十字花科黑腐病菌编码RNA聚合酶ω亚基的基因(rpoZ_(Xcc))突变导致细胞生长减慢

ω(Omega)亚基是组成细菌RNA聚合酶(RNA polymerase,RNAP)核心酶的5个亚基(2α、β、β′andω)中最小的一个,也是5个亚基中唯一可以去除而不会导致细胞死亡的亚基。尽管ω亚基存在于所有细菌中并且序列非常保守,但迄今为止,人们对ω亚基的功能却知之甚少。基因组注释结果表明,十字花科黑腐病菌8004菌株(Xanthomonas campestris pv.campestris strain 8004,简称Xcc8004)基因组中存在一个编码ω亚基的基因rpoZXcc(ORF编号为XC0957)。为了研究Xcc RNA聚合酶ω亚基的功能,采用自杀质粒pK18mob整合突变方法,构建了rpoZXcc基因的非极性突变体NK0957。表型检测结果显示,NK0957在基本培养基MMX和丰富培养基NYG中的生长比野生型菌株Xcc8004的生长明显减慢,而且NK0957的生长缓慢表型能被rpoZXcc反式互补。这些结果说明,ω亚基在Xcc的生长过程中发挥重要作用。     

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种一个新的致病相关基因的克隆和鉴定

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xcc)是十字花科植物重要的病原菌,能引起十字花科作物发生黑腐病.本课题组采用转座子Tn5gusA5对Xcc野生型菌株8004诱变,获得17280株Tn5gusA5突变体,并从中筛选到一批致病缺陷突变体,采用TAIL-PCR对致病缺陷突变体的Tn5gusA5插入位点进行定位,发现5株突变体的Tn5gusA5插在8004菌株的基因组ORF1857内(未发表资料), 该ORF功能尚未见报道.序列分析表明,ORF1857演绎的编码产物与铜绿假单胞菌(Pseudomonase aeruginosa)的wbpL基因演绎的编码产物具有33%的一致性和45%的相似性,并具有第4家族的糖基转移酶功能域,因此本文暂将ORF1857命名为wbxL基因.对 wbxL基因进行缺失,获得的缺失突变体用剪叶法接种到寄主萝卜叶片时,缺失突变体完全丧失致病性,一段PCR合成的包含wbxL基因的DNA片段能互补缺失突变体,恢复缺失突变体的致病性.这证实wbxL基因是Xcc的一个新的致病相关基因.     

十字花科黑腐病菌编码RNA聚合酶ω亚基的基因（rpoZXcc）突变导致细胞生长减慢

ω（Omega）亚基是组成细菌RNA聚合酶（RNA polymerase,RNAP）核心酶的5个亚基（2α、β、β′andω）中最小的一个,也是5个亚基中唯一可以去除而不会导致细胞死亡的亚基。尽管ω亚基存在于所有细菌中并且序列非常保守,但迄今为止,人们对ω亚基的功能却知之甚少。基因组注释结果表明,十字花科黑腐病菌8004菌株（Xanthomonas campestris pv.campestris strain 8004,简称Xcc8004）基因组中存在一个编码ω亚基的基因rpoZXcc（ORF编号为XC0957）。为了研究Xcc RNA聚合酶ω亚基的功能,采用自杀质粒pK18mob整合突变方法,构建了rpoZXcc基因的非极性突变体NK0957。表型检测结果显示,NK0957在基本培养基MMX和丰富培养基NYG中的生长比野生型菌株Xcc8004的生长明显减慢,而且NK0957的生长缓慢表型能被rpoZXcc反式互补。这些结果说明,ω亚基在Xcc的生长过程中发挥重要作用。     

