牦牛α1-珠蛋白基因的克隆和序列分析

根据α-珠蛋白基因起始密码子上游及终止密码子下游的保守序列设计引物，以牦牛基因组DNA为模板克隆并测定了α-珠蛋白基因序列。结果表明，所测的氨基酸序列与牦牛α-珠蛋白链的氨基酸序列完全相同，即为牦牛α1-珠蛋白基因，长706bp，编码141个氨基酸。通过与其他物种的同源性比较，发现牦牛α1-珠蛋白基因的核苷酸序列与黄牛和水牛的同源性分别为99．71％和98．58％，与山羊、绵羊、人和马的同源性只有96．0：3％、95．57％、68．55％和51．13％；氨基酸序列与黄牛和水牛的同源性分别为99．29％和96．45％，与山羊、绵羊、人和马的同源性只有92．90％、91．49％、87．23％和87．23％，说明牛亚科α-珠蛋白基因在进化上高度保守。同时发现第254位的碱基A为牦牛α1-珠蛋白基因所特有。牦牛的两个α1-珠蛋白基因长度相等，都为706bp，且间距为2．47kb，距离比山羊的远。     

牦牛2个α-珠蛋白基因在染色体上排列顺序的确定

本试验扩增并克隆测定了牦牛2个α-珠蛋白基因间区域的序列.根据所测结果及人、鼠、山羊、马和黄牛的α-珠蛋白基因序列比对中的保守区设计了2对特异性引物,扩增并克隆测定了牦牛α-珠蛋白的上、下游基因序列.将测定的牦牛α-珠蛋白基因间区域序列进行同源性搜索,发现没有任何一个基因与它同源.上、下游基因的测序结果表明,上游基因为牦牛α1-珠蛋白基因,下游基因为α2-珠蛋白基因.这表明牦牛的2个α-珠蛋白基因在染色体上紧密排列,其中α1-珠蛋白基因在前,α2-珠蛋白基因在后.     

麦洼牦牛和九龙牦牛乳蛋白遗传多态性的研究

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对109头麦洼牦牛和100头九龙牦牛乳蛋白多态性进行分型，并采用最小二乘法分析乳蛋白多态性与泌乳性能及乳蛋白组分之间的相关性。结果表明：β-CN、κ-CN和α-La呈单态，基因型分别为AA、BB和BB型；而αs1-CN和β—Lg呈多态，αs1-CN D基因为优势基因，在麦洼牦牛和九龙牦牛中的频率分别为0．8073和0．600O，β—Lg座位优势基因为β-Lg E，在麦洼牦牛和九龙牦牛中的频率分别为O．977O和O．970O；麦洼牦牛和九龙牦牛群体平均杂合度分别为0．1021和0．1867；在2个品种牦牛群体中，除αs1-CN基因座对九龙牦牛乳脂率有显著影响外，其余乳蛋白基因座对泌乳性能及乳蛋白相对百分含量均无显著影响。     

牦牛Cygb基因的克隆及序列分析

【目的】对牦牛Cygb基因进行克隆与序列分析,为进一步深入研究Cygb基因在牦牛对低氧环境适应性中的作用提供理论基础。【方法】参照GenBank中牛的Cygb基因序列设计引物,提取牦牛肝组织RNA,以反转录合成的cDNA为模版,克隆牦牛Cygb基因并进行测序,运用生物信息学软件对所得序列进行分析。【结果】牦牛Cygb基因编码区全长573bp,编码190个氨基酸,编码产物分子质量21.5ku,理论等电点为6.61。蛋白预测表明,Cygb编码蛋白整体表现为亲水性,蛋白质的二级结构主要由α螺旋及延伸链构成。同源性分析表明,11条序列当中牦牛与牛、绵羊等物种具有较高的同源性,在系统发育树中距离最近,其中牦牛与牛的同源性最高,达到99.0%。【结论】克隆到573bp的牦牛Cygb基因编码区全长序列,该序列在哺乳动物中具有很高的保守性。     

