新城疫病毒F基因重组噬菌体的构建及其免疫原性

 用PCR方法扩增不含信号序列、长度为1 566 bp、编码522个氨基酸的新城疫病毒(NDV)F基因片段，将其克隆至pR质粒获得重组质粒pR-F，以此转化大肠杆菌E2，用溶菌酶缺陷噬菌体T4-Z1感染重组E2菌，F基因经同源重组整合到噬菌体基因组中，用PCR方法筛选重组噬菌体并命名为T4-Z1-F。将T4-Z1-F制备成油乳剂疫苗免疫10日龄SPF鸡，25日龄加强免疫1次。结果表明，表达F蛋白的重组噬菌体具有良好的免疫原性，可诱导免疫鸡产生特异性抗体并对NDV强毒攻击提供部分免疫保护。     

T7噬菌体尾丝蛋白随机进化文库的构建

为筛选遗传背景清晰、裂解性能优良、宿主识别谱广泛的噬菌体用于抗菌产品开发,满足畜禽减抗、无抗养殖需求,通过易错PCR技术定向改变T7噬菌体尾丝蛋白羧基末端基因序列,并构建T7噬菌体尾丝蛋白随机进化文库,为筛选识别不同宿主的T7噬菌体奠定基础。提取T7噬菌体基因组,用SfiⅠ进行单酶切,回收SfiⅠ位点左侧基因组。常规PCR扩增尾丝蛋白羧基末端基因序列(TF-ct,约350 bp)以及gene17至T7基因组右侧末端基因序列(约4 000 bp)。以回收的TF-ct片段为模板,进行易错PCR扩增,将随机突变的TF-ct基因片段连接T载体,构建质粒文库。从质粒文库中用SfiⅠ/SphⅠ双酶切出TF-ct片段,并与SfiⅠ位点左侧基因组片段、gp17右侧基因组片段进行连接,利用包装蛋白拯救出T7噬菌体尾丝蛋白随机进化文库。结果易错PCR成功扩增TF-ct基因片段,并连接T载体构建质粒文库;同时随机突变的基因正确插入T7噬菌体基因组相应位置,成功拯救出尾丝蛋白定向进化T7噬菌体文库。从噬菌体文库中随机挑选15个克隆进行序列分析,目的基因的突变率在1.23%～2.16%;尾丝蛋白loop区域的氨...     

基于CRISPR/Cas9技术构建STING基因敲除猪肺泡巨噬细胞系及其对Ⅰ型干扰素转录的影响

【目的】阐明干扰素基因刺激因子(STING)在猪抗病原微生物感染中的作用机制,为猪传染性胃肠炎、流行性腹泻和猪伪狂犬病等病毒性疾病的科学防控提供参考依据。【方法】基于CRISPR/Cas9技术,在STING基因第4、第8外显子中寻找高分靶点并设计sgRNA序列,将退火的sgRNA与酶切的LentiCRISPRv2载体用T4 DNA连接酶连接以获得LentiCRISPRv2-STING-sgRNA慢病毒载体(STING-sgRNA);以不同的STING-sgRNA慢病毒载体组合及包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共同转染293T细胞,得到含sgRNA的慢病毒再转染3D4/21细胞;经嘌呤霉素筛选和有限稀释法获得单克隆细胞株,通过PCR、测序及Western blotting鉴定STING基因的敲除效果;并采用实时荧光定量PCR验证STING基因敲除对I型干扰素表达的影响。【结果】以不同的STING-sgRNA慢病毒载体组合与HA-STING过表达载体共同转染293T细胞,均能在细胞内对STING真核表达载体产生编辑效果,且以STING-sgRNA(1+5)慢病毒载体组合的编辑效率最高。以编辑效率最高的STING-sgRNA(1+5)慢病毒载体组合及包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共同转染293T细胞包装出慢病毒,再用慢病毒感染3D4/21细胞,结果获得1株STING基因大片段(4989 bp)缺失的3D4/21细胞株,Western blotting检测未发现STING蛋白,说明STING基因敲除3D4/21细胞(3D4/21-STING-/-)构建成功。与野生型3D4/21细胞相比,在转染副猪嗜血杆菌DNA刺激下,3D4/21-STING-/-细胞中的IFN-β基因转录水平显著降低(P<0.05)。【结论】采用CRISPR/Cas9技术能成功大片段敲除3D4/21细胞中的STING基因,而导致STING基因功能丧失;STING基因敲除会导致细胞在病原微生物DNA刺激时Ⅰ型干扰素转录障碍,也提示STING基因可能是猪抗病原微生物感染的关键因子。     