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种一个新的致病相关基因的克隆和鉴定

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xcc)是十字花科植物重要的病原菌，能引起十字花科作物发生黑腐病．本课题组采用转座子Tn5gusA5对Xcc野生型菌株8004诱变，获得17280株Tn5gusA5突变体，并从中筛选到一批致病缺陷突变体，采用TAIL-PCR对致病缺陷突变体的Tn5gusA5插入位点进行定位，发现5株突变体的Tn5gusA5插在8004菌株的基因组ORFl857内(未发表资料)，该ORF功能尚未见报道．序列分析表明，ORFl857演绎的编码产物与铜绿假单胞菌(Pseudomonase aeruginosa)的ωbpL基因演绎的编码产物具有33％的一致性和45％的相似性，并具有第4家族的糖基转移酶功能域，因此本暂将ORFl857命名为ωbxL基因．对ωbxL基因进行缺失，获得的缺失突变体用剪叶法接种到寄主萝卜叶片时，缺失突变体完全丧失致病性，一段PCR合成的包含ωbxL基因的DNA片段能互补缺失突变体，恢复缺失突变体的致病性．这证实ωbxL基因是Xcc的一个新的致病相关基因．     

野油菜黄单胞菌的XopR基因功能

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是一种能够引起十字花科植物产生黑腐病的重要病原菌。笔者以野油菜黄单胞菌Xcc8004菌株XopR基因为研究对象,通过qRTPCR发现,XopR基因的表达受Ⅲ型调控基因hrpG和hrpX的调控,并且XopR蛋白的分泌依赖于Ⅲ型分泌系统结构基因hrcV,这表明XopR是Xcc8004的一个Ⅲ型分泌效应蛋白。利用同源重组的方法,笔者获得了XopR基因的缺失突变体ΔXopR。将野生型Xcc8004和ΔXopR突变体分别接种甘蓝品种中甘15、中甘21和大白菜品种中白83,发现ΔXopR突变体菌株致病性下降,表明XopR对于Xcc8004在甘蓝上的完整毒性是必须的。GFP融合蛋白分析发现XopR定位于拟南芥原生质体的细胞膜上,可以在拟南芥原生质体中抑制细菌鞭毛蛋白诱导的FRK1基因表达。     

甘蓝黑腐病菌XC_3374基因功能的初步探究

【目的】初步探究XC_3374基因在甘蓝黑腐病菌Xcc8004中的功能,为深入研究甘蓝黑腐病菌Xcc8004中L-天冬酰胺酶的功能奠定基础。【方法】从KEGG数据库内获取XC_3374基因的旁侧序列,通过常规PCR对其进行克隆,同时利用自杀质粒pK18mobSacB通过同源双交换的方法构建了其缺失突变体DM3374并检测其表型。【结果】以引物D3374L-F/D3374R-R扩增,野生型菌株能够扩增出1789 bp的DNA片段,而候选突变体菌株能扩增出1367 bp的片段;以内部引物3374F/3374R扩增,野生型菌株能扩增出332 bp的片段,而候选突变体菌株不能扩增出任何片段,表明目标基因已缺失,缺失突变体DM3374构建成功。平板检测法结果表明,XC_3374基因突变后不影响胞外多糖及胞外酶的合成与分泌。在MMX基本培养基上,突变体菌株能够正常生长,形成的菌落大小与野生型菌株基本相同,表明缺失突变体不是营养缺陷性。游动平板检测结果表明, XC_3374缺失突变体的运动能力比野生型稍强,但差别不明显。采用剪叶法检测缺失突变体的致病性,结果表明,野生型Xcc8004和缺失突变体DM3374 病斑平均长度分别为13.000和11.983 mm,两者致病性无显著差异。【结论】XC_3374基因突变体在胞外多糖、几种胞外酶的合成与分泌、致病性等各种表型与野生型基本一致。     