天祝白牦牛三个功能基因部分序列的PCR-RFLP研究

采用PCR—RFLP技术，检测了天祝白牦牛αS1酪蛋白(αS1-casein，αS1-CN)基因、κ-酪蛋白(κ-casein，κ-CN)基因和生长激素(growth hormone，GH)基因部分序列的遗传多态性。结果表明，天祝白牦牛群体中αS1-CN基因PCR—RFLP位点呈单态；κ—CN基因和GH基因两个PCR—RFLP位点均呈多态性。κ—CN基因PCR—RFLP位点等位基因A和B的基因频率分别为0．0745和0．9255，GH基因PCR—RFLP位点等位基因A和B的基因频率分别为0．1277和0．8723；该3个位点平均基因一致度和基因多样度分别为0．8798和0．1202。     

美国红鱼珠蛋白链的分离及其α-和β-珠蛋白基因的克隆

通过含Triton X～100的酸性聚丙烯酰胺电泳法从美国红鱼（Sciaenopes ocellatus）血液中分离到4条β-珠蛋白链和2条α-珠蛋白链，其中β1和β1链是主要β-珠蛋白链．α，链是主要α-珠蛋白链。美国红鱼α-珠蛋白基因cDNA开放读码框由435个核苷酸组成，编码144个氨基酸的多肽。与大黄鱼α-珠蛋白一样．美国红鱼α-珠蛋白在C与E螺旋间隔区也插入了一个独特的甘氨酸残基。美国红鱼β1-珠蛋白基因cDNA开放读码框由447个核苷酸组成，编码148个氨基酸的多肽。美国红鱼α-和β-珠蛋白基因拥有典型的珠蛋白基因结构，由3个外显子组成，中间间隔着2个内含子。美国红鱼β-珠蛋白基因内含子1有一段TTA重复序列，此序列插入可能使内含子原有的功能发生改变或丧失。     

中国牦牛β-珠蛋白基因的克隆和序列分析

根据黄牛β-珠蛋白基因的序列设计引物,扩增了中国牦牛的β-珠蛋白基因,并对其进行了克隆测序和氨基酸序列比较分析。结果显示,其与黄牛β-珠蛋白基因的同源性很高,达到97%以上;检测到中国牦牛β-珠蛋白基因的2个等位基因7β3A sn和1β35A sn,其中67号牦牛个体中检测到2个等位基因7β3A sn和1β35A sn,64号牦牛个体中检测到等位基因1β35A sn,1078号牦牛个体中检测到等位基因7β3A sn;等位基因1β35A sn是中国牦牛特有的一个等位基因,推测该等位基因编码的第135位氨基酸天冬酰胺,可能会降低牦牛血红蛋白的氧亲和力。     

天祝白牦牛αs1-酪蛋白基因和κ-酪蛋白基因的PCR-RFLP研究

利用PCR—RFLP技术熏检测了天祝白牦牛αS1-酪蛋白(αS1-casein,αS1-CN)基因和κ-酪蛋白(κ-casein,κ-CN)基因部分序列的遗传多态性熏结果表明:天祝白牦牛群体αS1-CN基因表现单态,κ-CN基因存在遗传多态性。κ-CN基因PCR-RFLP位点等位基因A和B的基因频率分别为0.0745和0.9255。κ-CN基因PCR-RFLP位点的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定理(P>0.05)。天祝白牦牛群体内平均基因一致度、基因多样度和有效等位基因数分别为0.9311、0.0689和1.0739。     

天祝白牦牛KA P1.1 基因的克隆及生物信息学分析

以牦牛的角蛋白关联蛋白1.1（KAP1.1）基因为研究对象,根据GenBank收录的黄牛KAP1.1基因的mRNA序列（登录号:NM₀01105369.1）设计特异性引物,通过反转录PCR、PCR以及克隆方法首次获得牦牛的KAP1.1完整CDS区,将所得序列提交到NCBI,登录号为KJ095199,并对其进行生物信息学分析。结果表明,牦牛KAP1.1基因的CDS区全长为501bp,共编码166个氨基酸;编码的蛋白质属于亲水性蛋白质。二级结构含有α螺旋区、延伸链、β转角和无规卷曲4种。氨基酸序列与黄牛的同源性最高,具有High sulphur keratin-associated protein家族蛋白的完整结构域。     