NSP4基因突变的重组牛轮状病毒的拯救及其鉴定

【目的】 通过反向遗传技术结合RNAi筛选和蚀斑克隆方法,拯救出毒力减弱的轮状病毒(rotavirus, RV)。 【方法】 以野生型轮状病毒CHLY基因组RNA为模板,通过重叠PCR方法在NSP4基因93-104 nt引入5个沉默突变核苷酸,并将毒力位点区135aa、136aa和138aa对应的核苷酸进行定向突变,构建了含有突变位点的转录质粒△pT7-NSP4/89/M。将该质粒与携带RNA聚合酶基因的重组质粒pcDNA3.1/T7-RNAP共转染已接种野生型RV病毒的MA104细胞单层,继续培养24 h,获得了携带NSP4变异基因的RV病毒粒子和野生型RV病毒粒子的混合病毒。将获得的混合病毒接种MA104细胞,通过RNA干扰和蚀斑克隆方法逐步筛选纯化以获得拯救RV。 【结果】 成功拯救出了NSP4基因变异的RV,该病毒在MA104细胞上的病变和致乳鼠腹泻效果较野生型RV明显减弱。【结论】 通过反向遗传技术结合RNAi筛选和蚀斑克隆方法成功拯救出毒力减弱的RV;NSP4毒力位点135aa、136aa和138aa的变异对RV毒力改变和腹泻严重程度有影响。     

Alterations in T4 (CD4) protein and mRNA synthesis in cells infected with HIV

Cells infected with the human immunodeficiency virus (HIV) show decreased expression of the 58-kilodalton T4 (CD4) antigen on their surface. In this study, the effect of HIV infection on the synthesis of T4 messenger RNA (mRNA) and protein products was evaluated in T-cell lines. Metabolically labeled lysates from the T4+ cell line Sup-T1 were immunoprecipitated with monoclonal antibodies to T4. Compared with uninfected cells, HIV-infected Sup-T1 cells showed decreased amounts of T4 that coprecipitated with both the 120-kilodalton viral envelope and the 150-kilodalton envelope precursor molecules. In four of five HIV-producing T-cell lines studied, the steady-state levels of T4 mRNA were also reduced. Thus, the decreased T4 antigen on HIV-infected cells is due to at least three factors: reduced steady-state levels of T4-specific mRNA, reduced amounts of immunoprecipitable T4 antigen, and the complexing of available T4 antigen with viral envelope gene products. The data suggested that the T4 protein produced after infection may be complexed with viral envelope gene products within infected cells. Retroviral envelope-receptor complexes may thus participate in a general mechanism by which receptors for retroviruses are down-modulated and alterations in cellular function develop after infection.     

