specific primers using genomic DNA as template revealed the presence of an intron of about 1500 bp length after the codon for glycine at amino acid position 143. By using the same primer pair, the cyt b gene fragment was amplified and sequenced both at cDNA and genomic DNA level also for other rust species, including P. graminis f.sp. tritici (length: 506 bp), P. striiformis f.sp. tritici (755 bp), P. coronata f.sp. avenae (644 bp), P. hordei (660 bp), P. recondita f.sp. secalis (687 bp), P. sorghi (709 bp), and P. horiana (478 bp). At the same position as for P. recondita f.sp. tritici, an intron of about 1500-1600 bp length was detected also in all other Puccinia species. High homologies were observed among all Puccinia species for both the exonic and intronic fragments of the cyt b gene. Specific primers for the cyt b gene of all eight Puccinia species were developed, which easily amplified the fragment of the gene including all possible mutations known to confer resistance to QoIs in several plant pathogens. However, in all tested isolates of the Puccinia species included in this study, the sequence of cyt b gene fragment did not contain any point mutations.     

青花菜抗坏血酸过氧化物酶基因BoAPX2的克隆与表达分析

 抗坏血酸过氧化物酶（Ascorbate peroxidase,APX）是H₂O₂清除剂,在植物抗逆反应中起着重要作用。根据NCBI发布的过氧化物体抗坏血酸过氧化物酶（Peroxisomal APX, pAPX）基因序列设计简并引物,分别以青花菜（Brassica oleracea var. italica）叶片DNA和cDNA为材料进行PCR扩增,克隆到一个APX基因,命名为BoAPX2,序列提交GenBank,登录号为JN172929。BoAPX2的基因组序列长为2 013 bp,具有8个内含子,编码区全长864 bp,编码287个氨基酸。序列分析结果表明,BoAPX2与已知的过氧化物体APX有较高的相似性,氨基酸的C端具1个跨膜结构域。RT-PCR结果表明,BoAPX2的表达受霜霉病菌（Hyaloperonospora parasitica）、H₂O₂、水杨酸和NaCl诱导。     

Analysis of two acetylcholinesterase genes in Bombyx mori

Two acetylcholinesterases (AChE, EC 3.1.1.7) cDNAs were identified and cloned from silkworm, Bombyx mori. One of those, BmAChE-o cDNA, is comprised of 3197 nucleotides which encode 638 amino acids, having an amino acid sequence homology of 72% with Drosophila melanogaster Ace-orthologous AChE (AO-AChE). In some species, another AChE group based on the sequence, Drosophila Ace-paralogous AChE (AP-AChE) has been recognized in relation to organophosphate- or carbamate-resistance, but there have been few reports of AP-AChE among lepidopteran species. However, we isolated the AP-AChE from lepidopteran silkworm, and cloned full ORF as BmAChE-p, which cDNA consisted of 2465 nucleotides that encode 683 amino acids. The homologies with other AP-AChEs were over 60% when compared. Although silkworm is not a target of pesticides, the genomic information obtained in this study will contribute to insecticide-resistance study on lepidopteran pest species.     

建兰胶孢炭疽菌ITS序列分析及其PCR快速检测

由胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides引起的炭疽病是建兰的重要病害.为建立快速检测该病原菌的方法,以ITSl/ITS4为引物,对15个建兰胶孢炭疽菌的ITS进行PCR扩增及测序,将测定的序列与炭疽菌属其它种的ITS序列进行比对分析,设计特异性引物CFl/CR1,并通过常规和巢式PCR对建兰胶孢炭疽菌进行检测.结果显示,15个菌株中有13个菌株ITS序列与该菌的模式种序列相似性高达99％以上,而另外2个菌株相似性则为86％;供试菌株在系统发育树上聚为2个不同的分支;引物CFl/CR1通过常规PCR可从1 ng的建兰胶孢炭疽菌基因组DNA中扩增到目的条带,而利用引物ITSl/ITS4和CF1/CR1通过巢式PCR可从1 pg的基因组DNA中扩增到目的条带,即巢式PCR反应检测灵敏度较常规PCR至少高1 000倍.表明建立的巢式PCR法可从自然感病的建兰叶片组织中检测到胶孢炭疽菌.     

芽胞杆菌CQBS03抑菌蛋白TasA基因的克隆及原核表达

为了探讨柑桔溃疡病生防菌芽胞杆菌Bacillus CQBS03菌株TasA基因的功能,采用PCR方法从CQBS03基因组DNA中扩增出编码TasA基因的全长DNA序列,并构建pEASY-E1/TasA原核表达载体,经大肠杆菌Escherichia coli表达获得TasA基因的融合表达蛋白,纸碟法检验融合蛋白对柑桔溃疡病菌Xanthomonas citri citri的抑制作用。结果显示,CQBS03菌株的TasA基因包含1个786 bp的完整开放阅读框（GenBank登录号为JQ309841）,编码261个氨基酸残基;该序列与来源于解淀粉芽胞杆菌B.amyloliquefaciens的1个已知同源TasA基因序列FJ713580的相似性达99.75%。原核表达产物经SDS-PAGE分析,检测到约31 kD的融合蛋白;纯化后的融合蛋白对柑桔溃疡病菌有明显的抑制作用,72 h后抑菌圈直径达11.5 mm。研究表明TasA基因是生防菌芽胞杆菌CQBS03抑制柑桔溃疡病菌的功能基因之一,并且该基因对原核表达宿主没有抑制作用,具有较好的开发利用前景。     