甘蓝黑腐病菌XC_3374基因功能的初步探究

【目的】初步探究XC_3374基因在甘蓝黑腐病菌Xcc8004中的功能,为深入研究甘蓝黑腐病菌Xcc8004中L-天冬酰胺酶的功能奠定基础。【方法】从KEGG数据库内获取XC_3374基因的旁侧序列,通过常规PCR对其进行克隆,同时利用自杀质粒pK18mobSacB通过同源双交换的方法构建了其缺失突变体DM3374并检测其表型。【结果】以引物D3374L-F/D3374R-R扩增,野生型菌株能够扩增出1789 bp的DNA片段,而候选突变体菌株能扩增出1367 bp的片段;以内部引物3374F/3374R扩增,野生型菌株能扩增出332 bp的片段,而候选突变体菌株不能扩增出任何片段,表明目标基因已缺失,缺失突变体DM3374构建成功。平板检测法结果表明,XC_3374基因突变后不影响胞外多糖及胞外酶的合成与分泌。在MMX基本培养基上,突变体菌株能够正常生长,形成的菌落大小与野生型菌株基本相同,表明缺失突变体不是营养缺陷性。游动平板检测结果表明, XC_3374缺失突变体的运动能力比野生型稍强,但差别不明显。采用剪叶法检测缺失突变体的致病性,结果表明,野生型Xcc8004和缺失突变体DM3374 病斑平均长度分别为13.000和11.983 mm,两者致病性无显著差异。【结论】XC_3374基因突变体在胞外多糖、几种胞外酶的合成与分泌、致病性等各种表型与野生型基本一致。     

甘蓝黑腐病菌XC3374基因功能的初步探究

【目的】初步探究XC₃374基因在甘蓝黑腐病菌Xcc8004中的功能,为深入研究甘蓝黑腐病菌Xcc8004中L-天冬酰胺酶的功能奠定基础。【方法】从KEGG数据库内获取XC₃374基因的旁侧序列,通过常规PCR对其进行克隆,同时利用自杀质粒pK18mobSacB通过同源双交换的方法构建了其缺失突变体DM3374并检测其表型。【结果】以引物D3374L-F/D3374R-R扩增,野生型菌株能够扩增出1789bp的DNA片段,而候选突变体菌株能扩增出1367bp的片段;以内部引物3374F/3374R扩增,野生型菌株能扩增出332bp的片段,而候选突变体菌株不能扩增出任何片段,表明目标基因已缺失,缺失突变体DM3374构建成功。平板检测法结果表明,XC₃374基因突变后不影响胞外多糖及胞外酶的合成与分泌。在MMX基本培养基上,突变体菌株能够正常生长,形成的菌落大小与野生型菌株基本相同,表明缺失突变体不是营养缺陷性。游动平板检测结果表明,XC₃374缺失突变体的运动能力比野生型稍强,但差别不明显。采用剪叶法检测缺失突变体的致病性,结果表明,野生型Xcc8004和缺失突变体DM3374病斑平均长度分别为13.000和11.983mm,两者致病性无显著差异。【结论】XC₃374基因突变体在胞外多糖、几种胞外酶的合成与分泌、致病性等各种表型与野生型基本一致。     

野油菜黄单胞菌的HpaA基因功能

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.Campestris,Xcc)是使十字花科植物产生黑腐病的重要病原细菌。Xcc通过Ⅲ型分泌系统分泌效应蛋白到植物体内帮助Xcc的侵染和繁殖。Hpa A蛋白是一个广泛存在于黄单胞菌中的效应蛋白,在辣椒斑点病菌(Xanthomonas campestris pv.vesicatoria,Xcv)中,Hpa AXcv85-10已经被证明是一个Ⅲ型效应蛋白,并且参与其他效应蛋白的分泌过程,但是在Xcc中,对Hpa A的功能还不是了解得很清楚。本研究以Xcc8004菌株的Hpa A蛋白为研究对象,通过分泌蛋白检测和亚细胞定位分别研究Hpa AXcc8004是否也由Ⅲ型分泌系统分泌以及Hpa AXcc8004在植物细胞的作用部位。结果表明,Hpa AXcc8004的分泌依赖于Xcc8004的Ⅲ型结构基因hrc V,暗示着Hpa AXcc8004也是作为Ⅲ型分泌效应蛋白来发挥功能。在拟南芥原生质体细胞中,将Hpa AXcc8004与GFP蛋白融合表达,发现Hpa AXcc8004定位于植物细胞核中。进一步通过同源重组的方法获得了Xcc8004 Hpa A基因缺失突变体,在寄主甘蓝、萝卜、拟南芥上分别接种野生型Xcc8004和Hpa A基因缺失突变体,发现基因缺失突变体毒性显著降低,表明Hpa AXcc8004在上述寄主植物上对于Xcc8004的完整毒性是必须的。在Hpa A的拟南芥转基因植株上,Hpa AXcc8004还可以减弱假单胞菌DC3000和Xcc8004发黄的表型。     