微生物的利用和防治实例——麦角菌、玉米黑粉菌、噬菌体T4及小麦锈病菌

 本文总结了30年来作者在应用微生物学研究中所取得的一系列进展和成就如下: 麦角菌:麦角菌能引起多种禾谷类作物的严重病害,但它能产生有药用价值的一系列麦角碱,其中麦角新碱已被广泛地应用于妇产科临床,防治妇女产后大出血。麦角的含碱量随寄主而不同,一般为0.061%～0.34%.麦角菌的栽培已在黑麦上获得成功,由拂子茅(Calamagrostis epigious)分离的菌株Claviceps purpurea,Ce-3系列栽培产生的麦角的含总碱量达0.22%～0.40%.麦角碱的人工发酵生产已于1963年突破。利用灭菌的小麦粒接种麦角菌后,培养25天后,麦角碱的含量可达0.06%,与从黑麦地里采集的野生麦角的含碱量相近。在培养基内单独或混合加入葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、硝酸铵和磷酸二氢钾可大大提高麦角碱产量。这种生产方法非常适用于条件有限的农村小工厂。麦角碱的液体深层发酵生产亦已取得成功,总碱和新碱的产量分别达到0.00936%和0.00579%.用鱼粉代替谷氨酸作氮源,总碱和新碱的产量分别增至0.0304%和0.0178%(发酵滤液)及0.160%和0.049 5%(菌丝体)。应用产碱期菌丝(idiophase mycelia)连续接种,无论在鱼粉或谷氨酸培养基中都可增加麦角碱的产量,并可使发酵周期缩短5～6天。菌落产碱动态的研究证明,产碱期菌丝在转入新鲜发酵培养基中后能继续保持旺盛的生长和较高水平的麦角碱合成能力。作者还创造了适用于快速测定发酵滤液中含碱量和菌落产碱能力的新方法。这一方法非常适用于产碱菌株的大量筛选和菌种的遗传育种研究。玉米黑粉菌玉米黑粉在发酵工业中有很大的应用潜力。它具有很高的突变率。黑色菌系形成的黑色素是酚化合物氧化的结果,加抗坏血酸可阻止黑色素的产生。作者近来证明,黑色素的产生与某些含硫氨基酸如甲硫氨酸、胱氨酸和半胱氨酸有关。作者还证明,该菌具有很强的转化酶活性和吲哚乙酸合成能力,这两者可能与该菌的致病性和瘤形成有关。四甲基秋兰姆化二硫(TMTD)对玉米黑粉菌的生长有高度抑制作用,并对受该菌侵染的玉米幼苗有明显的治疗作用。转化酶和吲哚乙酸合成抑制剂也可能在该病的化疗中有用。作者还发现玉米黑粉菌的一个黑色菌系B₅含有环状双链DNA质粒,它的周长为0.5～0.7μ,分子量1～1.4×10⁶道尔顿。电子显微镜观察证明,该质粒有不同的复制期。国际上许多实验室都对利用这种质粒建立真核生物的克隆感兴趣。噬菌体T4噬菌体T4是大肠杆菌的烈性噬菌体,大约含150个基因。作者成功地克隆了T4的两个基因:基因42(脱氧胞苷酸羟甲基化酶)和免疫基因(imm).将含胞苷的T4 DNA用EcoRI部分酶切后,用质粒pBR322作载体,克隆于大肠杆菌KH802中。用T4琥珀突变体进行标记获救斑点试验来鉴定克隆的DNA片段。从5000个克隆中得到10个含基因43(DNA多聚酶)片段,其中CC-20还带有完整的基因42和免疫基因。羟甲基化酶是分子遗传学和遗传工程中的重要工具酶,已由CC-20的培养滤液中分离到;免疫基因能提供寄主细胞对T4感染的免疫性,因而可能为发酵工业中防治噬菌体感染提供新的途径。小麦锈病作者证明氨基苯磺酸和其钠盐是小麦锈病的有效治疗剂,并已于1960年大面积推广应用。由于对氨基苯磺酸的化学结构与对氨基苯甲酸非常相似,而且后者还是叶酸结构的一部分(后两者是锈菌生长必需的维生索),是嘌呤和嘧啶合成的辅因子;对氨基苯甲酸、叶酸、嘌呤和嘧啶能抵消对氨基苯磺酸的抑菌作用,因而它的作用机制是竞争性抑制,同时还和该菌的核酸代谢有关。小麦锈菌一向被认为是绝对寄生菌,作者在人工培养基上培养小麦叶锈病菌的成功打破了这一传统的概念。感染叶锈菌的小麦叶段在人工培养基培养后,能在残废叶段上大量产生夏孢子,此夏孢子转接到人工培养基上能生长并形成菌落;同时,锈菌的菌丝还能由叶片伸入到周围培养基中,表明锈菌在合适的条件下,能进行腐生生长。     