中国牦牛乳蛋白遗传多态性及其与泌乳性能相关性研究

 利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)对109头麦洼牦牛和100头九龙牦牛乳蛋白多态性进行分型,并采用最小二乘法分析乳蛋白多态性与泌乳性能及乳蛋白组分之间的相关性。结果表明,β-CN、κ-CN和α-La呈单态,基因型分别为AA、BB和BB型;而αs1-CN和β-Lg呈多态,αs1-CN 的D基因为优势基因,在麦洼牦牛和九龙牦牛中的频率分别为0.8073和0.6000, β-Lg座位优势基因为β-Lg E,在麦洼牦牛和九龙牦牛中的频率分别为0.9770和0.9700;麦洼牦牛和九龙牦牛群体平均杂合度分别为0.10     

牦牛FABP3基因克隆及组织表达谱分析

【目的】 分析牦牛心肌脂肪酸结合蛋白3（FABP3）基因的结构和功能，并检测其在成年牦牛和胎牛中的表达水平，为探究该基因在牦牛育种中的生物学功能提供理论参考。【方法】以美仁牦牛的心脏组织为试验材料，PCR扩增FABP3基因，对得到的编码区序列（CDS）进行生物信息学分析；利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR），检测FABP3基因在成年牦牛和胎牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及肌肉组织的表达水平。【结果】牦牛FABP3基因编码区序列长度为402 bp，编码133个氨基酸；蛋白质的高级结构主要是β 转角和延伸链；牦牛FABP3蛋白不存在跨膜区域和信号肽，属于具有一定亲水性的稳定蛋白；牦牛FABP3基因CDS区核苷酸及其编码氨基酸序列的同源性分析显示，FABP3基因在牛属动物中具有一定的保守性；系统进化树分析表明，牦牛与野牦牛和瘤牛的亲缘关系最近，与鸡的亲缘关系最远。RT-qPCR结果显示，FABP3基因在成年牦牛和胎牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及肌肉组织中均有表达，但在胎牛肝脏、脾脏、肾脏和肌肉中的表达水平显著或极显著高于成年牦牛，在成年牦牛肺脏中的表达水平极显著高于胎牛。【结论】克隆了牦牛FABP3基因，探究了FABP3基因在牦牛中的组织表达规律，为进一步研究该基因在牦牛脂肪沉积中的作用提供了基础数据。     

天祝白牦牛MSTN基因编码区克隆及生物信息学分析

为探讨天祝白牦牛MSTN基因的分子结构特征,通过PCR扩增和测序技术以及生物信息学分析工具对天祝白牦牛MSTN基因进行克隆、测序及相关生物信息学分析。结果表明,天祝白牦牛MSTN基因编码区序列全长1 128 bp,编码375个氨基酸残基;天祝白牦牛MSTN基因编码蛋白分子量42.55 ku,理论等电点为6.14;生物信息学预测发现,天祝白牦牛MSTN蛋白是不稳定的亲水蛋白,mRNA二级结构的最小自由能为-1 135.16 k J·mol~(-1),蛋白质二、三级结构均是以无规卷曲和延伸链为主的混合型蛋白。天祝白牦牛MSTN基因的成功克隆为进一步研究牦牛MSTN的遗传特性和生理机制奠定了基础。     

水牛α-清蛋白基因3’端调控区的PCR克隆及序列分析

对水牛α-乳清蛋白基因的3’端调控区进行了PCR扩增及重组质粒的酶切鉴定,比较了水牛和牦牛该基因的核苷酸序列同源性。序列分析结果表明：水牛α-乳清蛋白基因3’端序列与牦牛该基因在641bp的序列中存在34bp的差异,同源性为94．69％。     