水稻黑条矮缩病毒外壳蛋白基因的克隆、原核表达及抗体制备

为探讨水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV）的种群变异,采用RT-PCR方法从感染RBSDV山东分离物RBSDV-JN1的水稻中克隆该病毒的S10片段,并进行序列分析,进而构建包含RBSDV-JN1的CP基因的原核表达载体,导入大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）诱导表达;并以表达的融合蛋白为抗原,制备病毒的多克隆抗体。结果显示：S10片段全长为1 801 bp,包含1个1 677 bp编码框,编码558个氨基酸的外壳蛋白（CP）;与GenBank已注册的19个RBSDV的CP基因序列相比较发现,病毒各分离物间核苷酸的序列相似性为90.5%~99.8%,氨基酸的序列相似性为95.9%~100.0%;地理位置较近的分离物间序列相似性较高,RBSDV种群分布呈现区域性差异。原核表达载体pET-RBSDV-CP经IPTG诱导,获得了分子量约为63 kD带有His标签的目的蛋白。用该蛋白制备的多克隆抗体经ELISA、Western blot和Dot-blot ELISA检测显示,效价为1：81 000,且具有良好的特异性。     

Molecular characterization of two acetylcholinesterase genes from the brown planthopper, Nilaparvata lugens (Hemiptera: Delphacidae)

Acetylcholinesterase (AChE), which is encoded by the ace gene, catalyzes the hydrolysis of the neurotransmitter acetylcholine to terminate nerve impulses at the postsynaptic membrane. AChE is a primary target of many insecticides including organophosphates (OP) and carbamates (CB). In this study, full-length cDNA sequences of two ace genes (Nlace1 and Nlace2) were sequenced from the brown planthopper (BPH) Nilaparvata lugens, the most destructive insect pest of rice crops. Nlace1 cDNA is 2842 nucleotides long and contains an ORF potentially encoding a 790 amino acid peptide. Nlace2 cDNA is 2852 bp in length and contains an ORF that potentially encodes a 672 amino acid peptide. NlAChE1 has an identity of 40% with NlAChE2 at the amino acid sequence level. Phylogenetic analysis of 59 AChEs from 32 animal species showed that NlAChE1 is most closely related to AChE1s from Blattella germanica and Nephotettix cincticeps, while NlAChE2 is most closely related to AChE2 from N. cincticeps. Quantitative RT-PCR analysis showed that Nlace1 is expressed at a much higher level than Nlace2 in all developmental stages and tissues, demonstrating that NlAChE1 may be the dominant AChE form of the two enzymes. This result will help reveal the resistance mechanism of N. lugens to organophosphorous and carbamate insecticides and promote development of more selective insecticides targeting the main NlAChE1.     

南方根结线虫伴生细菌宏基因组fosmid文库构建及其特征分析

为了研究南方根结线虫与伴生细菌的互作及其伴生细菌多样性,采用碘海醇介质离心技术、SDS裂解法和酚/氯仿抽提法等构建了南方根结线虫Meloidogyne incognita伴生细菌宏基因组fosmid文库,并进行文库特征分析.结果表明,该文库包含3万个克隆,插入片段大小分布在30～45kb之间,平均长度为40kb左右;共计包含1171 Mb DNA;质粒在fosmid传代中稳定遗传,没有发现插入片段的丢失或重排.末端测序结果显示,文库中南方根结线虫序列占2.04%,细菌序列占44.90%,无同源序列占53.06%;南方根结线虫伴生细菌优势种群为Sphingopyxis属和代尔夫特菌属Delftia.     

南疆温室番茄黄化曲叶病病毒种类的分子鉴定

为明确南疆温室番茄黄化曲叶病的病毒种类,利用双生病毒的兼并引物通过PCR扩增,对采集的20个番茄病株进行了分子检测.从20个病株中均扩增到约500 bp的目标片段,对其中4株进行克隆和测序,其相互间序列同源性为97.1％ ～99.3％,与番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)的同源性较高,为98.6％ ～ 99.5％.随机选取莎车分离物KS2-5进行全基因组的克隆和测序,KS2-5 DNA全长为2781 nt(序列号:JQ807735),具有典型的双生病毒基因组特征,与TYLCV其它分离物同源性达到98.9％～99.5％,而与其它粉虱传双生病毒的序列同源性较低,为68.3％ ～75.5％,表明危害南疆温室番茄的病毒种类为番茄黄化曲叶病毒TYLCV.