Variable occurrence of the nrdB intron in the T-even phages suggests intron mobility

The bacteriophage T4 nrdB gene, encoding nucleoside diphosphate reductase subunit B, contains a self-splicing group I intervening sequence. The nrdB intron was shown to be absent from the genomes of the closely related T-even phages T2 and T6. Evidence for variable intron distribution was provided by autocatalytic 32P-guanosine 5'-triphosphate labeling of T-even RNAs, DNA and RNA hybridization analyses, and DNA sequencing studies. The results indicate the nonessential nature of the intron in nrdB expression and phage viability. Furthermore, they suggest that either precise intron loss from T2 and T6 or lateral intron acquisition by T4 occurred since the evolution of these phages from a common ancestor. Intron movement in the course of T-even phage divergence raises provocative questions about the origin of these self-splicing elements in prokaryotes.     

单域抗体T7噬菌体展示文库构建与鉴定

优化噬菌体展示文库构建策略,获得高品质羊驼源天然纳米抗体T7噬菌体展示文库,并对文库质量进行鉴定.分离羊驼外周血淋巴细胞,提取总RNA,RT-PCR扩增羊驼重链抗体可变区(VHH)基因,插入T7 select 415-1b噬菌体载体构建文库,计算文库的库容量,测定文库传代稳定性.测序分析VHH基因的多样性和纳米抗体氨基...     

纤维素酶产生菌的筛选及其相互作用研究

从森林落叶土、腐烂的秸秆和农家堆肥等含有木质纤维素降解菌的样品中分离到能较好降解纤维素的菌株4株,初步判定为3株细菌,1株放线菌。各菌株产酶(CMCase)较适宜的温度均是37℃,培养基初始pH值7.0,接种量(V/V)2%,接种培养12 h的种子液酶活较高。对各菌株单独与混合培养研究表明:菌株组合D6/D7、D1/D7、D6/D7/B7和D1/D6/D7/B7在72 h的酶活均显著高于其单一菌株,其中最优组合D6/D7在72 h的酶活可达67.12 U/mL,相当于其菌株单独培养酶活的2倍。     

Transmembrane molecular pump activity of Niemann-Pick C1 protein

Niemann-Pick C1 (NPC1) disease is characterized by cholesterol accumulation in lysosomes and aberrant feedback regulation of cellular cholesterol homeostasis. We provide evidence that the NPC1 protein has homology with the resistance-nodulation-division (RND) family of prokaryotic permeases and may normally function as a transmembrane efflux pump. Studies of acriflavine loading in normal and NPC1 fibroblasts indicated that NPC1 uses a proton motive force to remove accumulated acriflavine from the endosomal/lysosomal system. Expression of NPC1 in Escherichia coli (i) facilitated the transport of acriflavine across the plasma membrane, causing cytosolic accumulation, and (ii) resulted in transport of oleic acid but not cholesterol or cholesterol-oleate across the plasma membrane. These studies establish NPC1 as a eukaryotic member of the RND permease family.     

Epidermal-growth-factor-dependent transformation by a human EGF receptor proto-oncogene

The epidermal growth factor (EGF) receptor gene EGFR has been placed in a retrovirus vector to examine the growth properties of cells that experimentally overproduce a full-length EGF receptor. NIH 3T3 cells transfected with the viral DNA or infected with the corresponding rescued retrovirus developed a fully transformed phenotype in vitro that required both functional EGFR expression and the presence of EGF in the growth medium. Cells expressing 4 x 10(5) EGF receptors formed tumors in nude mice, while control cells did not. Therefore, the EGFR retrovirus, which had a titer on NIH 3T3 cells that was greater than 10(7) focus-forming units per milliliter, can efficiently transfer and express this gene, and increased numbers of EGF receptors can contribute to the transformed phenotype.     