美仁牦牛Akirin1基因克隆及在不同组织中的表达

【目的】Akirin1基因是调控成肌细胞分化的关键基因，克隆美仁牦牛Akirin1基因编码区（CDS）序列进行生物信息学分析，并检测该基因在各组织间的表达特征，为研究调控牦牛肌肉生长的基因功能提供理论依据。【方法】利用RT-PCR技术克隆美仁牦牛Akirin1基因CDS区序列，通过生物信息学软件分析蛋白理化性质和结构，预测蛋白信号肽和磷酸化位点及构建系统进化树；通过qPCR技术检测Akirin1基因在美仁牦牛成年牛各组织间及胎牛肌肉中mRNA的表达水平。【结果】美仁牦牛Akirin1基因CDS区全长579 bp，编192个氨基酸，蛋白相对分子质量为21 879.86 u，理论等电点8.91，总平均亲水性-0.822，为亲水性蛋白；系统进化树表明：美仁牦牛与普通牛和印度水牛亲缘关系最近，同源性分别为100%、98.44%;Akirin1蛋白有29处磷酸化位点，无信号肽和跨膜区，主要在细胞核中发挥生物学功能；美仁牦牛Akirin1蛋白主要是由α-螺旋和无规则卷曲组成。Akirin1基因在美仁牦牛脂肪组织中表达量最高，与其他组织比较差异显著（P<0.05），且肌肉和心脏组织中的表达量最...     

类乌齐牦牛ACTA1基因克隆、分子特性及差异表达分析

【目的】骨骼肌α肌动蛋白1(actin alpha 1, ACTA1)主要参与骨骼肌纤维的发育,在骨骼肌活动中发挥重要作用。本试验主要扩增类乌齐牦牛ACTA1基因的cDNA序列,检测ACTA1基因在类乌齐牦牛不同组织中mRNA水平的表达规律。【方法】采用RT-PCR方法扩增并克隆类乌齐牦牛ACTA1基因CDS区;通过在线软件对其一级结构、二级结构、三级结构进行生物信息学分析;利用核苷酸序列及氨基酸序列进行同源性和系统进化树分析;应用RT-qPCR技术检测ACTA1基因在类乌齐牦牛不同组织中的表达模式。【结果】类乌齐牦牛ACTA1基因编码区全长1134 bp,结构稳定,共编码377个氨基酸。生物信息学分析发现,类乌齐牦牛ACTA1基因编码的蛋白质是一种结构较稳定、带负电的亲水性蛋白,二、三级结构以α-螺旋为主,包含2个明显的跨膜区域,无信号肽,属胞内蛋白。保守结构域中含有明显的NDB区域,蛋白结构高度保守。同源性分析表明,类乌齐牦牛与水牛ACTA1基因的核苷酸及氨基酸同源性均较高。系统进化树分析显示,类乌齐牦牛与水牛亲缘关系最近,黄牛次之。实时荧光定量PCR结果显示,ACTA1基因在臀肌和大脑高表达。【结论】获得类乌齐牦牛ACTA1基因的CDS区全长1134 bp,ACTA1基因在类乌齐牦牛肌肉和大脑组织中显著表达,为进一步研究分析ACTA1基因在调控牦牛肌肉发育及机制等方面奠定基础。     

水牛α-清蛋白基因3′端调控区的PCR克隆及序列分析

对水牛α-乳清蛋白基因的3′端调控区进行了PCR扩增及重组质粒的酶切鉴定,比较了水牛和牦牛该基因的核苷酸序列同源性.序列分析结果表明:水牛α-乳清蛋白基因3′端序列与牦牛该基因在641 bp的序列中存在34 bp的差异,同源性为94.69%.     

牦牛POMC基因的克隆及生物信息学分析

为探讨工布江达牦牛POMC基因的分子结构特征,通过分子克隆技术获得工布江达牦牛POMC基因全序列,采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、信号肽、二级结构等进行预测与分析。结果表明,工布江达牦牛POMC基因包含1个798bp的开放阅读框,编码265个氨基酸,其编码蛋白属于亲水性蛋白,具有明显的信号肽,二级结构主要以无规卷曲和α-螺旋为主。以POMC基因构建的邻接系统发育树表明,工布江达牦牛POMC与野牦牛、普通黄牛、水牛和羊等品种的POMC遗传距离较近,具有高度同源性。     