柑橘溃疡病菌胞外蛋白水解酶对其致病力的作用

采用异源表达方法从柑橘黄单胞柑橘亚种(Xcc)中国菌株Xcc 29-1中鉴定出6个编码胞外蛋白水解酶的基因.运用同源重组方法将6个编码基因全部敲除,得到胞外蛋白水解酶缺失突变体,对其致病力、形成生物膜的能力和生长繁殖速度进行检测.结果显示,蛋白水解酶突变体在柑橘上的致病力减弱,并且附着到试管壁的细菌数量显著减少,形成生物膜的能力下降.在野生型菌株中过表达蛋白水解酶后,形成的溃疡病斑水渍状程度加大,在柑橘中的繁殖速度变快;在柑橘叶片中,6个胞外蛋白水解酶基因的转录水平都增强表达.这些结果表明Xcc的胞外蛋白水解酶是一个重要的致病因子.     

野油菜黄单胞菌重组克隆pIXU9278对黄原胶生物合成的影响

用ＰＩＪ３２００作为载体,构建了包含１５６２个重组克隆野生型野油菜黄单胞菌的粘粒文库,通过三亲交配法,基因文库中的重组克隆可以在ＰＲＫ２０１３的帮助下,从Ｅ．ｃｏｄｉ中以ＸＣＣＮＡＵ－９２中,绝大多数重线克隆对黄原胶合成无影响,但导致菌株生长缓慢,工程菌株ＸＣＣＮＡＵ－９２７８（ＰＩＸＵ９２７８）在２８℃、１２０ｔ／ｍｉｎ条件下发酵７２ｈ,产量达３７．５０ｇ／ｋｇ,发酵液度力为１４６００ｍＰａ．ｓ     

白菜型油菜亚种间杂种的合成

采用蕾期人工去雄与辅助授粉的方式,以白菜型油菜十月红菜薹和黄芽白进行正反交,以较高的频率获得了杂种后代。杂种后代叶型、株型和花等形态均表现为双亲的中间型。叶片颜色比黄芽白更深,均偏向十月红菜薹的紫红色;植株表现出较强的杂种优势,株高大于双亲,产生大量的分枝,角果数远多于双亲。杂种后代花器官发育正常,可育花粉为99%以上,且自交结实率较高。花粉母细胞减数分裂比较正常,95%的花粉母细胞在终变期所有染色体进行同源配对,形成10个二价体,减数第二次分裂中期有部分出现染色体落后现象。杂种后代极强的杂种优势和较好的自交结实性为进一步选育具有优良特性的新型白菜型油菜提供了可能。     

黄单胞菌葡萄糖转运系统相关基因的敲除及功能分析

分别敲除了植物病原体野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris pv. campestris 8004）的3个葡萄糖转运蛋白和2个葡萄糖脱氢酶,获得了5株相应基因敲除的突变体。在营养丰富的培养基中,这5株突变体的生长曲线、胞外纤维素酶活性和胞外多糖量与野生型相比并无显著差异。在以葡萄糖为唯一碳源的M63培养基中,XC_2460基因的敲除显著影响了黄单胞菌的生长;在以CMC作为唯一碳源的M63培养基中,XC_2460基因的敲除使突变体的胞外葡萄糖累积量达到野生菌株的167倍。这些结果首次显示阻遏葡萄糖的跨膜转运是改进纤维素分解菌株积累葡萄糖量的有益途径。     

不结球白菜BcGAPDH的生物信息学分析

采用生物信息学方法对克隆测序的不结球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis)Bc GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)蛋白质的理化性质、跨膜区、亲水性、亚细胞定位、所含模体及蛋白质结构进行了预测。理化性质分析表明,该酶含有328个氨基酸,相对分子量为35 161.2,p I值为9.03。TMpred跨膜分析表明,该酶没有跨膜螺旋区,这与Prot Scale预测的该酶为亲水性蛋白质相吻合。用Target P server程序预测该酶定位于线粒体上,结构域分析表明该酶含有多种磷酸化位点,二级结构以α-螺旋和随机卷曲为主。借助SWISS-MODEL软件对该酶进行了三维同源建模。     