二花脸猪Smad4基因的克隆与卵巢组织mRNA的表达水平

[目的]了解二花脸猪Smad4(common-mediator Sma4)基因的序列特征和组织表达特征,分析二花脸猪与商品猪卵巢组织中Smad4基因mRNA表达水平的差异.[方法]采用克隆测序技术获得二花脸猪Smad4基因cDNA序列,利用生物信息学方法分析二花脸猪Smad4基因的序列特征和蛋白的理化性质、高级结构,RT-PCR检测其组织表达特征,并采用real-time PCR技术检测二花脸猪与商品猪卵巢组织中Smad4基因mRNA的表达水平.[结果]二花脸猪Smad4基因编码区序列全长1 659 bp,编码一个含有5 52个氨基酸残基的蛋白质,氨基酸序列与其它哺乳动物的同源性均在98％以上;二花脸猪Smad4也包括3个典型的结构域(MH1、SAD和MH2).二花脸猪Smad4基因在所检测的组织中均有表达,且卵巢组织中mRNA的表达水平极显著高于商品猪(P＜0.01).[结论]二花脸猪Smad4基因可能拥有其它哺乳动物Smad4基因相同的功能及其可能与猪高繁殖力间有一定相关.     

猕猴桃溃疡病菌噬菌体的初步研究

以丁香假单胞菌猕猴桃致病变种为指示菌,从猕猴桃溃疡病病枝中分离到一株噬菌体,对该噬菌体进行了热稳定性、pH值稳定性、紫外线稳定性、最佳感染复数、一步生长曲线等生物学特性的测定。结果表明:噬菌体的热稳定性较弱,在65℃下10 min内即可全部失活;在pH值4~9的范围内噬菌体均可稳定存在;紫外线下照射12 min,噬菌体几乎全部失活;噬菌体的最佳感染复数为0.1;感染指示菌的潜伏期约60 min,爆发期约70 min,烈解量为123。这是首次关于猕猴桃溃疡病菌噬菌体的报道。     

朱砂叶螨谷氨酸门控氯离子通道GluCl1基因的克隆与序列特征分析

朱砂叶螨是一种分布广泛、危害极大、难以防治和易产生抗性的农业害螨。为了研究朱砂叶螨杀螨剂神经靶标谷氨酸门控氯离子通道,进一步确定阿维菌素对朱砂叶螨的抗性机理,采用同源基因克隆以及RACE技术,克隆朱砂叶螨杀螨剂靶标谷氨酸门控氯离子通道(GluCl1)基因全长,分析其序列特征。结果表明,GluCl1基因序列全长为1856 bp,其中开放阅读框(ORF)为1338 bp,编码455个氨基酸,N端含25个氨基酸的信号肽,有4个跨膜结构域,GenBank登陆号为KC543353。同源比对分析表明,朱砂叶螨与其他蜱螨目GluCl基因有高度的同源性,特别与二斑叶螨的相似度最高。研究还发现朱砂叶螨敏感品系GluCl1第3个跨膜区的G314,与二斑叶螨敏感品系相应位点的氨基酸G323一致,而二斑叶螨抗性品系相应位点突变为D323。本研究进一步证实了G323突变为D323和二斑叶螨对阿维菌素产生抗性有关。本研究为今后建立以朱砂叶螨谷氨酸门控氯离子通道为靶点的选择性杀螨剂体外筛选体系奠定坚实基础。     

拟南芥bZIP23基因过量表达载体的构建及过表达植株的筛选

[目的]以拟南芥为材料克隆bZIP23基因,构建bZIP23基因的过量表达载体和筛选过表达植株,为验证其功能奠定基础.[方法]提取拟南芥总RNA和RT-PCR克隆bZIP23基因,用限制性内切酶切割和T4 DNA连接酶连接,使bZIP23基因连接到35S强启动子的pART27载体上;将连接产物转化到Trans1-T1感受态细胞中,筛选阳性单克隆进行菌落PCR鉴定并测序验证,获得重组质粒.将该重组质粒电激转化至根瘤农杆菌GV3101菌株,浸花法转化拟南芥野生型植株.[结果]通过单菌落PCR鉴定和DNA测序结果显示,bZIP23基因与35S过量表达载体已连接,获得了重组载体;抗性筛选与遗传鉴定获得相应的转基因过量表达阳性植株.[结论]构建的过量表达载体及筛选得到的过量表达植株为验证bZIP23基因功能奠定了基础.     