长期慢性低氧对牦牛和黄牛血液中HIF-2α、 EPO水平及红细胞相关指标的影响

为探讨牦牛和迁饲黄牛血液中红细胞(RBC)、血红蛋白(HB)、低氧诱导因子-2α(HIF-2α)、促红细胞生成素(EPO)等因子对高原适应和习服的不同特征及调控机理,按照海拔低于3 500m和高于3 500m两组采集青海地区的牦牛血样,同时采集高山迁饲黄牛(海拔2 500m)及低海拔黄牛(海拔1 300m)血液,采用全自动血液分析仪测定血液中红细胞、血红蛋白、红细胞比容(HCT)、平均红细胞血红蛋白量(MCH)等;采用双抗夹心酶标法测血液中EPO、HIF-2α含量。通过t检验及单因素方差分析法分析指标间的差异性,并分析各指标与HIF-2α、EPO的相关性。结果表明,海拔高于3 500m牦牛组的RBC、HB、HCT显著升高,而HIF-2α和EPO水平却未发生显著变化。与迁饲黄牛和低海拔黄牛相比,牦牛血液中的RBC明显降低,而MCH、HIF-2α和EPO显著升高。牦牛血液中EPO、RBC、HB、HCT、MCH水平与HIF-2α水平呈显著相关;迁饲黄牛血液中红细胞分布宽度(RDW-SD)与EPO水平呈显著相关;低海拔黄牛血液EPO、MCH水平与HIF-2α水平呈显著相关。推测:海拔升高引起的低氧是影响牦牛血液RBC、HB、HCT改变的主要因素;与黄牛相比,低RBC、低MCH、高HIF-2α、高EPO水平是牦牛适应低氧的主要特征,且牦牛血细胞各指标对血液中HIF-2α水平的改变更敏感。提示牦牛通过遗传进化成功适应高原环境。     

牦牛DQA2基因单核苷酸多态性及其生物信息学分析

利用基因组DNA混合池扩增产物直接测序的方法对55头牦牛DQA2基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)进行分析,并利用生物信息学软件预测分析了SNP位点对DQA2基因mRNA和蛋白质二级结构的影响。结果显示:牦牛DQA2基因多态性较高,共检测到14个SNP位点,仅有1个SNP位点位于内含子1上,其余13个均位于外显子区域,其中,9个SNP位点为错义突变,导致相应氨基酸发生改变。二级结构预测结果表明:8个SNP位点增大了mRNA二级结构的稳定性,4个位点降低了mRNA二级结构的稳定性。错义突变SNP位点均改变了牦牛DQA2蛋白质二级结构,突变前后二级结构各组分中无规则卷曲所占比例最高,其次为延伸链,β-转角的比例最低。研究结果为探究牦牛主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)基因的致病机制和免疫机制提供了有利条件,也为筛选牦牛抗病分子标记提供了理论基础。     

牦牛MPC1和MPC2基因克隆及其组织表达特征分析

【目的】明确牦牛线粒体丙酮酸载体编码基因（MPC1和MPC2）的分子生物学特性及其组织表达特征,为揭示MPC基因在牦牛适应高原环境和能量代谢中的作用机制提供理论依据。【方法】选取麦洼牦牛为研究对象,PCR扩增牦牛MPC1和MPC2基因编码区（CDS）序列,利用在线生物信息学分析软件预测其蛋白结构及理化性质,并以实时荧光定量PCR检测MPC1和MPC2基因在不同年龄（0.5、1.5和2.5岁）牦牛各组织中的表达情况。【结果】牦牛MPC1基因CDS序列长330 bp,共编码109个氨基酸残基;MPC2基因CDS序列长384 bp,共编码127个氨基酸残基。基于MPC1和MPC2基因CDS序列相似性构建的系统发育进化树显示,牦牛分别与黄牛和水牛的亲缘关系最近,与绵羊的亲缘关系最远。牦牛MPC1和MPC2蛋白均为稳定的亲水性蛋白,丙氨酸和亮氨酸含量较高,有跨膜结构但无信号肽,均存在1个MPC结构域;其二级结构以α-螺旋为主（分别占57.80%和55.12%）,三级结构模型为5xpd.1.A。MPC1和MPC2基因在2.5、1.5和0.5岁牦牛心脏中的相对表达量均最高,其次是肾脏和肝脏,而在脾脏...