几种杀菌剂对柑桔溃疡病的生物活性

为筛选防治柑桔溃疡病的有效药剂,按大田推荐使用浓度,用抑菌圈法测定17种非铜药剂和5种含铜药剂对柑桔溃疡病的毒力,并研究7种非铜药剂田间防治效果。结果表明,代森锰锌、福美双、福美双.溴菌腈、农用链霉素、金核霉素和琥胶肥酸铜.乙磷铝.硫酸锌抑菌作用最强,其次为福美双.福美锌、大蒜素、络氨铜.络氨锌和盐酸吗啉胍.乙酸铜,过氧乙酸、噻唑锌、春雷菌素、中生菌素、琥珀酸铜和噻菌铜有微弱的抑菌作用,百菌清、多菌灵、苯醚甲环唑、叶青双、复硝酚钠和井冈霉素无抑菌作用。大田试验结果表明,30%金核霉素WP 500 mg/L和72%农用链霉素WP 200 mg/L处理对柑桔溃病的防效分别为76.34%和74.94%,显著优于其它药剂处理;80%代森锰锌WP 2000 mg/L、50%福美双WP 400 mg/L和50%福美双.溴菌腈WP 500 mg/L处理对柑桔溃病的防效分别为70.36%、66.55%和69.37%,与对照含铜药剂20%噻菌铜SC 67 mg/L处理无显著差异;大蒜素和叶青双对柑桔溃病防效较差,6%大蒜素EC 120 mg/L和20%叶青双WP 400 mg/L处理对柑桔溃病的防效分别为41.84%和21.8...     

芸芥与白菜型油菜远缘杂交亲和性研究

芸芥与白菜型油菜远缘杂交存在严重的生殖障碍，F1种子的产生与杂交的组配方式有关。角果生长发育测量结果表明，远缘杂交角果生长停止是在授粉后8d左右。F1植株形态偏向母本。     

结球白菜 COR 基因克隆及序列分析

为了解结球白菜（Brassica campestris ssp ．pekinensis）COR 基因结构特征,设计1对保守简并引物,利用 RT-PCR 和普通 PCR 方法扩增 COR 基因。结果表明：获得冷诱导结球白菜 COR 基因的编码区 cDNA。该基因命名为 BpCOR,预测编码1个由142个氨基酸组成的理论分子量为14．82 kD 的蛋白。BpCOR 蛋白与十字花科其他植物 COR 蛋白高度同源,具有很高的亲水性,且预测能形成α-螺旋-环-螺旋的超二级结构。     

芜菁油菜叶肉原生质体再生植株

以芜菁油菜为材料，从无菌苗５—８天叶龄的叶片分离叶肉原生质体，然后以６×１０￣４／ｍＬ的密度用ＭＰ１－３液体培养基进行浅层培养。培养１０天后，用ＭＰ４培养基对ＭＰ１－２中的培养物进行稀释（１：１）．用ＭＰ５培养基对ＭＰ３中的培养物进行稀释（１：１），每次间隔１０天。在培养期间时常用手轻轻摇动培养物。用这种方法，再生细胞分裂并形成愈伤组织，愈伤组织经ＭＳ１培养基增殖３周，转到分化培养基上诱导植株分化，分化出的苗经诱导生根发育成完整的小植株（共５４株）．在研究中发现：①激素的种类、浓度及组合对刺激细胞分裂的作用差异明显；②提高培养基的ｐＨ值可明显地控制细胞褐化；③ＡｇＮＯ＿３（５ｍｇ／ｍＬ）有益于愈伤组织分化植株；④谷氨酰胺（８０ｍｇ／ｍＬ）和腺嘌呤（４０ｍｇ／ｍＬ）能提高愈伤组织的植株分化频率；⑤原生质体培养基对原生质体植株的分化亦有影响．