感染传染性法氏囊病毒雏鸡的免疫抑制及其机理

本实验共用412只滨白雏鸡,分别在1日龄或4周龄时感染 IBDV,检测了雏鸡感染后其外周血液、泪液、气管液、肠液、胆汁中 IgG,IgM 和 IgA 含量、血液 T 细胞免疫功能和脾脏 B 细胞抗体生成功能、血液 T,B 细胞、淋肥细胞数量以及法氏囊、胸腺、脾脏、盲肠扁桃体、丕氏斑、十二指肠、哈德尔腺、支气管粘膜中浆细胞和酸性α-萘酚酯酶阳性 T 细胞(ANAE+T)数量的动态变化,结果如下:(1)雏鸡感染 IBDV 后,法氏囊、脾脏的浆细胞明显减少,脾脏 B 细胞抗体生成功能降低;胸腺、法氏囊、脾脏的 ANAE+T 细胞数量显著下降,说明感染鸡免疫器官的体液免疫功能和细胞免疫功能显著减弱.(2)IBDV 感染雏鸡引起呼吸道和消化道局部免疫组织一哈德尔腺、支气管粘膜、盲肠扁桃体、十二指肠粘膜固有层,丕氏斑的浆细胞和 ANAE+T 细胞较对照鸡显著减少;泪液、气管液、胆汁、肠液中 IgG,IgA,IgM 含量明显下降,表明感染鸡呼吸道和消化道局部的细胞免疫和体液免疫水平均显著降低.(3)感染鸡外周血液 T,B 细胞数量减少,T 细胞功能降低,IgG,IgA,IgM 含量明显下降,表明和标志全身体液免疫和细胞免疫水平降低,是免疫器官细胞免疫和体液免疫功能显著降低的反映和表现.(4)1日龄雏鸡感染 IBDV 后,B 细胞功能抑制时间明显长于 T 细胞,证明感染鸡 B 细胞功能的损害重于 T 细胞.(5)4周龄雏鸡感染 IBDV 引起的免疫抑制程度低于1日龄感染鸡,呈现一定的感染日龄差异.     

The reservoir for HIV-1 in human peripheral blood is a T cell that maintains expression of CD4

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) selectively infects cells expressing the CD4 molecule, resulting in substantial quantitative and qualitative defects in CD4+ T lymphocyte function in patients with acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). However, only a very small number of cells in the peripheral blood of HIV-1-infected individuals are expressing virus at any given time. Previous studies have demonstrated that in vitro infection of CD4+ T cells with HIV-1 results in downregulation of CD4 expression such that CD4 protein is no longer detectable on the surface of the infected cells. In the present study, highly purified subpopulations of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from AIDS patients were obtained and purified by fluorescence-automated cell sorting. They were examined with the methodologies of virus isolation by limiting dilution analysis, in situ hybridization, immunofluorescence, and gene amplification. Within PBMCs, HIV-1 was expressed in vivo predominantly in the T cell subpopulation which, in contrast to the in vitro observations, continued to express CD4. The precursor frequency of these HIV-1-expressing cells was about 1/1000 CD4+ T cells. The CD4+ T cell population contained HIV-1 DNA in all HIV-1-infected individuals studied and the frequency in AIDS patients was at least 1/100 cells. This high level of infection may be the primary cause for the progressive decline in number and function of CD4+ T cells in patients with AIDS.     

弯杆菌噬菌体的分离及其转导试验

从溶原性胎儿弯杆菌性病亚种(Campylobacter fetus subspVenerealis)分得了一株温和型噬菌体,证明具有转导抗生素(头胞金素和链霉素)抗性决定簇至敏感受体细菌的能力,其中转导头胞金素的试验结果为首次报道。该噬菌体在敏感细菌生长的半固体倾注培养物上形成混浊的蚀斑,其平均直径约为0.5毫米。在电子显微镜下,噬菌体的头部呈多角形,尾纤细,其长度约为其头部的4—5倍。